荞麦发酵生产益生菌功能性食品的制作方法
【专利摘要】本发明属于功能性食品领域，具体涉及一种荞麦发酵生产益生菌功能性饮料和食品。公开了利用多种益生菌混菌液态发酵荞麦获得益生菌液态发酵饮料和多种益生菌混菌固态发酵荞麦获得益生菌食品及其制备方法。制备工艺简单，而且荞麦作为一种谷物食品，其经乳酸菌发酵或不发酵均具有不同程度的抗氧化、降血压、降血糖以及对心脑血管疾病的预防作用，同时也可调理肠道。因此该益生菌发酵饮料、固态发酵食品都将满足不同消费群体的需求。CGMCC No.1189120151217CGMCC No.1189220151217
【专利说明】
荞麦发酵生产益生菌功能性食品
技术领域：
[0001] 本发明涉及功能性食品领域，涉及利用益生菌发酵荞麦生产功能性食品的方法。
【背景技术】：
[0002] 糖尿病是近些年来非常常见而且又高发的内分泌代谢疾病。目前我国糖尿病人数 量居世界第一，确诊糖尿病人有近一亿。糖尿病严重影响患者的饮食起居、长期健康，并使 生活质量下降。目前，虽然市场上的益生菌功能性产品极其丰富，但是针对于有益糖尿病人 食用的产品种类很少。本专利旨在生产有益于糖尿病人食用的功能性饮料和食品，并为相 关产品提供研究思路。
[0003] 益生菌是能够以活菌形式进入消化道并能够耐受胃中的酸性环境和肠道中的胆 盐而定植下来从而对人体健康发挥有益作用的活性有益微生物的总称。其益生作用主要是 通过直接或者间接的调整宿主肠道微生物的组成，激活宿主内源性微生物群或者免疫系统 的活性来实现。目前证实益生菌可以有效的治疗和缓解便秘、腹泻、炎症性肠病等疾病。因 此近年来益生菌产品备受消费者关注。
[0004] 荞麦是自然界中药食两用的作物，是备受糖尿病人青睐的食用主食，共有四个品 种分别为甜荞、苦荞、翅荞和米荞，以甜荞和苦荞为主。荞麦蛋白质中含有丰富的赖氨酸成 分，其铁、锰、锌等微量元素比一般谷物丰富而且含有丰富的膳食纤维，所以荞麦具有很好 的营养保健作用。现代药理研究表明荞麦具有降糖降脂的作用，其功能性物质为黄酮类物 质和多酚，能有效抑制淀粉酶和葡糖苷酶的活性，而且还可提高胰岛素敏感性，减轻胰岛 素抵抗，保护胰岛β细胞，是天然植物胰岛素。同时可以减少脂肪的吸收，激活过氧化物体增 殖剂激活型受体的活性，改善脂质代谢降低血脂，可用于治疗糖尿病和高脂血症。荞麦中还 含有烟酸成分，能够促进机体的新陈代谢，增强解毒功能，还具有扩张小血管和降低血液中 胆固醇的作用。
[0005]通过益生菌发酵荞麦进行加工开发出的功能性饮料和食品，不仅能保留营养，提 高风味，还能增加功能性成分，吸收更容易。
[0006] 申请号201310742433.X的中国发明专利公布了一种混合乳酸菌发酵制备荞麦饮 料的方法，步骤如下:称取荞麦面，加入清水、无水氯化钙、淀粉酶，先液化再加入糖化酶 糖化，然后过滤得荞麦糖化液，将荞麦糖化液接入植物乳杆菌冻干粉、保加利亚乳杆菌冻干 粉、嗜热链球菌冻干粉，34°C-38 °C条件下厌氧发酵15-18小时，然后发酵液经调配、过滤、灌 装、灭菌即得成品。本发明的荞麦饮料有效克服了荞麦口感粗糙、不易消化的缺点，是一种 营养价值和保健价值较高的饮料，还为荞麦的深加工开辟了新途径。
[0007] 申请号为201510604991.9的中国发明专利公布了一种苦荞发酵饮料的制备方法， 该方法将苦荞脱皮去壳、并粉碎成苦荞粉，苦荞粉糊化后进行酶解过滤到糖化滤液;糖化滤 液灭菌后进行乳酸发酵，发酵液精滤得到发酵原液;发酵原液调制得到苦荞发酵饮料。本发 明提供的苦荞发酵饮料的制备方法，对苦荞粉进行浸提，通过酶解、糖化可提高苦荞黄酮及 其他苦荞内含物的溶出率，所得产品具有独特的怡人发酵风味。
[0008] 但是现有技术中提供的荞麦食品生产加工方法繁复，且营养物质含量低，本发明 将选择合适的组合菌株混菌发酵，利用菌株之间的协同发酵作用，既能提高产率、促进彼此 生长繁殖，组合菌株的产酶、产酸和产营养物质以及对基质的分解利用能力等要显著优于 单菌发酵。因此，可以通过液态和固态发酵两种工艺对荞麦进行组合菌株的混菌发酵，生产 荞麦益生菌功能性食品。
【发明内容】
：
[0009] 本发明的目的在于利用多种益生菌混菌对荞麦进行发酵获得一种益生菌功能性 食品。以下均以植物乳杆菌和动物双歧杆菌两株菌为例，进行本发明的具体介绍。
[0010] 为了实现上述目的，本发明提供一种荞麦液态发酵饮料:一种荞麦益生菌液态发 酵饮料，是将荞麦粉及谷物粉浆液原料作为发酵基质，采用植物乳杆菌和动物双歧杆菌经 液态混菌发酵后，经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、杀菌后制备而得。
[0011] 所述荞麦粉及谷物粉浆液具体为:每1000 ml水中加入5~10 % (质量体积比）荞麦 粉，0-5 % (质量体积比）的谷物粉，搅拌均匀；
[0012] 上述荞麦益生菌液态发酵功能性饮料的制备方法，具体步骤如下：
[0013] (1)荞麦脱壳后，将荞麦和谷物清洗，分别磨粉过100目筛得荞麦粉和谷物粉；
[0014] (2)配制活化培养基:每100mL水中添加5g荞麦粉(活化培养基中的荞麦粉与发酵 培养基中的荞麦粉种类一致）；对活化培养基进行灭菌，条件为，121°C，20min;
[0015] (3)配制发酵培养基：每100mL水中添加5-10g荞麦粉，0-5g的谷物粉，121°C灭菌 20min；
[0016] (4)菌种活化，植物乳杆菌和动物双歧杆菌甘油管分别按1%接种于活化培养基进 行活化，PH7.2-7.4，控制温度为37 °C ;分别活化20h后，按10 % (v/v)的接菌量再次转接活化 培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
[0017] (5)益生菌发酵:将植物乳杆菌按接菌量为I X 106-5 X IO7CFUAiL接种于发酵培养 基中，同时接种动物双歧杆菌，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌量体积比为1-10:1-10,混 菌液态发酵4~40h，温度为37°C，pH维持在7.2~7.4;
[0018] (6)发酵结束后发酵液经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、杀菌后即得荞麦益生 菌液态发酵饮料；
[0019]所述活化与发酵均为静置培养；
[0020] 所述荞麦为甜荞麦或苦荞麦；
[0021] 所述谷物为燕麦、小麦、玉米、大豆、黑豆中的至少一种；
[0022]优选的，发酵培养基的组成为:每100mL水中添加5g甜荞麦粉，2g的大豆粉；
[0023]优选的，发酵培养基的组成为:每100mL水中添加5g苦荞麦粉，5g的黑豆粉；
[0024]优选的，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接种量均为5 X IO7CFUAiL;
[0025]优选的，混菌液态发酵时间为28h;
[0026] 优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobaci Ilus plantarum)TK9，该菌株 已于2015年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.11891；
[0027] 优选的，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animal is )937，该 菌株已于2015年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.11892。
[0028] 为了实现上述目的，本发明提供的一种固态发酵技术方案:一种荞麦益生菌固态 发酵食品，是将荞麦作为发酵基质，采用植物乳杆菌和动物双歧杆菌经固态混菌发酵后制 备而得；
[0029] 所述荞麦为甜荞麦或苦荞麦；
[0030] 上述荞麦益生菌固态发酵功能性食品的制备方法，具体步骤如下：
[0031 ] (1)荞麦脱壳后，按荞麦和水按质量体积比为:1:0.75-2制得固态发酵培养基，；
[0032] (2)对固态发酵培养基进行灭菌，条件为，12?Γ，20π?η;
[0033] (3)菌种活化:方式同上述液态发酵；
[0034] (4)将二级种子液接入固态发酵培养基中，使得每克固态培养基中植物乳杆菌接 菌量为I X 1〇7-5 X IO8CFlVg，同时接种动物双岐杆菌，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌比例 保持 1-10:1-10;
[0035] (5)混菌固态发酵12~48h，37 °C，共计培养时间56-92h，pH维持在7 · 2~7 · 4;发酵 结束后，放置于-80°C预冻24小时后，放入真空冷冻干燥机内24小时，制得荞麦益生菌固态 发酵食品；
[0036] 所述荞麦为甜荞麦或苦荞麦；
[0037] 优选的，固态发酵中，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌量为I X IO8CFlVg;
[0038]优选的，固态发酵培养基中荞麦与水的质量体积比为1:1.5;
[0039]优选的，混菌发酵时间为30h;
[0040] 优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobaci Ilus plantarum)TK9，保藏编 号为CGMCC No .11891;
[0041 ] 优选的，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937,保 藏编号为CGMCC No. 11892。
[0042]本发明的有益效果：
[0043] 1、本发明所述的荞麦发酵饮料和发酵食品，既保留了荞麦的营养价值，又具有益 生菌发酵制品的营养保健作用。通过发酵使荞麦获得独特的风味，并且黄酮类物质、总酚类 物质、还原糖、氨基态氮含量等有明显提高，抗氧化性、ACEI、DPPIV和α-葡萄糖苷酶抑制率 等活性有了明显提高，使得荞麦的降血糖血脂血压的功效更加显著。该益生菌发酵荞麦食 品丰富了市场上荞麦产品的种类。发酵工艺简单，易于实现大规模的生产。益生菌发酵的荞 麦食品，相较于荞麦醋、荞麦酒以及其营养液，不仅成本低工艺简单，易于生产，且目标人群 更大。
[0044] 2、本发明所述的荞麦发酵饮料的制备方法，根据不同年龄段或不同人群的人体营 养需求，将荞麦和不同谷物搭配发酵，获得不同的风味和功效。
[0045] 通过此制备方法得到的荞麦发酵饮料和食品除了含有大量的营养功效物质外，甜 荞麦发酵产品中植物乳杆菌ΤΚ9和双歧杆菌937最高活菌数分别可以达到5.39 X IO9CFU/ mL、2 · 57 X IO9CFlVg(植物乳杆菌ΤΚ9)和1 · 31 X 109CFU/mL、1 · 01 X 109CFU/g(动物双歧杆菌 937)，苦荞麦发酵产品中植物乳杆菌TK9和双歧杆菌937最高活菌数分别可以达到7.25 X IO9CFlVmL、4 · 2 X IO9CFlVg (植物乳杆菌TK9)和2 · 12 X IO9CFlVmL、1 · 47 X IO9CFlVg (动物双 歧杆菌937)。
【附图说明】：
[0046] 图1:混菌发酵培养时间对益生菌混菌液态发酵甜荞麦饮料活菌数的影响
[0047] 图2:混菌发酵培养时间对益生菌混菌液态发酵苦荞麦食品活菌数的影响
[0048] 图3:混菌发酵培养时间对益生菌混菌固态发酵甜荞麦饮料活菌数的影响
[0049] 图4:混菌发酵培养时间对益生菌混菌固态发酵苦荞麦食品活菌数的影响
【具体实施方式】：
[0050] 下面结合表格和具体的实施方式对本发明作进一步的描述，但本发明并不限于以 下具体实施例子。
[0051 ]下述所有菌种活化及液态发酵均为静置培养。
[0052] 实施例1、益生菌液态发酵饮料工艺-荞麦与谷物配比的确定
[0053] (1)荞麦脱壳后，将荞麦和谷物清洗，磨粉过100目筛；
[0054] (2)配制活化培养基:每100mL水中添加5g荞麦粉(活化培养基中的荞麦粉与发酵 培养基中的荞麦粉种类一致）；对活化培养基进行灭菌，条件为，121°C，20min;
[0055] (3)配制发酵培养基:每100mL水中添加5g甜荞麦粉/苦荞麦粉，0-5g的大豆粉/燕 麦粉/小麦粉/玉米粉/黑豆粉，121°C灭菌20min;
[0056] (4)菌种活化，植物乳杆菌和动物双歧杆菌甘油管分别按1%接种于活化培养基进 行活化，PH7.2-7.4，控制温度为37 °C ;分别活化20h后，按10 % (v/v)的接菌量再次转接活化 培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
[0057] (5)益生菌发酵:将植物乳杆菌按接菌量为I X IO7CFUAiL接种于发酵培养基中，同 时接种动物双歧杆菌，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌量体积比为1:1，混菌液态发酵24h， 温度为37°C，pH维持在7.2~7.4;分别对发酵液中的益生菌活菌数进行检测，结果如表1-10：
[0058]表1甜荞麦粉:大豆粉= 5:0-5时，益生菌的活菌数(CFU/mL)
[0075] 表9苦荞麦粉:玉米粉= 5:0-5时，益生菌的活菌数(CFU/mL)
[0079] 由表1-10可知，最佳荞麦粉与谷物粉培养配方如下：
[0080] ①甜荞麦粉:大豆粉的比例为5: 2，测得的总活菌数为8.1 X IO8CFUAiL，其中植物 乳杆菌TK9活菌数为6.3 X 108CFU/mL、动物双歧杆菌937活菌数为1.8 X 108CFU/mL;
[0081 ]②甜荞麦粉:燕麦粉比例为5:4，测得的总活菌数为6.38 X IO8CFUAiL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为4.23 X 108CFU/mL、动物双歧杆菌937活菌数为2.12 X 108CFU/mL。
[0082]③甜荞麦粉:小麦粉比例为5:2，测得的总活菌数为4.16 X 108CFU/mL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为2.93 X 108CFU/mL、动物双歧杆菌937活菌数为1.23 X IO9CFlVmL。
[0083]④甜荞麦粉:玉米粉比例为5:3，测得的总活菌数为3.77 X 108CFU/mL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为2.21 X IO8CFlVmL、动物双歧杆菌937活菌数为1.56X IO8CFlVmL。
[0084] ⑤甜荞麦粉:黑豆粉比例为5:5，测得的总活菌数为7.82 X 108CFU/mL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为5.1 X 108CFU/mL、动物双歧杆菌937活菌数为2.62 X IO8CFlVmL。
[0085] ⑥苦荞麦粉:大豆粉比例为5:3,测得的总活菌数为7. IX 108CFU/mL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为4.78 X IO8CFlVmL、动物双歧杆菌937活菌数为2.32 X 108CFU/mL。
[0086] ⑦苦荞麦粉:燕麦粉比例为5:4。测得的总活菌数为6.38 X IO8CFUAiL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为4.23 X 108CFU/mL、动物双歧杆菌937活菌数为2.12 X 108CFU/mL。
[0087] ⑧苦荞麦粉:小麦粉比例为5:3，测得的总活菌数为6.35 X 108CFU/mL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为3.78 X 108CFU/mL、动物双歧杆菌937活菌数为2.57 X 108CFU/mL。
[0088] ⑨苦荞麦粉:玉米粉比例为5 : 3。测得的总活菌数为4.5 X 108CFU/mL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为2.45 X 108CFU/mL、动物双歧杆菌937活菌数为2.05 X IO8CFlVmL。
[0089] ⑩苦荞麦粉:黑豆粉比例为5 : 5，测得的总活菌数为8.7 X 108CFU/mL，其中植物乳 杆菌TK9活菌数为5.3 X IO8CFlVmL、动物双歧杆菌937活菌数为3.4 X 108CFU/mL。
[0090] 实施例2:益生菌液态发酵饮料工艺-益生菌接种量的确定
[0091 ]其他条件同实施例1，按甜荞麦粉:大豆粉的比例为5g: 2g配置发酵培养基，将植物 乳杆菌按以下接菌量I X 1〇6、5 X 106、1 X 107、5X IO7CFUAiL分别接种于发酵培养基中，同时 接种动物双歧杆菌，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌量比为1:1，进行发酵，发酵完成之后 测定发酵液中的益生菌活菌数。
[0092] 结果如表11所示:最佳接种量植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937均为5 X IO7CFU/ mL。测得的总活菌数为3.5 X 109CFU/mL，其中植物乳杆菌TK9活菌数为2.7 X 109CFU/mL、动物 双歧杆菌937活菌数为8. Ol X IO8CFlVmL。
[0093]表11不同接种量下的活菌数(CFU/mL)
[0095]其他条件同实施例1，按苦荞麦粉:大豆粉比例为5g:3g配置发酵培养基，按不同的 接种量同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937进行发酵，发酵完成之后测定发酵液中 的益生菌活菌数。
[0096] 结果如下表所示:最佳接种量植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937均为5 X IO7CFU/ mL。测得的总活菌数为3.93 X 109CFU/mL，其中植物乳杆菌TK9活菌数为3.04 X 109CFU/mL、动 物双歧杆菌937活菌数为8.94 X IO8CFlVmL。
[0097] 衷12不同接种量下的活菌数（CFU/mL)
[0100] 实施例3:益生菌液态发酵饮料工艺-培养时间的确定
[0101] (1)在接种量已优化的条件下，液态发酵培养基选择每100mL水中添加5g甜荞麦粉 和2g的大豆粉。
[0102] 植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937甘油管按1%接种于甜荞麦活化培养基进行一 次活化，均活化20h，然后均按10 % (v/v)的接种量转接入二次活化培养基中，二次活化24h。 在液态发酵培养基中同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937种子液混菌发酵。
[0103] 使得接入到甜荞麦液态发酵培养基中植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937,均为5 X IO7CFUAiL ; pH7 · 2-7 · 4，培养温度37 °C，混菌发酵4、10、16、22、28、34、40h，分别对发酵液 中的益生菌活菌数进行检测。
[0104] 结果:混菌液态发酵最佳培养时间为28h，总培养时间为72h(见附图1)。
[0105] (2)在接种量已优化的条件下，液态发酵培养基选择每100mL水中添加5g苦荞麦粉 和3g的大豆粉。
[0106]植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937甘油管按1 %接种于苦荞麦活化培养基进行一 次活化，均活化20h，然后均按10 % (v/v)的接种量转接入二次活化培养基中，二次活化24h。 在液态发酵培养基中同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937种子液混菌发酵。
[0107] 使得接入到苦荞麦液态发酵培养基中植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937,均为5 X IO7CFUAiL ; pH7 · 2-7 · 4，培养温度37 °C，混菌发酵4、10、16、22、28、34、40h，分别对发酵液 中的益生菌活菌数进行检测。
[0108] 结果:混菌液态发酵最佳培养时间为28h，总培养时间为72h(见附图2)。
[0109] 实施例4: 一种荞麦液态发酵饮料的制备方法
[0110] (1)荞麦脱壳后，将荞麦和谷物清洗，分别磨粉过100目筛得荞麦粉和谷物粉； (2)配制活化培养基:每100mL水中添加5g甜荞麦粉;对活化培养基进行灭菌，条件 为，12rC，20min;
[0112] (3)配制发酵培养基：：每100mL水中添加5g甜荞麦粉，2g的大豆粉，121 °C灭菌 20min；
[0113] (4)菌种活化，植物乳杆菌和动物双歧杆菌甘油管分别按1%接种于活化培养基进 行活化，PH7.2-7.4，控制温度为37 °C ;分别活化20h后，按10 % (v/v)的接菌量再次转接活化 培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
[0114] (5)益生菌发酵:将植物乳杆菌按接菌量为5 X IO7CFUAiL接种于发酵培养基中，同 时接种动物双歧杆菌，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌量体积比为1:1，混菌液态发酵28h， 温度为37 °C，pH维持在7.2~7.4;
[0115] (6)发酵结束后发酵液经乳化后加稳定剂，稳定剂按与发酵液质量体积比进行添 加，添加量为羧甲基纤维素钠0.9 %，黄原胶0.4%，乳化剂0.9 % ;添加与发酵液质量体积比 为8%的蔗糖进行调酸调香;在65°C，30MPa的条件下均质一次，经90°C杀菌15min，得荞麦发 酵饮料。
[0116]实施例5:益生菌液态发酵饮料工艺-发酵前后培养基活性成分变化(黄酮类物质、 总酚类、ACEI、GABA、抗氧化物含量、还原糖、氨基态氮、DPPIV抑制活性(DIR)、α-葡糖苷酶抑 制活性(a-GIR))
[0117] 下述分别以甜荞麦和苦荞麦为发酵基质进行实验：：
[0118] (1)荞麦脱壳后，将荞麦清洗，磨粉过100目筛；
[0119] (2)配制活化培养基:每100mL水中添加5g甜荞麦粉/苦荞麦粉(活化培养基中的荞 麦粉与发酵培养基中的荞麦粉种类一致）；对活化培养基进行灭菌，条件为，121°C，20min;
[0120] (3)配制发酵培养基:每100mL水中添加5g甜荞麦粉/苦荞麦粉，121°C灭菌20min;
[0121] (4)菌种活化，植物乳杆菌和动物双歧杆菌甘油管分别按1%接种于活化培养基进 行活化，PH7.2-7.4，控制温度为37 °C ;分别活化20h后，按10 % (v/v)的接菌量再次转接活化 培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
[0122] (5)益生菌发酵:将植物乳杆菌按接菌量为I X IO7CFUAiL接种于发酵培养基中，同 时接种动物双歧杆菌，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌量体积比为1:1，混菌液态发酵24h， 温度为37°C，pH维持在7.2~7.4,混菌发酵时菌种分别为:TK9、937混菌发酵和植物乳杆菌 CGMCCNo. 1.6971、动物双歧杆菌CGMCC No. 1.3003混菌发酵，以单菌发酵做对照，单菌发酵 时接种量为2 X IO7CFUAiL。
[0123] 利用高效液相法测定GABA和黄酮类物质含量;利用福林酚反应测定总酚类含量； 利用活氧指数法(ORAC)测定抗氧化物含量;参考Hyun和Shin[2]等人文章中的测定方法来测 定ACEI含量（Utilization of bovine blood plasma proteins for the production of angotensin I converting enzyme inhibitory peptides·);参考李蒙蒙和吴薇等人文章 《不同酵母固态发酵对荞麦抗氧化成分及抗氧化作用的影响》中的测定方法测定抗氧化活 性；利用DNS法测定还原糖含量；利用水合印三酮法测定氨基态氮含量；参考Zhu zeng和 Junyi等人文章 〈〈Screening for potential novel probiotic Lactobacillus strains based on high dipeptidyl peptidase IV anda-glucosidase inhibitory activity〉〉中 的测定方法测定DPPIV和α-葡糖苷酶抑制活性。
[0124]表13:甜荞麦液态发酵前后活性成分变化
[0126]表14:苦荞麦液态发酵前后活性成分变化
[0128]由以上两个数据可知，荞麦在经过液态发酵后活性成分都有提高，其中苦荞更为 明显。GABA含量在经发酵后有所增加，甜荞麦混菌发酵后GABA含量达到为1.69mg/ml，苦荞 麦混菌发酵后GABA含量达到为2.2mg/ml，均高于单菌发酵，该成分对高血压有缓解和治疗 的功效;经混菌发酵后，甜荞麦饮料汇中的总酚类含量达到1.85mg GAE/ml，苦荞麦饮料汇 中的总酚类含量达到9.78mg GAE/ml，均高于单菌发酵，总酚类物质都具有抗氧化功效;混 菌后发酵后抗氧化活性明显提高，其中以甜荞麦为发酵基质经益生菌发酵后是其发酵前的 两倍，以苦荞麦为发酵基质经益生菌发酵后达到其发酵前的三倍，同时明显高于单菌发酵； 苦荞麦中黄酮类含量明显高于甜荞麦中，约为5倍，经混菌发酵后，苦荞麦中黄酮类物质含 量明显增加，含量达到0.85mg/ml，甜荞麦中含量也有所增加，达到0.34mg/ml，黄酮类物质 具有降血糖血脂和抗氧化功效，苦荞中的黄酮类物质的主要成分为芦丁 (70%-90%)，其在 其它谷物中几乎没有，临床上主要用于糖尿病、高血糖的辅助治疗;荞麦混菌发酵饮料中 ACEI含量相对于单菌发酵增加显著，其中以甜荞麦为发酵基质经益生菌发酵后达12.7%， 以苦荞麦为发酵基质经益生菌发酵后达到22%，具有良好的降血压的功效。荞麦混菌发酵 饮料中还原糖和氨基态氮含量相对于未发酵荞麦以及单菌发酵增加显著，其中还原糖含量 较发酵前均增加六倍以上，氨基态氮含量较发酵前均增加八倍以上。荞麦混菌发酵饮料相 对于未发酵荞麦以及使用单菌发酵，其DPPIV和α-葡糖苷酶抑制活性高。DPPIV对肠促胰岛 素激素具有水解作用，抑制了这些激素发挥正常的作用，DPPIV抑制剂能够抑制DPPIV活性， 降低其对肠促胰岛素激素具有水解作用，对降血糖起到积极作用。α-葡萄糖苷酶可以从非 还原末端水解低聚糖和多聚糖的α-1，4_葡萄糖苷键，对其抑制可以防止血糖升高。结果表 明利用混菌发酵可以开发出营养更丰富的荞麦功能性饮料。
[0129] 实施例6:固态发酵工艺-菌种接种量的确定
[0130] (1)甜荞麦固态培养基不同接种量下的活菌数
[0131] 植物乳杆菌ΤΚ9和动物双歧杆菌937甘油管分别按1 %接种于甜荞麦活化培养基 (每100mL水中添加5g甜荞麦粉，灭菌条件为，121°C，20min;)进行一次活化;均活化20h，然 后均按10% (v/w)的接菌量转接入二次活化培养基（同一次活化培养基）中，二次活化24h， 在甜荞麦固态发酵培养基(荞麦脱壳后，按荞麦和水料水比为1:1 (质量体积比）制得固态发 酵培养基，灭菌条件为，121°c，20min)中；同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937种子 液进行混菌发酵，混菌固态发酵24h，37°C，共计培养时间68h，pH维持在7.2~7.4。对发酵后 培养基中的益生菌活菌数进行检测。
[0132] 接种量:植物乳杆菌(L.plantarum TK9)和动物双歧杆菌937(B.animalis 937)两 株菌的接种量分别均为:I X 107CFU/mL;5 X IO7CFlVmL; I X 108CFU/mL;5X 108CFU/mL。
[0133] 结果如下表所示：植物乳杆菌（L.plantarum TK9)和动物双歧杆菌937 (B.animalis 937)两株菌的最佳接种量为lX108CFU/g，即测得所得甜荞麦益生菌发酵功 能性食品中的总活菌数为1.82 X IO9CFlVg。其中，植物乳杆菌活菌数为1.28 X IO9CFlVg，动 物双歧杆菌的活菌数达到5 · 37 X 108CFU/g。
[0134] 表15甜荞麦固态发酵不同接种量下的活菌数(CFU/g)
[0136] (2)苦荞麦固态培养基不同接种量下的活菌数
[0137] 植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937甘油管分别按1 %接种于苦荞麦活化培养基 (每100mL水中添加5g苦荞麦粉，灭菌条件为，121°C，20min)，进行一次活化，均活化20h，然 后均按10% (v/w)的接菌量转接入二次活化培养基（同一次活化培养基）中，二次活化24h， 在苦荞麦固态发酵培养基(料水比为：1:1)中同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937 种子液进行混菌发酵。
[0138] 接种量与培养条件：植物乳杆菌（L.plantarum TK9)和动物双歧杆菌937 (B.animalis 937)两株菌的接种量分别均为：I X 107CFU/g;5 X 107CFU/g; I X 108CFU/g; 5 X IO8CFlVg。混菌固态发酵24h，37 °C，共计培养时间68h，pH维持在7.2~7.4。对发酵后培养基 中的益生菌活菌数进行检测。
[0139] 结果如下表所示:最佳接种量为IX 108CFU/g，即测得所得苦荞麦益生菌发酵功能 性食品中的总活菌数为2.26 X 109CFU/g。其中，植物乳杆菌活菌数为1.56 X 109CFU/g，动物 双歧杆菌的活菌数达到6.95 X 108CFU/g。
[0140] 表16:甜荞麦固态发酵不同接种暈下的活菌数(CFU/g)
[0142] 实施例7:固态发酵工艺-加水量的确定
[0143] (1)甜荞麦固态发酵培养基:甜荞麦和水的比例（质量体积比）分别为1:0.75，1:1， 1:1.25，1:1.5，1:1.75，1:2。即甜荞麦4(^对应30、40、50、60、70、801111水。
[0144] 植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937甘油管分别按1 %接种于甜荞麦活化培养基 (每100mL水中添加5g甜荞麦粉，灭菌条件为，121°C，20min)，进行一次活化，均活化20h，然 后均按10% (v/w)的接菌量转接入二次活化培养基（同一次活化培养基）中，二次活化24h， 在甜荞麦固态发酵培养基中同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937种子液，接种量分 别均为I X IO8CFUAiL，进行混菌发酵。培养条件:24h，37°C，共计培养时间68h，pH维持在7.2 ~7.4。对发酵后培养基中的益生菌活菌数进行检测。
[0145] 结果如下表所示:最佳料水比为1:1.5,即测得所得甜荞麦益生菌发酵功能性食品 中的总活菌数为3.49 X 109CFU/g。其中，植物乳杆菌活菌数为2.34 X IO9CFlVg，动物双歧杆 菌的活菌数达到1.15 X 109CFU/g。
[0146] 表17甜荞麦与水的配比为1:0.75-2时，益生菌活菌数(CFU/g)
LUT4?j (W古乔衷;回态友醉堉乔S :古乔衷:和7K的比例分别艿I: U . Yb，I: I，1: 1.2b，1: 1 · 5，1:1 · 75，1:2。即苦荞麦40g对应30、40、50、60、70、80ml水。
[0149] 植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937甘油管分别按1 %接种于苦荞麦活化培养基 (每100mL水中添加5g苦荞麦粉，灭菌条件为，121°C，2()min)进行一次活化，均活化20h，然后 均按10 % (v/w)的接菌量转接入二次活化培养基（同一次活化培养基）中，二次活化24h，在 苦荞麦固态发酵培养基中同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937种子液，接种量分别 均为I X 108CFU/mL，进行混菌发酵。培养条件:24h，37°C，共计培养时间68h，pH维持在7.2~ 7.4。对发酵后培养基中的益生菌活菌数进行检测。
[0150] 结果如下表所示:最佳料水比为1:1.5,即测得所得苦荞麦益生菌发酵功能性食品 中的总活菌数为3.49 X 109CFU/g。其中，植物乳杆菌活菌数为2.34 X 109CFU/mL，动物双歧杆 菌的活菌数达到1.15 X 109CFU/mL。
[0151] 表18苦荞麦与水的配比为1:0.75-2时，益生菌活菌数(CFU/g)
[0153]实施例8:固态发酵工艺-培养时间的确定
[0154] (1)植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937甘油管分别按1 %接种于甜荞麦活化培养 基(每100mL水中添加5g甜荞麦粉，灭菌条件为，121°C，20min)进行一次活化，均活化20h，然 后均按10% (v/w)的接菌量转接入二次活化培养基（同一次活化培养基）中，二次活化24h， 在料水比已经优化的甜荞麦固态发酵培养基中同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌 937种子液，接种量分别均为I X IO8CFlVg，进行混菌发酵。分别混菌发酵12、18、24、30、36、 42、4811，37°(：，共计培养时间56-9211，？!1维持在7.2~7.4。对发酵后培养基中的益生菌活菌 数进行检测。
[0155] 结果见附图3所示：最佳培养时间为接种后再混菌发酵30h，即最佳总发酵时间为 74h〇
[0156] (2)植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937甘油管分别按1 %接种于苦荞麦活化培养 基(每100mL水中添加5g苦荞麦粉，灭菌条件为，121°C，20min)进行一次活化，均活化20h，然 后均按10% (v/w)的接菌量转接入二次活化培养基（同一次活化培养基）中，二次活化24h， 在料水比1:1.5的苦荞麦固态发酵培养基中同时接种植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937种 子液，接种量分别均为I X IO8CFUAiL，进行混菌发酵。分别混菌发酵12、18、24、30、36、42、 48h，37°C，共计培养时间56-92h，pH维持在7.2~7.4。对发酵后培养基中的益生菌活菌数进 行检测。
[0157] 结果见附图4所示：最佳培养时间为接种后再混菌发酵30h，即最佳总发酵时间为 74h〇
[0158] 实施例9:固态发酵工艺-发酵前后培养基活性成分变化（黄酮类物质、总酚类、 ACEI、GABA、抗氧化物含量、还原糖、氨基态氮）
[0159] 下述分别以甜荞麦和苦荞麦为发酵基质进行实验：
[0160]植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937甘油管分别按1%接种于荞麦活化培养基进行 一次活化，均活化20h，然后均按10 % (v/w)的接菌量转接入二次活化培养基（同一次活化培 养基）中，二次活化24h，在料水比为1:1.5的荞麦固态发酵培养基中同时接种植物乳杆菌 TK9和动物双歧杆菌937种子液，接种量分别均为I X 108CFU/g，进行混菌发酵，30h，37°C，共 计培养时间74h，pH维持在7.2~7.4，单菌发酵时接种量为2 X IO8CFlVg，其他条件不变。
[0161 ]甜荞麦活化培养基:甜荞麦脱壳、清洗、磨粉过100目筛后得甜荞麦粉，每100mL水 中添加5g甜荞麦粉，灭菌条件为，121°C，20min
[0162] 甜荞麦固态发酵培养基:甜荞麦脱壳后按甜荞麦和水按质量体积比为：1: 1.5制得 固态发酵培养基;灭菌条件为，121°C，20min;
[0163] 苦荞麦活化培养基:苦荞麦脱壳、清洗、磨粉过100目筛后得苦荞麦粉，每100mL水 中添加5g苦荞麦粉，灭菌条件为，121°C，20min
[0164] 苦荞麦固态发酵培养基:苦荞麦脱壳后，按苦荞麦和水按质量体积比为：1: 1.5制 得固态发酵培养基;灭菌条件为，121°C，20min;
[0165] 将植物乳杆菌TK9和动物双歧杆菌937替换为CGMCCNo. 1.6971和CGMCC No. 1.3003 重复上述混菌发酵实验。
[0166] 利用高效液相法测定GABA和黄酮类物质含量;利用福林酚反应测定总酚类含量； 利用活氧指数法(ORAC)测定抗氧化物含量;参考Hyun和Shin [2]等人文章中的测定方法来测 定ACEI含量;参考李蒙蒙和吴薇等人文章中的测定方法测定抗氧化活性;利用DNS法测定还 原糖含量;利用水合印三酮法测定氨基态氮含量;参考Zhu zeng和Junyi[3]等人文章中的测 定方法测定DPPIV和α-葡糖苷酶抑制活性。
[0167] 表19甜荞麦固态发酵前后活性成分变化
[0170]由表19可知，甜荞麦经固态发酵后，其GABA含量有所提高，混菌发酵后达到 4.213mg/g，高于两种菌株单独发酵；混菌发酵后的总酚类以及抗氧化物含量分别达到 11.47mg GAE/g和0.177mmol TE/g，均高于单菌发酵;混菌后发酵后抗氧化活性明显提高， 达到发酵前的四倍，同时明显高于单菌发酵;发酵后，黄酮类物质含量也显著增加，其中混 菌发酵效果高于单菌发酵，含量达到3.94mg/g;混菌发酵后ACEI含量为45.6 %，高于两种益 生菌单独发酵的结果。荞麦混菌发酵食品中还原糖和氨基态氮含量相对于未发酵荞麦以及 单菌发酵增加显著，更有利于营养物质的吸收利用。甜荞麦经固态发酵后，DPPIV和α-葡糖 苷酶抑制活性提高，其中混菌发酵效果要优于单菌。
[0171]表20苦荞麦固态发酵前后活性成分变化
L〇174」由表20可知，苦荞麦固态发酵食品中GABA含量增加显著，可达8.130mg/g，高于单 菌发酵;混菌发酵后的总酚类以及抗氧化物含量分别达到59.7mg GAE/g和0.683mmol TE/ g，均高于单菌发酵;混菌后发酵后抗氧化活性明显提高，达到发酵前的三倍，同时明显高于 单菌发酵;经混菌发酵后，黄酮类物质相对于单菌发酵增加显著，含量达到14. lmg/g;荞麦 发酵食品中ACEI含量相对于单菌发酵增加显著，达97.9%。苦荞麦混菌发酵饮料中还原糖 和氨基态氮含量相对于未发酵荞麦以及单菌发酵增加显著。甜荞麦经固态发酵后，DPPIV和 葡糖苷酶抑制活性提高，其中混菌发酵效果要优于单菌。因而，混菌发酵相较单菌发酵能 更好地开发荞麦食品的保健功能。
【主权项】
1. 一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述荞麦发酵食品是以荞麦或荞麦与谷物为发酵 基质，采用植物乳杆菌和动物双歧杆菌经液态或固态混菌发酵后制备而得;所述荞麦为甜 荞麦或苦荞麦。2. 如权利要求1所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)TK9,保藏编号为CGMCC No. 11891;所述动物双歧杆菌为动物 双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937,保藏编号为CGMCC No. 11892。3. 如权利要求1或2所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述荞麦发酵食品以液态 发酵法制备，具体如下： (1) 荞麦脱壳后，将荞麦和谷物清洗，分别磨粉过100目筛得荞麦粉和谷物粉； (2) 配制活化培养基:每100mL水中添加5g荞麦粉;对活化培养基进行灭菌，条件为，121 °C ,20min； (3) 配制发酵培养基:每100mL水中添加5-10g荞麦粉，0-5g的谷物粉;所述谷物为燕麦、 小麦、玉米、大豆、黑豆中的至少一种，121°C灭菌20min; (4) 菌种活化，植物乳杆菌和动物双歧杆菌甘油管分别按1%接种于活化培养基进行活 化，pH7.2-7.4，控制温度为37°C ;分别活化20h后，按10 % (v/v)的接菌量再次转接活化培养 基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液； (5) 益生菌发酵:将植物乳杆菌按接菌量为I X 106-5 X IO7CFUAiL接种于发酵培养基中， 同时接种动物双歧杆菌，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌量体积比为1-10:1-10，混菌液态 静置发酵4~40h，温度为37°C，pH维持在7.2~7.4; (6) 发酵结束后发酵液经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、杀菌后即得荞麦益生菌液 态发酵饮料。4. 如权利要求3所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述发酵培养基的组成为:每 100mL水中添加5g甜荞麦粉，2g的大豆粉。5. 如权利要求3所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述植物乳杆菌和动物双歧杆 菌接种量均为5 X 107CFU/mL。6. 如权利要求3所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述混菌液态发酵时间为28h。7. 如权利要求1或2所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述荞麦发酵食品以固态 发酵法制备，具体如下： (1) 荞麦脱壳后，按荞麦和水按质量体积比为：1: 〇. 75-2制得固态发酵培养基； (2) 对固态发酵培养基进行灭菌，条件为，12?Γ，20π?η; (3) 菌种活化:植物乳杆菌和动物双歧杆菌甘油管分别按1%接种于活化培养基进行活 化，pH7.2-7.4，控制温度为37°C ;分别活化20h后，按10 % (v/v)的接菌量再次转接活化培养 基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液;活化培养基:每100mL水中添加5g荞麦粉;对 活化培养基进行灭菌，条件为，121°C，20min;将荞麦磨粉过100目筛得荞麦粉； (4) 将二级种子液接入固态发酵培养基中，使得每克固态培养基中植物乳杆菌接菌量 为I X 107-5 X 108CFU/g，同时接种动物双岐杆菌，植物乳杆菌和动物双歧杆菌接菌比例保持 1-10:1-10； (5) 混菌固态发酵12~48h，37°C，pH维持在7.2~7.4;发酵结束后，放置于-80°C预冻24 小时后，放入真空冷冻干燥机内24小时，制得荞麦益生菌固态发酵食品。8. 如权利要求7所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述植物乳杆菌和动物双歧杆 菌接菌量均为lXl〇8CFU/g。9. 如权利要求7所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述固态发酵培养基中荞麦与 水的质量体积比为1:1.5。10. 如权利要求7所述的一种荞麦发酵食品，其特征在于，所述混菌发酵时间为30h。
【文档编号】A23L2/84GK105942084SQ201610283290
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】王海宽, 路福平, 彭晨苗, 王伟
【申请人】天津科技大学