一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针的制作方法

本发明涉及一种用于检测细胞内半胱氨酸的新型荧光探针，属于分析化学技术领域。

背景技术：

半胱氨酸（Cys）是一种生物体内常见的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团巯基的氨基酸。半胱氨酸除主要分布在肝、脾、肾中外，还大量积聚在人体表面包括皮肤、粘膜等，在生物体内具有强化生物体自身的防卫能力、调整生物体的防御机构生理功能。例如具有抱合作用，实验证明半胱氨酸对甲醛、氯仿、铅、镉、氯甲汞、河豚毒等有毒物质具有一定的解毒作用，并可以有效地预防和治疗放射性伤害。半胱氨酸可在皮肤蛋白的角蛋白生成中维持重要的琉基酶的活性，维持皮肤的正常代谢，以及调节表皮最下层的色素细胞生成的底层黑色素。此外，半胱氨酸可改善炎症、过敏引起的琉基酶活性降低，减缓炎症和过敏的皮肤症状，并具有防止生物体衰老的功能。但是，生物体内半胱氨酸浓度异常时，经常会导致造血功能下降、生长缓慢等。血浆中的半胱氨酸含量较高时，会损害内皮细胞和诱导血管损伤。因此，检测生物体内的半胱氨酸含量具有很重要的意义。

相比于传统的电化学方法，荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，并且对生物样品基本没有损伤，已广泛用于各种生物体内的小分子检测。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，能够实时快速检测生物体内半胱氨酸的荧光探针具有重要的意义。

技术实现要素：

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种新型检测细胞内半胱氨酸的荧光探针。

本发明提供的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针为罗丹明衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式（ ）所示，其中丙烯酸酯部分为半胱氨酸的响应位点：

式（）

本发明所述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针的制备方法为：将式（Ⅱ）所示的化合物 (1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL) 加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到深红色的产物即为本发明所述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针。

式（Ⅱ）

本发明所述的荧光探针可应用于细胞内半胱氨酸的检测评价。该探针作为细胞内半胱氨酸的特异性探针，在半胱氨酸存在的环境下，可以将丙烯酸酯水解为羟基，生成具有高荧光发射能力的荧光物质，通过检测不同的荧光强度来测定细胞内的半胱氨酸。

具体测定方法为：室温条件下，配制5 μM荧光探针乙醇溶液，加入到具有不同浓度的半胱氨酸溶液系中，测定溶液荧光强度作为半胱氨酸浓度的评价指标。

本发明所述的荧光探针在半胱氨酸存在的条件下，罗丹明衍生物染料部分的丙烯酸酯水解为羟基，此时荧光探针可以发射罗丹明衍生物染料的红色荧光（峰值约为630 nm）。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为580 nm，在590~700 nm之间进行荧光发射光谱的检测。

荧光探针在生物成像应用研究的主要内容有探针对活细胞的毒性、染色能力、活细胞和活组织荧光成像。采用MTT比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论荧光探针对细胞的毒性。在此基础上，应用本发明所述的荧光探针对活细胞内的半胱氨酸进行快速检测。

本发明的有益效果为：

本发明所述的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。

本发明所述的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针具有高特异性，在进行相应半胱氨酸检测过程中基本不受其他组分的干扰，可用于活细胞内半胱氨酸的实时测定，具有广阔的应用前景。

本发明所述的检测细胞内半胱氨酸的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（590~700 nm），可以实现对细胞中的半胱氨酸快速准确检测的目的。

附图说明

图1是荧光探针的¹H NMR图谱。

图2是荧光探针在不同浓度半胱氨酸条件下的荧光光谱。

图3是荧光探针与半胱氨酸浓度的线性关系数据。

图4是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱。

图5是荧光探针在活细胞中的成像应用。

A图：只加10 μM探针的细胞明场照片；B图：只加10 μM探针的细胞红色通道荧光照片；C图：A图和B图的叠加照片；D图：加入10 μM探针和50 μM半胱氨酸的细胞明场照片；E图：加入10 μM探针和1 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）的细胞红色通道荧光照片；F图：D图和E图的叠加照片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护内容不仅限于此。

实施例1

本发明所述检测癌细胞内半胱氨酸的荧光探针的制备

将式（Ⅱ）所示的化合物（1 mmol）、(1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL) 加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，冷却至室温，加入到水中，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析(二氯甲烷:甲醇 = 15:1 ) 纯化，得到深红色产物，即为本发明所述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针，产率43%。

上述检测细胞内半胱氨酸的荧光探针的¹H NMR图谱见图1。

实施例2

本发明所述荧光探针在不同半胱氨酸浓度下的荧光光谱

采用半胱氨酸在水溶液中供应半胱氨酸。预先准备10份5mL的 5 μM探针缓冲溶液，含5%甲醇，所加入的半胱氨酸浓度为0到150 μM。然后进行荧光检测（λ_Ex = 580 nm）；计算各体系中荧光强度；通过分析630 nm处的荧光强度与半胱氨酸浓度的关系，评估该探针对半胱氨酸的响应性能（见图2和图3）。图2表明，随着半胱氨酸浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强。图3表明，当硫化钠浓度在40~200 μM范围内，溶液的荧光强度和半胱氨酸的浓度呈较好的线性关系，可采用公式Y = 23.7 * X – 95.1表示，其中Y为630 nm出的荧光强度，X为半胱氨酸的浓度。

实施例3

荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱

预先准备10份5mL的 5 μM探针缓冲溶液(含5%甲醇，pH = 7.4)，然后分别向该体系中依次加入50 μL浓度为200 μM的Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、NO、H₂O₂、HClO₄、Cys、GSH、NaNO₂、VC等小分子的PBS溶液。然后进行荧光检测（λ_Ex= 580 nm）；计算各体系中荧光强度；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性（见图4）。从图中看出，当然探针溶液中加入Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、NO、H₂O₂、HClO₄、GSH、NaNO₂、VC等小分子时，只有半胱氨酸可以导致溶液产生显著的荧光，而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化，这表示该探针只对半胱氨酸有响应，而基本不受其他小分子的干扰。

实施例4

荧光探针在活细胞中的成像应用

将Hela细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎牛血清)中，放置于条件为37℃、5% CO₂和20% O₂的培养箱中培养24 -48h。用微量进样器吸取本发明所述荧光探针(10 μM)注入含有Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。加入1 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）溶液，继续培养30 min。之后用PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞3次，进行荧光成像。

结果见图5。从A、B和C图中看出，只加入探针时，细胞有红色荧光；从D、E和F图中看出， 1 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）之后，再加入10 μM探针，细胞无明显的荧光产生，这表示该探针可用于检测癌细胞中的半胱氨酸。