一种复合风味菌剂及其制备方法和在酱油增香中的直投式应用与流程

本发明属于食品发酵领域，具体涉及一种复合风味菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

酱油是我国的传统调味品，是在各类微生物分泌的酶的作用下，通过一系列生化反应，形成的具有氨基酸等营养成分以及独特酱香风味的产品。酱油酿造过程中，所用的相关微生物及其酶系作用对于酱油品质的好坏具有决定性作用。目前我国酱油主要的发酵微生物是米曲霉，但随着酱油工业化的发展，单一菌种发酵已经无法生产出风味浓郁的产品，因此酱油发酵微生物菌种的筛选及应用成为了提升酱油发酵技术的主要途径之一。

现代酱油发酵多采用高盐稀态发酵工艺及封闭式的发酵设备，相较传统、开放的工艺来说，可以有效地防止发酵过程中杂菌的污染，但也失去了部分自然接种带来的对酱油发酵风味有贡献的微生物。目前酱油发酵中添加的风味菌主要有酵母菌、乳酸菌等，其添加工艺比较随意，难以发挥最优的效果；有些风味菌需经自行扩培后添加，由于风味菌必须具备高耐盐性，这使其扩培工艺复杂，掌握不好往往还会出现菌量不达标，严重影响添加效果。因此，选育酱油风味菌，并根据其对风味的提升作用研发生产直投式混配型酱油风味菌剂，是增进酿造酱油风味、提升酿造酱油品质、简化混合菌种发酵工艺的有效途径，这也是目前酱油混合菌种发酵工艺中的空白。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种复合风味菌剂及其制备方法和在酱油增香中的直投式应用，应用后可以显著提高酱油中的氨基酸态氮、挥发性风味成分含量，使酱油酱香浓郁、品质优良，且应用方式简单方便。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种复合风味菌剂，所述复合风味菌剂主要由耐盐枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌粉和耐盐球拟酵母(Torulopsis halophilus)菌粉按1:1～1.4的质量比混合配制而成。

上述的复合风味菌剂，优选的，所述枯草芽孢杆菌菌粉是由保藏编号为CCTCC NO：M2015791的枯草芽孢杆菌菌株制成，该枯草芽孢杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其命名为枯草芽孢杆菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015791。该枯草芽孢杆菌CS1.03的保藏日期为2015年12月29日，保藏单位的地址位于中国湖北武汉市武汉大学校内。

上述优选的枯草芽孢杆菌CS1.03是从传统的高盐稀态发酵(晒露法)酱醪中分离筛选出一株独特的优势菌。该枯草芽孢杆菌CS1.03的鉴定过程包括：对枯草芽孢杆菌CS1.03进行16S rDNA序列鉴定分析，结合形态学鉴定、生理生化试验，鉴定此菌株为枯草芽孢杆菌种。

经过我们的检测分析，本发明的上述枯草芽孢杆菌CS1.03可以产高酶活的淀粉酶、蛋白酶、几丁质酶以及乳酸等有机酸。我们创造性地将此菌株添加于酱油发酵中，发现可以有效改善发酵酱油的品质问题，从而达到提升产品品质、提高氨基氮含量及丰富酱油风味的效果。

上述的复合风味菌剂中，优选的，所述耐盐球拟酵母菌粉是由购于安琪酵母股份有限公司的耐盐球拟酵母S4为原料制成。

在上述本发明的技术方案中，优选的枯草芽孢杆菌CS1.03可以产高酶活的淀粉酶、蛋白酶，因此在酱油发酵前期中能够促进原料中蛋白质及淀粉的降解，除降解蛋白质产生具有风味能力的氨基酸外，还能降解淀粉产生大量的还原糖以及有机酸、酮类、酚类等物质，还原糖及氨基酸在酱油发酵过程中能产生羰氨反应，生成酱油的风味成分及色泽。而我们特别配选的耐盐球拟酵母S4具有良好的产乙醇能力及酯化能力，其发酵产物乙醇能在耐盐球拟酵母S4的进一步作用下与枯草芽孢杆菌CS1.03产生的有机酸很好的酯化形成具有浓郁香味的酯类物质。同时枯草芽孢杆菌CS1.03及耐盐球拟酵母S4对4-乙基愈创木酚等酱油特征风味物质的形成均有十分重要的贡献。我们经过反复筛选、对比和试验，发现这两种菌株的复配具有协同作用，同时添加这两种菌株发酵能够明显地提升酱油品质。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的复合风味菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将耐盐枯草芽孢杆菌和耐盐球拟酵母进行菌体高盐高密度扩大培养，得到高浓度的耐盐枯草芽孢杆菌菌液和耐盐球拟酵母菌液；

(2)在步骤(1)所得的耐盐枯草芽孢杆菌菌液和耐盐球拟酵母菌液中分别加入保护剂；

(3)将步骤(2)所得的耐盐枯草芽孢杆菌菌液和耐盐球拟酵母菌液进行喷雾干燥，得到耐盐枯草芽孢杆菌菌粉和耐盐球拟酵母菌粉；

(4)将步骤(3)所得的耐盐枯草芽孢杆菌菌粉和耐盐球拟酵母菌粉按质量比混合后，得到复合风味菌剂。

上述的制备方法，优选的：所述步骤(1)中，耐盐枯草芽孢杆菌菌液的具体制备包括：接种4％～5％对数期的所述耐盐枯草芽孢杆菌至一枯草芽孢杆菌高盐高密度扩培培养基中，在35℃～38℃下震荡培养(优选100-300r/min)50～56h，直至培养液中菌体浓度达到1.4～2.5×10⁹CFU/mL；

所述枯草芽孢杆菌高盐高密度扩培培养基包含以下质量分数的组分：0.3％～0.4％牛肉膏、0.8％～1％蛋白胨、0.1％～0.2％蔗糖、0.2％～0.5％磷酸氢二钾、0.05％～0.1％硫酸镁和18％～20％氯化钠，pH6.8～7.0。

上述的制备方法，优选的：所述步骤(1)中，耐盐球拟酵母菌液的具体制备包括：接种4％～5％对数期的所述耐盐球拟酵母至一耐盐球拟酵母高盐高密度扩培培养基中，在26℃～30℃下震荡培养(优选100-300r/min)48～55h，直至培养液中菌体浓度达到2.0～2.8×10⁹CFU/mL；

所述耐盐球拟酵母高盐高密度扩培培养基包含以下质量分数的组分：4％～4.5％葡萄糖、1.5％～2％玉米浆、1％～1.5％酵母膏、0.2％～0.5％磷酸氢二钾、0.05％～0.1％硫酸镁和18％～20％氯化钠，pH6.5～7.0。

上述的制备方法，优选的：所述步骤(2)中，所述保护剂包含脱脂奶粉、β-环糊精、低聚果糖和甘油：且前述四种组分在菌液中的添加量以质量分数计分别为4.5％～5％、4.5％～5％、3.5％～4％和1.5％～2％。

上述的制备方法，优选的：所述步骤(3)中，喷雾干燥的具体工艺条件包括：进口温度120℃～130℃，入料流量15mL/min，压力0.2MPa，热风流量30M³/h，出口温度65℃～78℃。

上述的制备方法，优选的：所述步骤(3)中，经喷雾干燥后得到的耐盐枯草芽孢杆菌菌粉中的活菌数为1.1～1.5×10⁹CFU/g，所述耐盐球拟酵母菌粉的活菌数为1.2～1.5×10⁹CFU/g。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述本发明的复合风味菌剂在酱油增香中的应用，应用时无需对复合风味菌剂进行活化，直接投入到酱油发酵液中使用。具体优选的，该复合风味菌剂是在高盐稀态法酱油发酵的1/3期加入，添加量为1.0～1.5g/Kg原料，无需活化，直接加入酱醪中搅拌均匀发酵。

在上述本发明的应用中，我们通过对添加复合菌剂发酵的酱油和普通发酵酱油进行氨基酸态氮含量测定以及感官评定和电子鼻分析，结果表明添加本发明复合菌剂发酵后的酱油氨基酸态氮含量、感官评分以及酱香风味物质均高于普通酱油，尤其是酱油风味有了十分明显的提升。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明的复合风味菌剂中的活菌数量多，无需活化，可直接在酱油发酵中使用，省去了添加菌种发酵的扩大培养环节，使用简单方便。

(2)本发明将风味菌制作成复合菌剂后，还能有效防止菌种老化、退化，有利于保持风味菌的活力。

(3)使用本发明的复合风味菌剂后，能明显提高发酵酱油中氨基酸态氮、风味物质等含量，提升酱油品质，改进高盐稀态工艺中菌种单一带来的风味不足的缺点，也易于控制生产工艺，保证产品品质稳定。

生物材料保藏情况说明

本发明涉及的保藏生物材料为一株枯草芽孢杆菌菌株，该枯草芽孢杆菌菌株被命名为枯草芽孢杆菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015791，保藏单位的地址位于中国湖北武汉市武汉大学校内。该枯草芽孢杆菌CS1.03的保藏日期为2015年12月29日。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03接种培养24h后的平板图照片。

图2为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03的革兰氏染色图。

图3为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03的淀粉水解试验图。

图4为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03分子学鉴定试验中16S rDNA序列片段的电泳图。

图5为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03分子学鉴定试验中的系统发育树。

图6为本发明复合风味菌剂发酵制得的酱油与对照组酱油的氨基酸态氮含量结果对比图。

图7为本发明复合风味菌剂发酵制得的酱油与对照组酱油的感官评价结果对比图。

图8为本发明复合风味菌剂发酵制得的酱油雷达图。

图9为未添加本发明复合风味菌剂发酵制得的对照组酱油雷达图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一、复合风味菌剂产品

一种本发明的复合风味菌剂，其主要由耐盐枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌粉和耐盐球拟酵母菌粉按1:1的质量比混合配制而成。其中的枯草芽孢杆菌菌粉是由保藏编号为CCTCC NO：M 2015791的枯草芽孢杆菌菌株制成，其中的耐盐球拟酵母菌粉是由购于安琪酵母股份有限公司的耐盐球拟酵母S4为原料制成。

本实施例中选用的枯草芽孢杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其命名为枯草芽孢杆菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015791。该枯草芽孢杆菌CS1.03的保藏日期为2015年12月29日，保藏单位的地址位于中国湖北武汉市武汉大学校内。

该菌株的鉴定过程如下：

将从传统的高盐稀态发酵(晒露法)酱醪中分离筛选出一株独特的枯草芽孢杆菌CS1.03进行鉴定，其过程包括：对枯草芽孢杆菌CS1.03进行形态学鉴定、生理生化试验，初步确定为芽孢杆菌属；再对枯草芽孢杆菌CS1.03进行16S rDNA序列鉴定分析(鉴定结果见说明书后所附序列表)，确证此菌株为枯草芽孢杆菌种。

1.形态学鉴定

(1)将枯草芽孢杆菌CS1.03接种于高盐牛肉膏蛋白胨培养基平板，32℃培养24h后(参见图1)，菌落表面干燥，有褶皱状突起。

(2)对枯草芽孢杆菌CS1.03菌落进行革兰氏染色，油镜观察菌株形态特征，发现此菌为革兰氏阳性菌(参见图2)，有芽孢，菌体个体形态呈杆状，大小约为0.5×2μm～0.5×3μm。

上述的高盐牛肉膏蛋白胨培养基的制备步骤为：准备5g牛肉膏，10g蛋白胨，180g氯化钠，15-20g琼脂，1000mL蒸馏水，pH 7.0；121℃灭菌30min。

2.生理生化特征试验研究

(1)进行葡萄糖发酵产酸产气试验、过氧化氢酶试验和V.P.试验，结果如下表1所示，该试验表明枯草芽孢杆菌CS1.03产酸不产气，产过氧化氢酶，V.P.试验为阳性；符合芽孢杆菌的特征。

表1 枯草芽孢杆菌CS1.03的大分子试验结果

注：+代表结果呈阳性；-代表结果呈阴性。

上述葡萄糖发酵产酸产气试验培养基的制备步骤包括：准备1.0g磷酸氢二铵、0.2g氯化钾、0.2g硫酸镁、0.2g酵母膏、0.008g溴甲酚紫和1000mL蒸馏水，pH自然；121℃灭菌30min；灭菌后加入5g葡萄糖。

上述V.P.试验培养基的制备步骤包括：准备7g蛋白胨，5g葡萄糖，5g氯化钠，1000mL蒸馏水，pH自然；121℃灭菌30min。

(2)进行淀粉水解试验，如图3所示，通过透明圈的大小判断出本发明枯草芽孢杆菌CS1.03的淀粉酶酶活高。

上述淀粉水解培养基的制备步骤包括：在牛肉膏蛋白胨培养基的基础上加入1％的可溶性淀粉；121℃灭菌30min。

(3)进行耐盐性试验，结果如下表2所示，由表2可以看出，本发明枯草芽孢杆菌CS1.03可以耐受18％(w/v)的NaCl浓度，适宜在高盐发酵中应用。

表2 枯草芽孢杆菌CS1.03的耐盐性试验

注：+代表能够生长；++代表生长状况较好；+++代表生长状况良好。

上述耐盐性试验培养基的制备步骤包括：在牛肉膏蛋白胨培养基的基础上添加不同质量的氯化钠即可。

3.分子学鉴定

(1)引物设计：采用细菌通用引物进行16S rDNA的PCR扩增，引物设计如下：

Forward primer：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

Reverse primer：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

两引物间距离约为1500bp。

(2)DNA模板制备：从培养好的枯草芽孢杆菌CS1.03斜面挑取少量菌体于50μL菌落PCR模板提取缓冲体系中，80℃变性15min，4000r/min离心10～15min，取上清液作为模板。

(3)PCR获取16S rDNA片段：

反应体系：50uL反应体系中共含有PCR Premix 25μL，Forward primer(20pmol/uL)0.5μL，Reverse primer(20pmol/uL)0.5μL，模板1μL，16S-free H₂O 23μL。

反应条件：预变性94℃5min；变性94℃1min、退火55℃1min、延伸72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸5min。

(4)电泳：采用琼脂糖电泳检测PCR产物结果。

电泳条件：90V恒压，时间20-30min，结果见图4。

(5)16S rDNA序列测序

该枯草芽孢杆菌CS1.03的16S rDNA基因序列测定结果如后附的序列表1。

(6)测序结果比对

测序结果通过GenBank中的Blast搜索数据库进行序列的同源性比较分析，并用MAGE4.0软件构建系统进化树如图5所示。结果表明枯草芽孢杆菌CS1.03与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的亲缘关系最近(登录号：GQ305125.1)，相似度为100％。

二、复合风味菌剂的制备

一种上述本实施例的复合风味菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1.将耐盐枯草芽孢杆菌和耐盐球拟酵母进行菌体高盐高密度扩大培养，得到高浓度的耐盐枯草芽孢杆菌菌液和耐盐球拟酵母菌液。

1.1上述耐盐枯草芽孢杆菌菌液的具体制备包括：接种5％对数期的上述枯草芽孢杆菌CS1.03至一枯草芽孢杆菌高盐高密度扩培培养基中，在35℃下震荡培养(200r/min)55h，直至培养液中菌体浓度达到2.1×10⁹CFU/mL；

上述枯草芽孢杆菌高盐高密度扩培培养基包含以下质量分数的组分：0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、0.2％蔗糖、0.5％磷酸氢二钾、0.1％硫酸镁和20％氯化钠，pH6.8。

1.2上述耐盐球拟酵母菌液的具体制备包括：接种5％对数期的上述耐盐球拟酵母S4(购于安琪酵母股份有限公司)至一耐盐球拟酵母高盐高密度扩培培养基中，在28℃下震荡培养(200r/min)50h，直至培养液中菌体浓度达到2.3×10⁹CFU/mL；

上述耐盐球拟酵母高盐高密度扩培培养基包含以下质量分数的组分：4％葡萄糖、2％玉米浆、1％酵母膏、0.5％磷酸氢二钾、0.1％硫酸镁和20％氯化钠，pH6.5。

2.在上述步骤1制得的耐盐枯草芽孢杆菌菌液和耐盐球拟酵母菌液中分别加入保护剂。保护剂包含脱脂奶粉、β-环糊精、低聚果糖和甘油：且前述四种组分在菌液中的添加量以质量分数计分别为5％、5％、3.5％和1.5％。

3.将上述步骤2制得的耐盐枯草芽孢杆菌菌液和耐盐球拟酵母菌液进行喷雾干燥，喷雾干燥的具体工艺条件包括：进口温度120℃，入料流量15mL/min，压力0.2MPa，热风流量30M³/h，出口温度65～78℃，得到耐盐枯草芽孢杆菌菌粉和耐盐球拟酵母菌粉。经喷雾干燥后得到的耐盐枯草芽孢杆菌菌粉中的活菌数为1.4×10⁹CFU/g，耐盐球拟酵母菌粉的活菌数为1.3×10⁹CFU/g。

4.将上述步骤3所得的耐盐枯草芽孢杆菌菌粉和耐盐球拟酵母菌粉按1:1的质量比混合后，得到直投式酱油增香复合风味菌剂，真空封口包装。

三、复合风味菌剂的应用

经检测分析，本实施例的上述枯草芽孢杆菌CS1.03可以产高酶活的淀粉酶、蛋白酶、几丁质酶以及乳酸等有机酸。耐盐球拟酵母菌在酱油过程中产生醇和酯类等与酱油风味及其相关的物质，对酱油独特风味的形成有十分重要的贡献。我们创造性地将上述两种菌株制作成复合风味菌剂，并添加于酱油发酵中，发现可以有效改善发酵酱油的品质，从而达到提升产品品质、提高氨基氮含量及丰富酱油风味的效果。

本发明的复合风味菌剂在高盐稀态法酱油发酵的1/3期加入，添加量为1.0～1.5g/Kg原料，无需活化，直接与酱醪搅拌均匀发酵。

氨基酸态氮含量分析：取添加复合风味菌剂发酵的酱油原油和未添加复合风味菌剂发酵的酱油原油进行氨基酸态氮含量测定，测定方法参照中华人民共和国国家标准GB/T5009.39-2003中的4.2.1，结果如图6所示。由图6可见，添加复合风味菌剂发酵的酱油氨基酸态氮的含量比未添加的普通发酵酱油高23.0％。

感官评价分析：感官评价根据食品感官评定的基本原则，设计邀请十个不同地域、性别、年龄的人分别对酱油的色、香、味、体按100分制进行品评并打分，评分标准见表3。添加复合风味菌剂发酵酱油和对照组酱油品评平均分数见图7。结果表明，添加复合风味菌剂后的酱油感官评价明显优于未添加的普通发酵酱油，提升了39.0％。

表3：酱油毛油的品评原则

电子鼻检测分析：对添加复合风味菌剂发酵酱油和对照组酱油进行电子鼻检测分析，在测试过程中，3、4、5、10号传感器不灵敏，除去不灵敏的传感器，结果如图8、图9。从图8和图9中可以看出，相比于对照组酱油，添加复合风味菌剂发酵酱油的芳烃化合物(1号传感器)、烷类物质(6号传感器)、醇类物质(8号传感器)明显增多，这三类物质都是酱油风味的有利物质，尤其是醇类物质，其含量的增加能够使酱油具有更好的风味。此外，添加复合风味菌剂发酵酱油的硫化物等不利风味物质(7、9号传感器)相比于对照组酱油有明显的降低。综合分析，添加复合风味菌剂发酵酱油中有利风味物质高于对照组酱油，不利风味物质低于对照组物质，所以添加复合风味菌剂发酵的酱油风味优于对照组酱油。

上述各项检测结果表明，复合风味菌剂能够有效的提升酱油中的有利风味物质含量，同时抑制不利风味物质的生成，对酱油品质的提高和风味的提升具有明显的作用。

　　<110> 长沙理工大学 加加食品集团股份有限公司

　　<120> 一种复合风味菌剂及其制备方法和在酱油增香中的直投式应用

　　<160> 3

　　<210> 1

　　<211> 1464bp

　　<212> DNA

　　<213> 枯草芽孢杆菌

　　<400> 1

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatgggca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260

caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg 1440

ccgaaggtgg gacagatgat tggg 1464

　　<210> 2

　　<211> 20bp

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 2

　　Agagtttgat cctggctcag 20

　　<210> 3

　　<211> 20bp

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 2

　　aaggaggtga tccagccgca 20