黄牡丹（变种）乙酸乙酯提取物对口腔癌及癌前病变的干预作用
【专利摘要】一种能显著抑制口腔癌及癌前病变的中药提取物，属于新型口腔癌中药研发领域。黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物，提取方法简单、快捷，可批量生产。选用CCK8法检测黄牡丹(变种)对口腔癌细胞株SCC15、CAL27和口腔癌前病变细胞株DOK细胞的增殖抑制作用。本发明为临床口腔癌防治新药的研发提供依据。
【专利说明】
黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物对口腔癌及癌前病变的干预作用
技术领域
[0001]本发明涉及一种干预口腔鳞状细胞癌细胞生长的药物，具体地说是以天然植物黄牡丹(变种)根为原料，经乙酸乙酯提取，即黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物(ethyl acetateextract ,EA) 0本发明还涉及该药物的制备方法。
【背景技术】
[0002]黄牡丹(变种)(Paeoniadelavayi Franch.Var.1utea(Delavay ex Franch.)?111的&6&811叩.)，科属于毛莨科芍药属牡丹组，花黄色(有时边缘红色或基部有紫色斑块，与野牡丹以此区别)，羽状复叶，主要分布于云南、四川西南部及西藏东南部等地区，生于海拔2500-3000米的山地，是国家三级保护植物(1-2)。黄牡丹(变种)根可药用，根皮(赤丹皮)具有清热凉血、散瘀止痛的功效，去掉根皮的部分(“云白芍”)可治泄痢腹痛、自汗盗汗等症
[3]。中医临床多用于腹痛、痛经、月经不调等疾病的诊治(4-5)。目前，尚未有学者报道黄牡丹(变种)的抗肿瘤作用，对其药用价值及其机制的研究较少。
[0003]参考文献
[0004](I)王莲英.中国牡丹品种图志[M].北京:中国林业出版社，1997:2-7.
[0005](2)中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].科学出版社，1979(27)47.
[0006](3)云南省卫生厅主编.云南省药品标准(1996年版)[S].昆明:云南大学出版社，1998:55-56.
[0007](4)李奎，王雁.黄牡丹研究现状与展望[J].林业科学研究，2014，27(2): 259-264.
[0008](5)贾敏如，李星炜.中国民族药志要[M].中国医药科技出版社，2005
[0009]现有技术背景缺陷:目前，临床上口腔癌主要采用手术治疗、放射治疗及化学药物治疗为主的综合序列治疗，但治疗效果往往不佳。尽管近年来治疗手段有很大改进，但其5年生存率仍不足50%，严重影响了口腔癌患者的生存质量。口腔粘膜癌变是一个多阶段、多步骤的过程，口腔癌常由口腔癌前病变如白斑、扁平苔藓等发生恶变而来。至今尚无公认有效的防治口腔癌变的药物和治疗方法。现代药理研究表明许多传统中药具有抗肿瘤作用，且具有优效、低毒、低副作用等优点，人们开始逐步重视于传统中药的开发及应用。因此，寻找新型低毒高效的中草药治疗药物，延长患者的生命，提高其生存质量，对口腔癌综合治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0010]本发明目的是根据黄牡丹(变种)在中医临床上具有清热凉血、散瘀止痛的功效，检测黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物具有抑制口腔癌及癌前病变细胞生长的作用，以期为口腔癌的临床药物治疗提供新的思路及实验依据，开拓黄牡丹(变种)的药用价值及新用途。[0011 ]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。
[0012]具体包括以下步骤:
[0013](I)黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物的制备
[0014]黄牡丹(变种)样品粉碎成粗粉，取粗粉500克，用80%乙醇湿润后，再用3倍量80%乙醇回流提取两次，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，用等体积乙酸乙酯萃取2次(上层液体)，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至干燥，获得乙酸乙酯萃取物(EA)。
[0015](2)黄牡丹(变种)EA对口腔癌及癌前病变细胞形态的影响
[0016]在倒置显微镜下观察，口腔癌细胞SCC15和CAL27细胞呈梭形，不规则多边形，CAL27细胞体积更小，口腔癌前病变DOK细胞呈长梭形，不规则多边形。不同浓度黄牡丹(变种迮4处理三种细胞2411、4811、7211，随着药物浓度的增高细胞形态变圆、变小及细胞膜不连续的程度加重。
[0017](3)黄牡丹(变种)EA对口腔癌SCCl 5细胞增殖的影响
[0018]将I Oyg/ml、20yg/ml、40yg/ml、60yg/ml、80yg/ml、I OOyg/ml 不同浓度的黄牡丹(变种)EA作用于SCC15细胞24h、48h、72h，SCC15细胞增殖受到不同程度的抑制。随着药物浓度的升高，SCC15细胞增殖抑制率亦随之升高。黄牡丹(变种)EA作用SCC15细胞24h，48h的IC50分别为65 土 0.48yg/ml，22.72 ± 0.51yg/ml，提示黄牡丹(变种)EA对口腔癌SCC15细胞增殖具有抑制作用，抑制作用呈浓度和时间依赖性。
[0019](4)黄牡丹(变种)EA对口腔癌CAL27细胞增殖的影响
[0020]将12.5yg/ml、25yg/ml、50yg/ml、100yg/ml 不同浓度的黄牡丹(变种)EA 作用于口腔癌细胞CAL27细胞24h、48h、72h，CAL27细胞增殖受到抑制。随着药物浓度的升高，CAL27细胞增殖抑制率亦随着升高。黄牡丹(变种迮4作用041^27细胞2411，4811，7211的1050分别为36.5土 0.73yg/ml，27.I ± 0.55yg/ml，39.3 ± 0.89yg/ml，提示黄牡丹(变种)EA对口 腔癌CAL27细胞增殖具有抑制作用，且抑制作用具有浓度依赖性。
[0021 ] (5)黄牡丹(变种)EA对口腔癌前病变DOK细胞增殖的影响
[0022 ]将 12.5yg/ml、25yg/ml、50yg/ml、100yg/ml 不同浓度的黄牡丹(变种)EA 作用于 DOK细胞24h、48h、72h，D0K细胞增殖受到不同程度的抑制。随着药物浓度的升高，DOK细胞增殖抑制率亦随着升高。黄牡丹(变种)EA作用DOK细胞24h，48h，72h的IC50分别为68.51±0.73μg/ml，22.86 ± 0.55yg/ml，40.41 ± 0.89yg/ml，提示黄牡丹(变种)EA对口 腔癌前病变DOK细胞增殖具有抑制作用，且抑制作用具有浓度依赖性。
【附图说明】
[0023]图1.黄牡丹(变种)EA对SCC15细胞增殖的影响；
[0024]图2.黄牡丹(变种)EA对CAL27细胞增殖的影响；
[0025]图3.黄牡丹(变种)EA对DOK细胞增殖的影响；
【具体实施方式】
[0026]CCK-8 法:
[0027]采用CCK-8法分别检测黄牡丹(变种)EA对口腔癌细胞株SCC15、CAL27及癌前病变细胞株DOK细胞增殖的影响。实验设置实验组和对照组，实验组设置梯度浓度黄牡丹(变种)EA组;对照组为与实验组同剂量的溶剂DMSO组。取对数生长期细胞，用含0.25%EDTA胰酶消化，离心，弃上清。用含有10%血清的培养基调整细胞浓度为2.5 X 14个/ml。每孔接种200μI细胞悬液入96孔培养板内，每组4个复孔。贴壁过夜后，吸弃上清，按组加入含有不同浓度黄牡丹(变种)ΕΑ的培养液(血清含量为10 % )，并设溶剂对照组。继续培养不同时间(24h、4811、7211)。每孔加19(^1培养基和1(^1 CCK8试剂，置于37°C、5%⑶2饱和湿度孵箱内培养2.5h后终止培养。在酶标仪上测定各孔吸光度(A值)，选择450nm波长，记录结果，并按以下公式计算细胞增殖抑制率:增殖抑制率(％ ) = (A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)X100%。实验重复3次。
【主权项】
1.一种黄牡丹(变种)的提取物，该提取物为乙酸乙酯，对口腔癌及癌前病变的干预作用。2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述黄牡丹(变种)的乙酸乙酯提取物由以下方法制备:黄牡丹(变种)用石油醚浸泡18_36h，渗滤提取至3-8倍药材量，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，用70 % -90 %乙醇提取，提取液浓缩得乙醇浓缩液，相对密度为1.15-1.20，用乙酸乙酯萃取，倒出上层，即得乙酸乙酯提取物。3.根据权利I所述的对口腔癌的干预作用，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)首先CCK-8法检测黄牡丹(变种)乙酸乙酯对口腔癌细胞SCCl5的增殖抑制作用，效果明显，且随时间及药物浓度增加抑制作用增强。 (2)CCK-8法检测黄牡丹(变种)乙酸乙酯对口腔癌细胞CAL27的增殖抑制作用，效果明显，且随时间及药物浓度增加抑制作用增强。 (3)CCK-8法检测黄牡丹(变种)乙酸乙酯对口腔癌前病变细胞DOK的增殖抑制作用，效果明显，且随时间及药物浓度增加抑制作用增强。4.含权利要求1和2所述提取物的制剂，其特征在于，所述制剂为由黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述制剂为片剂、糖衣丸、胶囊、注射剂、溶液、乳液、油膏、乳膏、吸入剂、气雾剂或栓剂。6.权利要求1所述的提取物或权利要求4、5中所述的含黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物的制剂在制备防治口腔癌的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105998219SQ201610538603
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】汤晓飞, 王春晓, 陈慧, 黄林芳, 连增林
【申请人】首都医科大学附属北京口腔医院