一株具有分泌IAA能力的内生细菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株具有分泌IAA能力的内生细菌。

背景技术：

内生细菌是促进植物生长发育最大的潜在微生物资源，目前，对植物根内生细菌促生作用研究较多的是分泌植物激素的能力，主要包括分泌吲哚-3-乙酸(Indole-3-Acetic Acid，简称IAA)、赤霉素(Gibberelin，主要指GA₁、GA₃)和细胞分裂素(Cytokinin，CTK)等，其中，IAA是最早发现的也是最常见的促进植物生长的激素之一，属于天然植物生长素的活性成分，目前研究较为深入。研究表明，在大豆根际中存在21％的细菌可以分泌IAA，而在根部可分泌IAA的内生细菌比例高达34％。在玉米、甘蔗、油菜和其他作物的根部，也存在大量具有分泌IAA潜力的内生细菌。东北黑土区是我国重要的商品粮生产基地，其主要生态特点是冬季气温低、时间长，夏季作物生长期雨热同季。鉴于黑土区独特的生态特点，许多非本土的微生物资源促生效果受到限制。因此，开展黑土区作物内生细菌群落结构研究，筛选适合东北地区的微生物菌种资源十分必要。

技术实现要素：

本发明提供了一株具有分泌IAA能力的内生细菌及其应用。

本发明的一株具有分泌IAA能力的内生细菌，它为Lysinibacillus endophyticus C9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年10月26日，保藏号CGMCC No.1.15291。

该菌株应用于促进植物生长发育。

本发明的一株具有分泌IAA能力的内生细菌为赖氨酸芽孢杆菌属新种(Lysinibacillus.Endophyticus sp.nov.)，其英文命名描述如下：Lysinibacillus endophyticus(en.do.phy’ti.cus.Gr.pref.endo within；Gr.n.phyt plant.N.L.adj.endophyticus within plant,pertaining to the isolation from plant tissues)。

本发明的一株具有分泌IAA能力的内生细菌它为Lysinibacillus endophyticus C9，即下面所述的菌株C9^T。特征描述如下：

菌株C9^T革兰氏染色阳性，菌体成杆状，好氧，球状芽孢，有周生鞭毛；在TSA培养基上30℃培养2d，菌落呈圆形，中间稍凸起，表面光滑，不透明，浅黄色；菌落在NA和LA培养基上生长良好。菌株C9^T的生长温度范围为20-50℃，最适生长温度为30℃；在0-4.5％(w/v)的NaCl范围内生长；pH生长范围为5-8，最适生长pH为7.0。检测呈阳性反应包括：氧化酶、过氧化氢酶、硝酸盐还原、产H₂S、产吲哚乙酸、Tween 40、Tween 60和明胶液化；检测呈阴性反应包括：亚硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、Voges-Proskauer试验、七叶树素水解、酪蛋白水解、淀粉水解、纤维素水解、脲酶水解、Tween 20和Tween 80。在API 50CHB试剂条上无糖发酵现象产生。利用API ZYM试剂条检测酶活呈阳性的包括：酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶；呈阴性的项目包括：碱性磷酸盐酶、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甙酶和β-岩藻糖甙酶。脂肪酸组成主要包括(＞10％)：iso-C_15:0，anteiso-C_15:0和anteiso-C_17:0；呼吸醌只为MK-7；磷酸类脂组成包括双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、2种未鉴定结构磷脂(PL)和一种未鉴定的极性脂；细胞含内消旋-二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid,meso-Dpm)为特征的氨基酸；G+C含量为37.9mol％。

菌株C9^T属于赖氨酸芽孢杆菌属的一个新种，命名为Lysinibacillus endophyticus，典型菌株为C9^T，在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC 1.15291)保藏。GenBank/EMBL/DDBJ数据库登录号为KP334990。

本发明包含以下有益效果：

本发明采用可培养方法，根据菌落颜色、形态、大小和生长时间等特征，在1/10NA上分离获得内生细菌菌株，利用改良Salkowski比色法测定内生细菌分泌IAA能力，获得具有促生能力菌株，选取分泌IAA能力＞10mg·mL^-1菌株进行16S rRNA基因鉴定、系统发育分析和多相分类学鉴定。

得到内生细菌菌株C9^T分泌生长素能力为10.2μg·mL^-1。对C9^T进一步进行促生能力评价的结果表明该菌对大豆和小麦幼苗生长均具有促生作用，表现为提高大豆株高3.6％，地下根表面积23.6％，地下根体积14.9％；提高小麦株高7.3％，地下根表面积88.9％，地下根体积120.5％。

附图说明

图1为菌株C9^T于30℃在TSA培养基上培养2d的菌落形态图：

图2为菌株C9^T于30℃在TSA培养基上培养2d的透射电镜图；

图3为菌株C9^T的磷酸类脂薄层层析分析图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一株具有分泌IAA能力的内生细菌，它为Lysinibacillus endophyticus C9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年10月26日，保藏号CGMCC No.1.15291。

本实施方式的具有分泌IAA能力的内生细菌Lysinibacillus endophyticus C9获取方式如下：

将1g表面彻底灭菌的玉米根部样品(Zea mays cv.新垦5号)剪成1-2cm小段，于无菌研钵中充分研磨，研磨过程可加入少量灭菌的石英砂和无菌水，然后用无菌水依次稀释成浓度为10^-1、10^-2和10^-3的菌悬液；再分别取1mL上述稀释的菌悬液涂布于1/10NA平板上，每个稀释度3次重复，30℃培养7d；选取3次重复中菌落数较多的平板，根据形态、颜色、菌落大小等特征，挑取不同菌株，在NA平板上分离纯化，将纯化后的根内生细菌接种NA斜面培养基，4℃保藏。

1、对上述筛选后保藏的菌株进行16S rRNA基因序列鉴定：

选择分泌IAA能力＞10mg·mL^-1菌株为鉴定对象，采用菌落PCR鉴定方法，用接种环挑取待鉴定内生细菌斜面保存菌株于15μL无菌水中，12000rpm离心5min，弃上清，再用15μL无菌水悬浮，重复一次，95℃水浴5min，置于冰上，以处理后菌悬液为PCR鉴定模板，用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACT T-3')扩增得到目的基因片段。

PCR反应体系采用10μL体系，体系如下：27F和1492R引物(50pmol)各0.1μL，待测菌悬液0.3μL，dNTP(2.5mM TaKaRa)1μL，rTaq buffer(TaKaRa)1μL，rTaq聚合酶(5U·μL^-1，TaKaRa)0.3μL，无菌水7.2μL，以不加菌悬液为对照。

扩增条件为：94℃3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min(28个循环)，72℃5min。每个样品3次重复。

经琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒(QIAEXⅡ Gel Extraction Kit(150)QIAGEN)纯化PCR产物后，与pMD18-T Vector连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，LB平板37℃培养16-17h后，用含X-gal平板筛选含有插入DNA片段的白色转化子，用灭菌牙签挑白色单菌落于15μL无菌水中为克隆鉴定模板，以大肠杆菌质粒引物M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和RV-M(5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)为鉴定引物，扩增条件同上，鉴定为阳性克隆后，送测序公司双向测序。

其中对菌株C9^T进行的16S rRNA基因测序，得到长度为1510bp的基因序列，将序列提交到GenBank数据库，登录号为KP334990。再将得到的序列应用EzBioCloud网站与已发表的典型菌株进行在线分析，其同源性最高的菌株为Lysinibacillus chungkukjangi NBRC 108948^T(相似度为98.1％)和Lysinibacillus sinduriensis DSM 27595^T(相似度为98.0％)，其余典型菌株的相似度均＜98.0％。采用邻位连接法将菌株C9^T与同源性比对＞95％的典型菌株构建系统发育树，显示菌株C9^T与赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)的各成员聚在一起，采用最大简约法和最大似然法构建的系统发育树获得相同的拓扑结构，因此，该菌可能是赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)的一个新种。

2、分子学分析

2.1(G+C)mol％测定

采用熔解温度(Tm)法测定(G+C)mol％含量，测定E.coli JM109和菌株C9^T的Tm值分别为77.8℃和71.9℃，根据公式计算得到菌株C9^T的G+C含量为37.9mol％。

2.2菌株C9^T与相似菌株DNA同源性分析

在系统分类学上最相近的2株菌L.chungkukjangi NBRC 108948^T和L.sinduriensis DSM 27595^T与菌株C9^T的16S rRNA基因相似性＞98％，为了进一步区分，进行菌株C9^T与2株相似菌的DNA-DNA杂交试验，杂交结果显示菌株C9^T与L.chungkukjangi NBRC 108948^T和L.sinduriensis DSM 27595^T同源性分别为52.0±0.7％和46.1±1.1％，均＜70％。

通过16S rRNA基因比对，形态学观察和生理生化等特征分析，菌株属于赖氨酸芽孢杆菌属，并在菌落形态、化学分类特征等方面与该属其他典型菌株存在差异(表1)，且与2株相似典型菌株的DNA同源性均低于70％，因此，确定确定菌株C9^T属于赖氨酸芽孢杆菌属的一个新种，命名为Lysinibacillus endophyticus，典型菌株为C9^T，并将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年10月26日，保藏号CGMCC No.1.15291。

所述的C9^T菌株形态学观察主要包括培养特征观察、光学显微镜观察和透射电镜观察。

菌株C9^T革兰氏染色阳性；菌体成杆状，长约1.1-1.4μm，宽约0.5-0.8μm；好氧；球状芽孢；有周生鞭毛；在TSA培养基上30℃培养2d，菌落呈圆形，中间稍凸起，表面光滑，不透明，浅黄色(如图1和图2)。菌落在NA和LA培养基上生长良好。

C9^T菌株生理生化特征：菌株C9^T的生长温度范围为20-50℃，最适生长温度为30℃；pH生长范围为5-8，最适生长pH为7.0；在0-4.5％(w/v)的NaCl范围内生长。菌株C9^T氧化酶、过氧化氢酶、硝酸盐还原、产H₂S、产吲哚乙酸、Tween 40、Tween 60和明胶液化检测呈阳性；亚硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、Voges-Proskauer试验、七叶树素水解、酪蛋白水解、淀粉水解、纤维素水解、脲酶水解、Tween 20和Tween 80活性检测为阴性。菌株C9^T在API 50CHB试剂条上无糖发酵现象产生。利用API ZYM试剂条检测酶活呈阳性的包括：酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶；呈阴性的项目包括：碱性磷酸盐酶、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甙酶和β-岩藻糖甙酶。

表1菌株C9^T与相似菌株的不同表现特征

注：+，阳性；－，阴性。

对本实施方式筛选得到的进行细胞化学组分分析：

1)全细胞脂肪酸组分析：

菌株C9^T的脂肪酸组成主要包括iso-C_15:0(34.7％)，anteiso-C_15:0(33.6％)，anteiso-C_17:0(10.6％)，iso-C_16:0(6.0％)，C_16:1ω7c alcohol(4.2％)，iso-C_14:0(2.3％)，iso-C_17:0(2.1％)，C_16:1ω11c(2.0％)和summed feature 4(1.8％)，主要脂肪酸成分(＞10％)与Lysinibacillus属内近缘菌株相似，比较见表2。

表2菌株C9^T与Lysinibacillus属内近缘菌株全细胞脂肪酸含量组成比较

注：“-”表示＜1％或未被检测到。

2)呼吸醌类型：

菌株C9^T细胞主要呼吸醌为MK-7。

3)细胞壁氨基酸类型和全细胞水解液糖型：

菌株C9^T的细胞含内消旋-二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid,meso-Dpm)为特征的氨基酸。目前，发现的meso-Dpm的肽聚糖类型为A1γ和3种变型的A4γ(A31.1，A31.2和A31.3，www.peptidoglycantypes.info)，而变型的A4γ仅在Brachybacterium，Devriesea和Dermabacter属中被发现，而菌株C9^T与Lysinibacillus亲缘关系最近，所以，其细胞壁氨基酸类型可能为A1γ，鉴定结果区别于Lysinibacillus属的其他典型菌株。

全细胞水解液糖型主要为核糖、葡萄糖和半乳糖。

4.3.4磷酸类脂分析：

菌株C9^T的磷酸类脂组成包括双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、2种未鉴定结构磷脂(PL)和一种未鉴定的极性脂(图3)。

对本实施方式的内生细菌菌株C9^T分泌IAA能力测定：采用改良Salkowski比色法测定获得的内生细菌菌株分泌IAA能力。先用接种环挑取斜面保存分离菌株于40μL无菌水中，涡旋混匀，即为待测菌株菌悬液，取待测菌悬液10μL于含色氨酸NA液体培养基1.5mL的离心管中(100mg·mL^-1色氨酸)，每个离心管含有1mL培养基，每菌株重复3次，取1mL无菌水加入色氨酸NA液体培养基中为对照，置于30℃摇床，180rpm振荡培养7d。培养后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液100μL加入酶标板中，再加入200μL Salkowski比色液，避光静置反应35min，采用双波长测定法(OD₄₉₀/OD₆₄₀)测定其OD₄₉₀值。利用吸光值线性公式换算各菌株IAA浓度含量。得到内生细菌菌株C9^T分泌生长素能力为10.2μg·mL^-1。对内生细菌菌株C9^T进一步进行促生能力评价的结果表明该菌对大豆和小麦幼苗生长均具有促生作用，表现为提高大豆株高3.6％，地下根表面积23.6％，地下根体积14.9％；提高小麦株高7.3％，地下根表面积88.9％，地下根体积120.5％。

序列表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>一株具有分泌IAA能力的内生细菌及其应用

<160>4

<210>1

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>27F引物。

<400> 1

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 20

<210>2

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1492R引物。

<400> 2

GGCTACCTTGTTACGACTT 19

<210>3

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M13-47引物。

<400> 3

CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 24

<210>4

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RV-M引物。

<400> 4

GAGCGGATAACA ATTTCACACAGG 24