益生菌发酵生附子的组合物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种益生菌发酵生附子的组合物及其制备方法，将生附子粉碎，加水浸泡，调pH，酶解，灭菌，接种预培养好的菌种，发酵即得。本发明还公开了益生菌发酵附子的组合物在制备发酵型附子中药配方颗粒中的应用以及在提取分离发酵附子中的多糖成分和生物碱成分中的应用。本发明制备的发酵型附子中药配方颗粒，能显著降低有毒成分双酯型生物碱含量,提高药效成分单酯型生物碱含量，最大限度地促进药效成分的提取,提高药物利用率，成分稳定，使用方便。实验结果显示：发酵型附子中药配方颗粒中高毒性双酯型生物碱含量很低，几乎检测不到，而低毒性单酯型生物碱含量明显提高。急性毒性试验显示：发酵型附子中药配方颗粒没有表现出毒性。
【专利说明】
益生菌发酵生附子的组合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及中药发酵组合物及中药加工技术，特别是设及中药附子经微生物发酵 达到减毒存效目的，制备有效提取物，特别是制备发酵型附子中药配方颗粒，属于医药技术 领域。
【背景技术】
[0002] 中药附子来源于毛良科植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)，其侧根(子根） 叫附子，味辛、甘，性大热，有毒，被誉为"乱世之良将，回阳救逆之第一品，补命口真火第一 要药"，有回阳、逐冷、桂风湿的作用。治大汗亡阳、四肢厥逆、肾阳衰弱的腰膝冷痛、形寒爱 冷、精神不振W及风寒湿痛、脚气等症。后世多因其有"毒"而畏之。有人说"附子最有用，亦 最难用"。附子为临床回阳救逆的要药，近年来在治疗危急重症方面有着广阔的前景，具有 镇痛、消炎、强屯、和抗癌等药理作用。
[0003] 附子主要成分为生物碱，包括双醋型生物碱(乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等）、单 醋型生物碱(苯甲酯乌头原碱、苯甲酯次乌头原碱、苯甲酯新乌头原碱等）、氨醇型生物碱 (乌头原碱、次乌头原碱、新乌头原碱等)和其他类生物碱(如新江油乌头碱、消旋去甲乌药 碱等），运几种生物碱的毒性差异极大，其中双醋型生物碱毒性很大，乌头碱、新乌头碱、次 乌头碱的小鼠 LD50分别为1.8 mg/kg、1.9 mg/kg和5.8 mg/kg。乌头碱等双醋类生物碱水 解可生成毒性小的单醋类生物碱(苯甲酯乌头原碱、苯甲酯新乌头原碱及苯甲酯次乌头原 碱），其毒性仅为双醋型生物碱的1/1000。单醋型生物碱如果进一步水解则变为毒性更小或 无毒的醇胺类生物碱(乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱），其毒性仅为乌头碱的1/2000左 右。因此，附子的毒性指标应W双醋型生物碱含量为指标。如炮制不当或剂量过大W及煎煮 时间不够，均可引起中毒反应。乌头碱的毒性主要作用于神经系统、消化系统、屯、血管系统 和呼吸系统。对于神经系统，乌头碱能够对各种神经末梢和中枢系统产生一个先兴奋后抑 制的过程，并对屯、肌直接产生作用，进而造成呼吸中枢麻搏，中枢性血压下降，甚至引起窒 息而死亡。对于屯、血管系统，乌头碱对屯、脏的损害最严重，临床表现为屯、惇、胸闷、血压下 降、屯、率失常、屯、率减慢或过速，严重者甚至发生屯、跳骤停、急性屯、源性脑缺血综合症等。对 于消化系统，乌头碱对胃肠迷走神经的兴奋作用可引起流诞、吞咽困难、恶屯、、频繁呕吐、胃 部灼热、腹痛、腹泻、肠鸣音亢进，严重者可导致呕吐咖啡色样液及解鲜血样粪便，里急后 重，酷似频疾等表现。对于呼吸系统，乌头碱的毒性可导致呼吸困难、呼吸麻搏甚至休克死 亡。
[0004] 由于生附子毒性大，临床应用附子，古今都很重视附子的加工炮制。
[0005] 为使附子达减毒存效的目的，汉代至今已有70余种附子的加工炮制方法，比如， 炒炭法、蜜炙法、火炮法、纸裹腰法、姜制法、盐制法、甘草汤炒法等。2015年版《中国药典》 附子仍然采用胆己炮制方法，将生附子用食用胆己水浸泡、煮透、水漂、切片、再水漂、染 色、蒸制、干燥。经过多次反复的水浸泡、漂洗等处理，炮制工艺繁琐，方法复杂，可控性差， 有效成分损失严重。唐小龙等研究报道:附子炮制过程中生物碱的减少主要在于胆己水泡 (损失31.6 % )、漂片（损失33.6 % )、水解(损失16.9 % )，生物碱总量减少了81.3%，又因为 浸泡时间、溫度、漂洗程度等不同，不同批次附子饮片成分含量相差可高达10倍。
[0006] 中药附子传统加工方法W减毒为目标的工艺流程存在附子有效活性成分大量流 失的弊端，改革传统工艺，科学把握乌头碱等双醋生物碱的水解反应，避免流失浪费，有效 利用中药资源，是大势所趋。
【发明内容】
[0007] 为克服现有技术的不足，本发明提供了一种益生菌发酵生附子的组合物及其制备 方法，是将优选的几种菌种，加入经预处理的附子中，利用微生物生长活动产生活性物质， 实现对附子成分的结构性修饰，W达到提高药效和降低毒性的目的。
[0008] 微生物菌群具有氧化、甲基化、径基化、去醋化、还原化等多种生物转化能力。通过 微生物生物转化来炮制中药，可W比一般的物理或化学的炮制手段更大地增强或调整药 性，从而提高中药疗效，降低毒副作用，扩大中药适应症。
[0009] 细菌W生长繁殖速度快、针对性强、有较强的综合转化能力，特别是利用人体肠道 中的有益菌群对中药进行转化。
[0010] 本发明所述的益生菌发酵生附子的组合物，是将生附子粉碎、浸泡、酶解后，由益 生菌发酵制得，具体步骤如下： 1、 粉碎:取干燥的生附子粉碎（10-100目）； 2、 浸泡:加入药材量的5-20倍水浸泡0.5-2.0小时，得到生附子水浸混悬液； 3、 调pH:将步骤2得到的生附子水浸混悬液，用氨氧化钢或氨氧化巧调P册.0-7.5; 4、 酶解:将步骤3得到的已调pH值的生附子水浸混悬液，加热至70-95°C，按生附子的干 重加入重量百分比0.1-1.0%的耐高溫α-淀粉酶，并保持20-60分钟，取样检测，使舰试液不 再变蓝，得到酶解的附子混合液； 5、 灭菌:将步骤4得到的已酶解的附子混合液，105-12rC高溫高压灭菌20-120min; 6、 接种:将步骤5得到的灭菌附子混合液，溫度降至30-37°C，接种两种或两种W上预培 养好的菌种； 7、 发酵:将步骤6得到的已接种的附子混合液，在25-37Γ环境下，按常规发酵条件培养 2-7天，结束发酵，即得到益生菌发酵附子的组合物。
[0011] 所述的菌种选自芽抱杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌，接种量分别为体积百分比 0.5〇/〇-2.0〇/〇。
[0012] 所述的芽抱杆菌选自枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌;所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆 菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌;所 述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌 和婴儿双歧杆菌;所述的酵母菌选自马克斯克鲁酵母、酿酒酵母。
[0013] 菌种来源于中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)(中国，武汉）或中国普通微生物菌 种保藏管理中屯、（CGMCC)(中国，北京）或者中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（CICC)(中 国，北京）。
[0014] 本发明的另一个目的在于提供本发明益生菌发酵附子在医药领域中的应用，根据 用途不同，设及制备发酵型附子中药配方颗粒;提取分离发酵附子中的多糖成分和/或提取 分离发酵附子中的生物碱成分。
[0015] 所述的制备发酵型附子中药配方颗粒，是将已经发酵好的益生菌发酵附子的组合 物进行提取、浓缩、干燥、检测、分装，即得发酵型附子中药配方颗粒。
[0016] 具体包括W下步骤： a、 提取、浓缩:将得到的益生菌发酵附子的组合物，离屯、或过滤，分离发酵液，中药残渣 再加水巧-20倍），加热提取1-2遍，合并发酵液与提取液，减压浓缩至固形物含量10%W上； b、 干燥:将步骤a得到的浓缩液，喷雾干燥； C、检测、分装:将步骤b得到的干燥粉末，检测成分，并按要求规格分装。
[0017] 所述的提取分离发酵附子中的多糖成分和/或提取分离发酵附子中的生物碱成 分，是将已经发酵好的益生菌发酵生附子的组合物进行提取、分离、纯化。
[001引具体包括W下步骤： 1) 提取:将得到的益生菌发酵生附子的组合物离屯、或过滤，分离发酵液，中药残渣再加 水巧-20倍），加热提取1-2遍，合并发酵液与提取液，减压浓缩至相对密度1.08-1.18; 2) 分离发酵附子中多糖成分:取步骤1)得到的浓缩液加乙醇使含醇量为75-90%，放置 24小时后，分离上清液与沉淀，取沉淀加水溶解，滤过，滤液再加乙醇使含醇量为80-90%， 放置24小时，再次分离上清液与沉淀，取沉淀用丙酬洗涂3次，挥干溶剂，50°C减压干燥得发 酵附子多糖。
[0019] 3)分离发酵附子中总生物碱成分:取步骤1)得到的浓缩液加乙醇使含醇量为80- 90%，放置24小时后，分离上清液与沉淀，收集乙醇上清液，减压回收乙醇，并浓缩至相对密 度1.01-1.03,用D101大孔吸附树脂吸附，W5倍体积蒸馈水除杂，再用体积分数为15%的乙 醇溶液1.5~2 BV· h-1流速洗脱5倍体积，浓缩洗脱液，真空干燥，得发酵附子总生物碱。
[0020] 有益效果:本发明是将中药与现代生物技术、生物工程技术和酶工程技术相结合 的一种新的中药炮制方法，是将中药炮制与制备中药配方颗粒有机结合在一起。本发明制 备的发酵型附子中药配方颗粒，能显著降低有毒成分双醋型生物碱的含量，提高药效成分 单醋型生物碱的含量，同时，能最大限度地促进药效成分的提取，提高药物利用率，成分稳 定，使用方便。为检测本发明制备的发酵型附子中药配方颗粒减毒存效，分别进行了成分比 较实验和急性毒性比较试验。成分比较实验结果显示:本发明的发酵型附子中药配方颗粒 中高毒性双醋型生物碱含量很低，几乎检测不到，而低毒性单醋型生物碱含量明显提高。急 性毒性试验结果显示:发酵型附子中药配方颗粒没有表现出毒性。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的发酵型附子中药颗粒与生附子和附子饮片（黑顺片)成分比较的薄 层色谱图。
[0022] 图中：S、自上而下分别为次乌头碱、乌头碱、新乌头碱、苯甲酯次乌头原碱、苯甲 酷乌头原碱、苯甲酯新乌头原碱；1、发酵型附子中药配方颗粒A供试品；2、发酵型附子中药 配方颗粒B供试品；3、发酵型附子中药配方颗粒C供试品;0、生附子;A、附子饮片(黑顺片）。
【具体实施方式】
[0023] W下通过【具体实施方式】的描述对本发明作进一步说明，但运并非是对本发明的限 审IJ，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可W做出各种修改或改进，但是只要不脱离本 发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0024] 实施例1:发酵型附子中药配方颗粒A的制备 取中药生附子粗粉(20目）10kg，加水10化浸泡1.0小时，用氨氧化钢调整抑为7.0,加 热至90°C，加入耐高溫α-淀粉酶50g，并保持30分钟，取样检测，舰试液不再变蓝。于115°C下 灭菌50分钟，溫度降至37°C时，同时接种预培养的体积百分比1.0%的短双歧杆菌（CGMCC 1.2213) 的菌液和体积百分比各0.5%的嗜酸乳杆菌（CGMCC 1.1854)、植物乳杆菌（CGMCC 1.19) W及体积百分比1.0%的啤酒酵母（CGMCC 2.1416)，37°C发酵24小时，然后溫度降至 3(TC培养48小时，取样检测，双醋型生物碱斑点消失，结束发酵，得益生菌发酵生附子的组 合物。离屯、分离发酵液，中药残渣再加水15化，加热煮沸提取0.5小时，离屯、，合并发酵液与 提取液，减压浓缩至固形物含量1 〇%W上，喷雾干燥，得干燥颗粒3.62kg，检测，分装，即得。
[0025] 实施例2:发酵型附子中药配方颗粒B的制备 取中药生附子粉(60目）10kg，加水50L浸泡2.0小时，用氨氧化巧调整pH为7.0,加热至 70°C，加入耐高溫α-淀粉酶lOOg，并保持20分钟，取样检测，舰试液不再变蓝。于12rC下灭 菌40分钟，溫度降至30°C时，同时接种预培养的体积百分比2.0%的枯草芽抱杆菌（CGMCC 1.2213) 的菌液和体积百分比2.0%的马克斯克鲁酵母(CGMCC 2.3959)，30°C培养7天，取样 检测，双醋型生物碱斑点消失，结束发酵，得益生菌发酵生附子的组合物。发酵物加水1〇化， 加热煮沸提取0.5小时，离屯、，中药残渣再加水100L，加热提取0.5小时，合并提取液，减压浓 缩至固形物含量1 〇%W上，喷雾干燥，得干燥颗粒3.06kg，检测，分装，即得。
[00%]实施例3:发酵型附子中药配方颗粒C的制备 取中药生附子粉(100目）10kg，加水20化浸泡2.0小时，用氨氧化钢调整pH为7.0，加热 至80°C，加入耐高溫α-淀粉酶lOg，并保持60分钟，取样检测，舰试液不再变蓝。于11(TC下灭 菌90分钟，溫度降至37°C时，同时接种预培养的体积百分比1.0%的两歧双歧杆菌（CGMCC 1.5090)的菌液和体积百分比各0.5%的干酪乳杆菌（CGMCC 1.2901 )、德氏乳杆菌乳亚种 (CGMCC 1.2625)，37°C发酵48小时，取样检测，双醋型生物碱斑点消失，结束发酵，得益生菌 发酵生附子的组合物。离屯、分离发酵液，中药残渣再加水50L，加热煮沸提取0.5小时，离屯、， 合并发酵液与提取液，减压浓缩至固形物含量10%W上，喷雾干燥，得干燥颗粒3.38kg，检 巧。，分装，即得。
[0027]实施例4:提取分离发酵附子中的多糖成分和生物碱成分 取中药生附子粗粉(80目）lkg，加水10L浸泡1.0小时，用氨氧化钢调整pH为7.0,加热 至90°C，加入耐高溫α-淀粉酶5g，并保持30分钟，取样检测，舰试液不再变蓝。于115°C下灭 菌50分钟，溫度降至37°C时，同时接种预培养的体积百分比1.0%的短双歧杆菌（CGMCC 1.2213) 的菌液和体积百分比各0.5%的嗜酸乳杆菌（CGMCC 1.1854)、植物乳杆菌（CGMCC 1.19) ，37°C发酵24小时，然后溫度降至30°C培养24小时，结束发酵，得益生菌发酵生附子的 组合物。离屯、分离发酵液，中药残渣再加水15L，加热煮沸提取0.5小时，离屯、，合并发酵液与 提取液，减压浓缩至相对密度1.10; 缓缓加入乙醇使含乙醇量为85%，放置24小时后，分离上清液与沉淀，收集上清液备 用;取沉淀加水500ml溶解，滤过，滤液加乙醇使含醇量为85%，放置24小时，再次分离上清 液与沉淀，收集上清液备用;取沉淀用丙酬洗涂3次，每次150ml，挥干溶剂，50°C减压干燥， 得发酵附子多糖62.6g。
[00%]另合并收集的85%乙醇上清液，减压回收乙醇，并浓缩至相对密度1.02,用D101大 孔吸附树脂吸附，W5倍体积（BV)蒸馈水除杂，再用体积分数为15%的乙醇溶液1.5~2 BV · h-1流速洗脱5BV，浓缩洗脱液，真空干燥，得发酵附子总生物碱10.8g。
[0029] 实验例1:发酵型附子中药颗粒与生附子、附子饮片(黑顺片)成分比较 取生附子粉末5g加氨试液5ml润湿，加二氯甲烧50ml超声30min，过滤，滤液挥干，残渣 加无水乙醇1.0ml溶解，作为生附子对照样品；另取黑顺片粉末5g同法制备，作为附子饮片 (黑顺片）对照样品；再取发酵型附子中药配方颗粒A、B、C适量（相当于附子5g)，加氨试液 2.0ml润湿，加二氯甲烧50ml超声30min，过滤，滤液挥干，残渣加无水乙醇1.0ml溶解，作为 供试品1、2、3;再取乌头碱3mg、次乌头碱3mg、新乌头碱各1.8mg、苯甲酯乌头原碱3.2mg、苯 甲酯新乌头原碱2.6mg、苯甲酯新乌头原碱1.9mg分别加无水乙醇2ml溶解。薄层层析：照薄 层色谱法（中国药典2015版通则0502)试验，吸取对照品溶液、供试品溶液1、2、3、生附子对 照样品溶液各加1，分别点于同一硅胶G薄层板上，W正己烧-乙酸乙醋-甲醇(6.4:3.6:1)为 展开剂，置氨蒸气饱和20min的展开缸内，展开，取出，惊干，喷W稀舰化祕钟试液。
[0030] 结果分析:发酵型附子中药配方颗粒在与双醋型生物碱(次乌头碱、乌头碱、新乌 头碱)对照品相对应的位置上几乎看不到相应的斑点，而在与单醋型生物碱(苯甲酯次乌头 碱、苯甲酯新乌头碱)对照品相对应的位置上，相应斑点明显，说明发酵型附子中药配方颗 粒中双醋型生物碱含量已经很少，几乎检测不到，而单醋型生物碱明显增加;生附子对照样 品双醋型生物碱斑点非常明显，说明生附子双醋型生物碱含量较高；黑顺片中双醋型生物 碱斑点比生附子弱，但仍能检测到，说明黑顺片中仍存在一定量的双醋型生物碱。见附图1。
[0031] 用薄层法对发酵型附子中药配方颗粒与生附子和黑顺片进行成分比较，很直观的 反映了生附子中双醋型生物碱含量高，单醋型生物碱含量低，黑顺片双醋型生物碱含量降 低，单醋型生物碱增加不明显，说明黑顺片在炮制过程中成分损失严重;而发酵型附子中药 配方颗粒双醋型生物碱含量很低，单醋型生物碱含量明显增高，说明在制备过程中将剧毒 性双醋型生物碱C位上的乙酷基水解，失去一分子醋酸，得到相应的苯甲酯单醋型生物碱， 从而降低毒性。另外乌头类生物碱C位上的乙酷基在比较缓和的条件下被脂肪酷基置换，生 成毒性较小的单醋类生物碱。所W发酵型附子中药颗粒降低了附子的毒性，保存了单醋型 生物碱的药理功效，从而达到减毒存效的目的，使临床用药更为安全、方便。
[0032] 实验例2:发酵型附子中药颗粒与生附子急性毒性实验 取小鼠48只，雌雄各半，根据性别和体重随机分为6组:正常组、生附子组(附子1.0 g/ ml)、黑顺片组(制附子1.0 g/ml)、发酵附子颗粒A组(相当于附子1.0 g/ml)、发酵附子颗粒 B组(相当于附子1.0 g/ml)、发酵附子颗粒C组(相当于附子1.0 g/ml)。
[0033] 小鼠撤食不撤水12 h后按40 mL/kg体积灌胃给药，每天2次，连续给予3天。药后连 续观察7 d:药后30min内，连续观察;药后30min-化，每15 min观察一次;药后2 h-4 h，每 30 min观察一次;药后4 h-8 h，每1 h观察一次;药后8 h-24 h，每4 h观察一次;药后d2 起，每天观察一次，记录小鼠的毛色、精神、动度、进食、饮水等一般情况、中毒症状及死亡情 况。死亡小鼠即刻解剖，观熟。、肝、脾、肺、肾等重要脏器的大体病理变化。
[OOW 结果 小鼠药后7天内毛色、二便等正常，生附子组死亡3只，黑顺片组死亡0只、发酵附子组死 亡ο只。小鼠给予生附子和黑顺片后，小鼠体重增长缓慢，与正常组比较，生附子组呈非常显 著性差异，黑顺片组呈显著性差异，而各发酵组均无显著性差异。并且灌胃生附子、黑顺片 水煎液后表现有不同程度的恶屯、、俯邸不动等症状毒性反应，而小鼠灌胃发酵型附子中药 颗粒未出现相应毒性症状，对小鼠尸检未见异常。
[0035] 1.对小鼠体重的影响 小鼠体重变化见表1。
[0036] 由表1结果可见，给予生附子和黑顺片后，小鼠体重增长缓慢，明显低于正常组，与 正常组比较，生附子组呈非常显著性差异，黑顺片组呈显著性差异，而各发酵组均无显著性 差异。
[0037] 2.对小鼠死亡情况的影响 连续多次给予附子后，小鼠的死亡情况如表2所示。生附子组中在2~4天给药后引起3 只小鼠死亡，其他各组无小鼠死亡。
[0038] 3.小鼠毒性症状观察 附子不同样品给小鼠灌胃毒性症状见表3。
[0039]由表3结果可见：小鼠灌胃生附子、黑顺片水煎液后的毒性反应主要有恶屯、、俯邸 不动等症状;而小鼠灌胃发酵型附子中药颗粒未出现相应毒性症状，对小鼠尸检未见异常。
【主权项】
1. 一种益生菌发酵生附子的组合物，其特征在于，将生附子粉碎、浸泡、酶解后，由益生 菌发酵制得，具体步骤如下： 1) 粉碎:取干燥的生附子粉碎（10-100目）； 2) 浸泡:加入药材量的5-20倍水浸泡0.5-2.0小时，得到生附子水浸混悬液； 3) 调pH:将步骤2得到的生附子水浸混悬液，用氢氧化钠或氢氧化钙调pH6.0-7.5; 4) 酶解:将步骤3得到的已调pH值的生附子水浸混悬液，加热至70-95Γ，按生附子的干 重加入重量百分比0.1-1.0%的耐高温α-淀粉酶，并保持20-60分钟，取样检测，使碘试液不 再变蓝，得到酶解的附子混合液； 5) 灭菌:将步骤4得到的已酶解的附子混合液，105-121°C高温高压灭菌20-120min; 6) 接种:将步骤5得到的灭菌附子混合液，温度降至30-37Γ，接种两种或两种以上预培 养好的菌种； 7) 发酵:将步骤6得到的已接种的附子混合液，在25-37Γ环境下，按常规发酵条件培养 2-7天，结束发酵，即得到益生菌发酵生附子的组合物； 步骤6)所述的菌种选自芽孢杆菌、乳杆菌、双歧杆菌或酵母菌，接种量分别为体积百分 比0·5%-2·0%〇2. 根据权利要求1所述的益生菌发酵生附子的组合物，其特征在于，所述的芽孢杆菌选 自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌;所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、 唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌;所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆 菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌;所述的酵母菌 选自马克斯克鲁酵母、酿酒酵母。3. 权利要求1或2所述的益生菌发酵生附子的组合物的制备方法，其特征在于，步骤如 下： 1) 粉碎:取干燥的生附子粉碎至10-100目； 2) 浸泡:加入药材量的5-20倍水浸泡0.5-2.0小时，得到生附子水浸混悬液； 3) 调pH:将步骤2得到的生附子水浸混悬液，用氢氧化钠或氢氧化钙调pH6.0-7.5; 4) 酶解:将步骤3得到的已调pH值的生附子水浸混悬液，加热至70-95Γ，按生附子的干 重加入重量百分比0.1-1.0%的耐高温α-淀粉酶，并保持20-60分钟，取样检测，使碘试液不 再变蓝，得到酶解的附子混合液； 5) 灭菌:将步骤4得到的已酶解的附子混合液，105-121°C高温高压灭菌20-120min; 6) 接种:将步骤5得到的灭菌附子混合液，温度降至30-37Γ，接种两种或两种以上预培 养好的菌种； 7) 发酵:将步骤6得到的已接种的附子混合液，在25-37Γ环境下，按常规发酵条件培养 2-7天，结束发酵，即得到益生菌发酵生附子的组合物； 步骤6)所述的菌种选自芽孢杆菌、乳杆菌、双歧杆菌或酵母菌，接种量分别为体积百分 比0·5%-2·0%〇4. 根据权利要求3所述的益生菌发酵生附子的组合物的制备方法，其特征在于，所述的 芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌;所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、 植物乳杆菌、唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌;所述的双歧杆菌选 自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌； 所述的酵母菌选自马克斯克鲁酵母、酿酒酵母。5. 权利要求1或2所述的益生菌发酵生附子的组合物在制备发酵型附子中药配方颗粒 中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的制备发酵型附子中药配方颗粒，是 将益生菌发酵生附子的组合物进行提取、浓缩、干燥、检测、分装，即得发酵型附子中药配方 颗粒，具体步骤如下： a、 提取、浓缩:将益生菌发酵生附子的组合物离心或过滤，分离发酵液；中药残渣再加 5-20倍重量的水，加热提取1-2遍，得提取液;合并发酵液与提取液，减压浓缩至固形物含量 10%以上，得浓缩液； b、 干燥:将步骤a得到的浓缩液，喷雾干燥，得干燥粉末； c、 检测、分装:将步骤b得到的干燥粉末，检测成分，按要求规格分装。7. 权利要求1或2所述的益生菌发酵生附子的组合物在提取分离发酵附子中的多糖成 分和/或提取分离发酵附子中的生物碱成分中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的提取分离发酵附子中的多糖成分的 步骤如下： 1) 提取:将益生菌发酵生附子的组合物离心或过滤，分离发酵液，中药残渣再加5-20倍 水，加热提取1-2遍，合并发酵液与提取液，减压浓缩至相对密度1.08-1.18; 2) 分离发酵附子中多糖:取步骤1)得到的浓缩液加乙醇使含醇量为75-90%，放置24小 时后，分离上清液与沉淀，取沉淀加水溶解，滤过，滤液再加乙醇使含醇量为80-90 %，放置 24小时，再次分离上清液与沉淀，取沉淀用丙酮洗涤3次，挥干溶剂，50°C减压干燥得发酵附 子多糖。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的提取分离发酵附子中的生物碱成分 的步骤如下： 1) 提取:将益生菌发酵生附子的组合物离心或过滤，分离发酵液，中药残渣再加5-20倍 水，加热提取1-2遍，合并发酵液与提取液，减压浓缩至相对密度1.08-1.18; 2) 分离发酵附子中总生物碱:取步骤1)得到的浓缩液加乙醇使含醇量为80-90%，放置 24小时后，分离上清液与沉淀，收集乙醇上清液，减压回收乙醇，并浓缩至相对密度1.01-1.03,用D101大孔吸附树脂吸附，以5倍体积蒸馏水除杂，再用体积分数为15%的乙醇溶液 1.5~2 BV· h-Ι流速洗脱5倍体积，浓缩洗脱液，真空干燥，得发酵附子总生物碱。
【文档编号】A61K36/714GK105998222SQ201610314984
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】吴炳新, 褚新红, 孙筱林
【申请人】三株福尔制药有限公司