本发明涉及一种草腐菇类活性菌的制备方法。
背景技术：
传统栽培草腐菇类多采用一次发酵技术，但一次发酵技术耗时长，效率低，培养料发酵效果不佳。后来有栽培者采用二次发酵技术，但该方法耗能大，费工多，成本较高。为此，采用活性菌技术代替二次发酵技术。活性菌技术源自于日本的酵素菌技术，其原理相似。酵素菌是由一些能大量产生各种水解酶的好气性微生物组成的微生物种群，含有细菌、放线菌、真菌三大类。几十种酶类，具有很强的发酵分解能力。酵素菌技术能解决农业生产的品质问题，它可以改变土壤的物理性状，提高土壤肥力。促进农作物的高产优质。利用酵素菌发酵有机质制成的系列微生物肥料，除含作物生长营养外，还含大量维生素，核酸，生长素和未知生长因子和大量活性有益微生物。草腐菇所需栽培原料主要是作物秸秆和牛粪。作物秸秆等木质素纤维素含量高，在发酵过程中很难降解，而腐殖质是在木质素纤维素分解过程中形成的，因此，能否有效地加强木质素纤维素的分解转化，成为发酵料能否充分腐熟的关键。然而，自然发酵料由于所含微生物的种类和数量有限，在发酵料中难以快速地繁殖和降解草腐料中的木质素纤维素，造成发酵周期长，发酵效果差。
技术实现要素：
本发明提出一种草腐菇类活性菌的制备方。
一种草腐菇类活性菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备培养基，所述培养基包括初筛培养基和复筛培养基，其中初筛培养基的制备包括筛选放线菌培养基、筛选细菌培养基、筛选真菌培养基PDA培养基、筛选固氮菌培养基；
（2）将草腐料称取5g，置于50ml无菌水的三角瓶中，在62-64摄氏度环境下高温水浴，水浴时间为10-12h，稀释涂布，放线菌，真菌，细菌在分离培养基上涂布，固氮菌涂布，倒置在44℃培养，放线菌培养4d，细菌培养1d，真菌6-7d，固氮菌4d；
（3）采用1‰的刚果红染色液染1h，再用1mol/l的NaCI脱色30min；
（4）将初筛得到的菌株接种到液体产酶培养基中，置于37℃恒温摇床培养，制备粗酶液，测定酶活；
（5）用250,ml摇瓶装50,ml发酵培养基，经灭菌。接种用生理盐水冲洗的孢子2ml，37℃摇床振荡(200r/min)培养，放线菌，细菌，真菌培养，用2层纱布挤滤，滤液4000r/min离心5min，上清液即为粗酶液；
（6）在烘干的具塞刻度试管中，编号后各加入1.5m1的0.5%CMC柠檬酸缓冲液，向一号对照试管中加入1.5mlDNS溶液，其它各加入0.5ml粗酶溶液，50℃沸水浴30min后，加入1．5mlDNS溶液，充分摇匀后沸水浴5min．在凉水中冷却5min，用蒸馏水定容到20ml，充分混匀；
（7）用无菌生理盐水洗涤保存斜面，摇匀即成菌悬液，接种斜面培养物于种子瓶，放线菌在28℃，220r/min培养36h得到种子液，细菌在30℃，220r/min培养24h得到种子液，霉菌在28℃，220r/min培养48h后烘干，即得草腐菇类活性菌。
优选地，所述步骤（5）摇床的震荡速度为200r/min。
本发明所述方法制备的一种草腐菇类活性菌，活性较好，利用其堆肥时，堆肥升温速度快，最高温度高，高温保持时间长，能够促进堆肥的腐熟，缩短堆肥周期。
具体实施方式
实施例1。
一种草腐菇类活性菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备培养基，所述培养基包括初筛培养基和复筛培养基，其中初筛培养基的制备包括筛选放线菌培养基、筛选细菌培养基、筛选真菌培养基PDA培养基、筛选固氮菌培养基；
（2）将草腐料称取5g，置于50ml无菌水的三角瓶中，在62-64摄氏度环境下高温水浴，水浴时间为10-12h，稀释涂布，放线菌，真菌，细菌在分离培养基上涂布，固氮菌涂布，倒置在44℃培养，放线菌培养4d，细菌培养1d，真菌6-7d，固氮菌4d；
（3）采用1‰的刚果红染色液染1h，再用1mol/l的NaCI脱色30min；
（4）将初筛得到的菌株接种到液体产酶培养基中，置于37℃恒温摇床培养，制备粗酶液，测定酶活；
（5）用250,ml摇瓶装50,ml发酵培养基，经灭菌。接种用生理盐水冲洗的孢子2ml，37℃摇床振荡(200r/min)培养，放线菌，细菌，真菌培养，用2层纱布挤滤，滤液4000r/min离心5min，上清液即为粗酶液；
（6）在烘干的具塞刻度试管中，编号后各加入1.5m1的0.5%CMC柠檬酸缓冲液，向一号对照试管中加入1.5mlDNS溶液，其它各加入0.5ml粗酶溶液，50℃沸水浴30min后，加入1．5mlDNS溶液，充分摇匀后沸水浴5min．在凉水中冷却5min，用蒸馏水定容到20ml，充分混匀；
（7）用无菌生理盐水洗涤保存斜面，摇匀即成菌悬液，接种斜面培养物于种子瓶，放线菌在28℃，220r/min培养36h得到种子液，细菌在30℃，220r/min培养24h得到种子液，霉菌在28℃，220r/min培养48h后烘干，即得草腐菇类活性菌。
实施例2。
一种草腐菇类活性菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备培养基，所述培养基包括初筛培养基和复筛培养基，其中初筛培养基的制备包括筛选放线菌培养基、筛选细菌培养基、筛选真菌培养基PDA培养基、筛选固氮菌培养基；
（2）将草腐料称取5g，置于50ml无菌水的三角瓶中，在62-64摄氏度环境下高温水浴，水浴时间为10-12h，稀释涂布，放线菌，真菌，细菌在分离培养基上涂布，固氮菌涂布，倒置在44℃培养，放线菌培养4d，细菌培养1d，真菌6-7d，固氮菌4d；
（3）采用1‰的刚果红染色液染1h，再用1mol/l的NaCI脱色30min；
（4）将初筛得到的菌株接种到液体产酶培养基中，置于37℃恒温摇床培养，制备粗酶液，测定酶活；
（5）用250,ml摇瓶装50,ml发酵培养基，经灭菌。接种用生理盐水冲洗的孢子2ml，37℃摇床振荡(200r/min)培养，放线菌，细菌，真菌培养，用2层纱布挤滤，滤液4000r/min离心5min，上清液即为粗酶液；
（6）在烘干的具塞刻度试管中，编号后各加入1.5m1的0.5%CMC柠檬酸缓冲液，向一号对照试管中加入1.5mlDNS溶液，其它各加入0.5ml粗酶溶液，50℃沸水浴30min后，加入1．5mlDNS溶液，充分摇匀后沸水浴5min．在凉水中冷却5min，用蒸馏水定容到20ml，充分混匀；
（7）用无菌生理盐水洗涤保存斜面，摇匀即成菌悬液，接种斜面培养物于种子瓶，放线菌在28℃，220r/min培养36h得到种子液，细菌在30℃，220r/min培养24h得到种子液，霉菌在28℃，220r/min培养48h后烘干，即得草腐菇类活性菌。
（8）优选地，所述步骤（5）摇床的震荡速度为200r/min。