本发明涉及遗传工程领域，尤其涉及一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。
背景技术：
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。现有公开技术中(Metab.Eng.2014，23:42-52)，构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1)在基本培养基中生长缓慢，并且乙酰氨基葡萄糖产量相比于在复合培养基中显著降低。
已有研究表明，6-磷酸果糖在GlmS的催化作用下生成6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN6P)的过程受到由glmS核酶开关介导的严格反馈控制，该步是GlcNAc合成途径中的重要限速反应，具体调控过程如下：当胞内GlcN6P积累时，其能够与glmS核酶开关结合，激活核酶开关对glmS基因转录产物进行自切割；3’端mRNA切割部分因切割形成的5’-OH端被RNA酶J1特异性识别，在RNA酶J1作用下mRNA被进一步降解，造成glmS基因的mRNA无法翻译，降低glmS基因的表达；而当GlcN6P浓度较低时，glmS基因转录产物可正常翻译。因此，要想过量合成GlcNAc，必须解除glmS核酶对GlcNAc合成关键酶glmS在转录水平的抑制调控。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，通过同源重组敲除氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶，阻断了宿主菌胞内6-磷酸氨基葡萄糖反馈抑制氨基葡萄糖合成酶基因glmS的表达，促进乙酰氨基葡萄糖积累。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
在一方面，本发明提供了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，通过敲除枯草芽孢杆菌中调控氨基葡萄糖合成酶表达的glmS核酶，并插入终止子和组成型启动子序列而得到。
进一步地，枯草芽孢杆菌为BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，是通过以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达得到。其构建方法可参阅文献“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作进一步描述。
进一步地，glmS核酶的编码基因如NCBI-Gene ID:8302932所示。
进一步地，终止子为trp终止子、ybc终止子或T7终止子。
进一步地，组成型启动子为P43启动子、PsrfA启动子或PaprE启动子。
在另一方面，本发明还提供了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建glmS核酶编码基因敲除框，所述敲除框依次包括glmS核酶编码基因上游同源臂、终止子、抗性基因、组成型启动子和glmS核酶编码基因下游同源臂序列；
(2)将步骤(1)得到的glmS核酶编码基因敲除框转化枯草芽孢杆菌，通过筛选、PCR验证并筛选出抗性消除菌株后得到重组枯草芽孢杆菌。
进一步地，在步骤(1)中，glmS核酶编码基因敲除框中还包括glmS核酶的编码基因的上、下游同源臂引物序列。
进一步地，在步骤(1)中，抗性基因为壮观霉素抗性基因spc、博来霉素抗性基因zeo、卡那霉素抗性基因kan或氨苄青霉素抗性基因amp。
进一步地，在步骤(1)中，终止子为trp终止子、ybc终止子或T7终止子。
进一步地，在步骤(1)中，glmS核酶的编码基因如NCBI-Gene ID:8302932所示。
进一步地，在步骤(1)中，组成型启动子为P43启动子、PsrfA启动子或PaprE启动子。
进一步地，在步骤(2)中，枯草芽孢杆菌为BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1(以下实施例中简称为BSGN)，是通过以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达得到。其构建方法可参阅文献“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作进一步描述。
进一步地，本发明的重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乙酰氨基葡萄糖中的应用。
进一步地，发酵使用的发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、Na2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、胸腺嘧啶以及色氨酸。
在一具体实施例中，发酵培养基以其重量为基准，包括以下成分：葡萄糖2.0g/L、Na2HPO4 7.1g/L、KH2PO4 1.35g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0.25g/L、FeSO4·7H2O 1.0g/L、MnSO4·4H2O 0.1g/L、胸腺嘧啶0.01g/L以及色氨酸0.01g/L。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明是以枯草芽孢杆菌(BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1)作为出发菌株，通过同源重组敲除氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶，阻断了宿主菌胞内6-磷酸氨基葡萄糖反馈抑制氨基葡萄糖合成酶基因glmS的表达，促进乙酰氨基葡萄糖积累；本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可提高使用基本培养基时乙酰氨基葡萄糖的产量，其比生长速率和乙酰氨基葡萄糖的产量能够分别达到0.84h-1和321.3mg/L，分别是敲除前菌株的2.09倍和2.57倍，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础；本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
说明书附图
图1图示了本发明敲除了glmS核酶对细胞生长和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)产生的影响结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因上下游序列，设计敲除框扩增引物：
扩增上游同源臂引物为GlmS-F TCTGCTATTATGCTGATGAACAC，如SEQ ID No.1所示；GlmS-1R GGAATACTCAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTT，如SEQ ID No.2所示。
扩增筛选标记表达盒引物为GlmS-2F GGAAAAAGGCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTGAGTATTCCAAACTGGACACATGG，如SEQ ID No.3所示；GlmS-2R ATCAAACTAAGCGCCCGGAAAAAGGCAGCCCGCCAGTGTTTCCACCATTTTTTCAATTT，如SEQ ID No.4所示。
扩增P43启动子引物为GlmS-3F GAAACACTGGCGGGCTGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTTTGATAGGTGGTATGTTTTCGC，如SEQ ID No.5所示；GlmS-3RCGTCCCCTCCTACATGTTTTTATAATGGTACCGCTATCAC，如SEQ ID No.6所示。
扩增下游同源臂引物为GlmS-4F GTGATAGCGGTACCATTATAAAAACATGTAGGAGGGGACG，如SEQ ID No.7所示；GlmS-R TTCTGTCTCAAGTCCTCCATTGACG，如SEQ ID No.8所示。
运用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增上游同源臂、P43启动子和下游同源臂，并从载体PDGREF中扩增含有壮观霉素抗性基因的筛选标记表达盒。其中，引物GlmS-2F中插入trp终止子序列(AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTT)，如SEQ ID No.27所示。再利用融合PCR技术将上游同源臂、筛选标记、P43启动子、下游同源臂序列进行融合，得到氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因敲除框。利用引物GlmS-F/GlmS-R扩增敲除框，将得到的敲除框转化枯草芽孢杆菌BSGN，该枯草芽孢杆菌是通过以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达得到。利用PCR验证筛选并确定正确转化子，再进行诱导表达mazF，筛选出抗性消除菌株，确认氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNR。
本实施例中，扩增条件如下：
98℃，预变性3min；(98℃，变性10s，55℃，退火5s；68℃，延伸1.2min)*34个循环；68℃，延伸5min。
实施例2
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因上下游序列，设计敲除框扩增引物：
扩增上游同源臂引物为GlmS-F TCTGCTATTATGCTGATGAACAC，如SEQ ID No.1所示；GlmS-1R GGAATACTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTT，如SEQ ID No.9所示。
扩增筛选标记表达盒引物为GlmS-2F GGAAAAAGGCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGAGTATTCCAAACTGGACACATGG，如SEQ ID No.10所示；GlmS-2R ATCAAACTAAGCGCCCGGAAAAAGGCAGCCCGCCAGTGTTTCCACCATTTTTTCAATTT，如SEQ ID No.11所示。
扩增P43片段引物为GlmS-3F GAAACACTGGCGGGCTGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTTTGATAGGTGGTATGTTTTCGC，如SEQ ID No.12所示；GlmS-3R CGTCCCCTCCTACATGTTTTTATAATGGTACCGCTATCAC，如SEQ ID No.13所示。
扩增下游同源臂引物GlmS-4F GTGATAGCGGTACCATTATAAAAACATGTAGGAGGGGACG，如SEQ ID No.14所示；GlmS-R TTCTGTCTCAAGTCCTCCATTGACG，如SEQ ID No.8所示。
运用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增上游同源臂、P43启动子和下游同源臂，并从载体PDGREF中扩增含有壮观霉素抗性基因的筛选标记表达盒。其中，引物GlmS-2F(SEQ ID No.10)中插入T7终止子序列(TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTT)，如SEQ ID No.28所示。再利用融合PCR技术将上游同源臂、筛选标记、P43启动子、下游同源臂序列进行融合，得到氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因敲除框。利用引物GlmS-F/GlmS-R扩增敲除框，将得到的敲除框转化枯草芽孢杆菌BSGN，利用PCR验证筛选并确定正确转化子，再进行诱导表达mazF，筛选出抗性消除菌株，即得glmS核酶敲除菌株。
本实施例中，扩增条件如下：
98℃，预变性3min；(98℃，变性10s，55℃，退火5s；68℃，延伸1.2min)*34个循环；68℃，延伸5min。
实施例3
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因上下游序列，设计敲除框扩增引物：
扩增上游同源臂引物为GlmS-F TCTGCTATTATGCTGATGAACAC，如SEQ ID No.1所示；GlmS-1R GGAATACTCAAAAAAAACACCCGCTTGTATAACGAGCGGATGGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTT，如SEQ ID No.15所示。
扩增筛选标记表达盒引物为GlmS-2F GGAAAAAGGCCATCCGCTCGTTATACAAGCGGGTGTTTTTTTTGAGTATTCCAAACTGGACACATGG，如SEQ ID No.16所示；GlmS-2RTGACTATGTGTACCGCGCAAAAACCAGTGTTTCCACCATTTTTTCAATTT，如SEQ ID No.17所示。
扩增PsrfA启动子片段引物为Psrf-F AAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTGGTTTTTGCGCGGTACACATAGTCA，如SEQ ID No.18所示；Psrf-R CGTCCCCTCCTACATGTTTTCCCCTAATCTTTATAAGCAGTGAAC，如SEQ ID No.19所示。
扩增下游同源臂引物GlmS-4F GTTCACTGCTTATAAAGATTAGGGGAAAACATGTAGGAGGGGACG，如SEQ ID No.20所示；GlmS-R TTCTGTCTCAAGTCCTCCATTGACG，如SEQ ID No.8所示。
运用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增上游同源臂、PsrfA启动子和下游同源臂，并从载体PDGREF中扩增含有壮观霉素抗性基因的筛选标记表达盒。其中，引物GlmS-2F(SEQ ID No.16)中插入ybc终止子序列(CATCCGCTCGTTATACAAGCGGGTGTTTTTTTT)，如SEQ ID No.29所示。再利用融合PCR技术将上游同源臂、筛选标记、PsrfA启动子、下游同源臂序列进行融合，得到氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因敲除框。利用引物GlmS-F/GlmS-R扩增敲除框，将得到的敲除框转化枯草芽孢杆菌BSGN，利用PCR验证筛选并确定正确转化子，再进行诱导表达mazF，筛选出抗性消除菌株，即得glmS核酶敲除菌株。
本实施例中，扩增条件如下：
98℃，预变性3min；(98℃，变性10s，55℃，退火5s；68℃，延伸1.2min)*34个循环；68℃，延伸5min。
实施例4
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因上下游序列，设计敲除框扩增引物：
扩增上游同源臂引物为GlmS-F TCTGCTATTATGCTGATGAACAC，如SEQ ID No.1所示；GlmS-1R GGAATACTCAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCTTTTTCCGGGCGCTTAGTT，如SEQ ID No.21所示。
扩增筛选标记表达盒引物为GlmS-2F GGAAAAAGGCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTGAGATTCTACCGTTCGTATAGC，如SEQ ID No.22所示；GlmS-2R GCGAAAACATACCACCTATCACTACCGTTCGTATAATGTATGC，如SEQ ID No.23所示。
扩增P43启动子引物为GlmS-3F GCATACATTATACGAACGGTAGTGATAGGTGGTATGTTTTCGC，如SEQ ID No.24所示；GlmS-3R CGTCCCCTCCTACATGTTTTTATAATGGTACCGCTATCAC，如SEQ ID No.25所示。
扩增下游同源臂引物为GlmS-4F GTGATAGCGGTACCATTATAAAAACATGTAGGAGGGGACG，如SEQ ID No.26所示；GlmS-R TTCTGTCTCAAGTCCTCCATTGACG，如SEQ ID No.8所示。
运用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增上游同源臂、P43启动子和下游同源臂，并从载体P7Z6中扩增含博来霉素抗性基因的筛选标记表达盒。其中，引物GlmS-2F(SEQ ID No.22)中插入trp终止子序列(AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTT)，如SEQ ID No.27所示。再利用融合PCR技术将上游同源臂、筛选标记、P43启动子、下游同源臂序列进行融合，得到氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因敲除框。利用引物GlmS-F/GlmS-R扩增敲除框，将得到的敲除框转化枯草芽孢杆菌BSGN，利用PCR验证筛选并确定正确转化子，再进行诱导表达mazF，筛选出抗性消除菌株，即得glmS核酶敲除菌株。
本实施例中，扩增条件如下：
98℃，预变性3min；(98℃，变性10s，55℃，退火5s；68℃，延伸1.2min)*34个循环；68℃，延伸5min。
以上实施例使用的出发菌株BSGN，其构建方法可参阅文献“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作进一步描述。
实施例5
在37℃、200rpm下，培养实施例1构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNR 12h，所使用的种子培养基包括以下重量的各组分：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。然后以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下发酵30h。发酵培养基以其重量为基准，包括以下成分：葡萄糖2.0g/L、Na2HPO4 7.1g/L、KH2PO4 1.35g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0.25g/L、FeSO4·7H2O 1.0g/L、MnSO4·4H2O 0.1g/L、胸腺嘧啶0.01g/L以及色氨酸0.01g/L。测定发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量，乙酰氨基葡萄糖的测定方法如下：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，RID检测器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。
图1图示了本发明敲除了glmS核酶对细胞生长和GlcNAc产生的影响结果。其中图1a为以葡萄糖作为单一碳源的基本培养基中，对比菌株BSGN和本发明的glmS核酶敲除菌株BSGNR的细胞生长的比较结果，图1b为以葡萄糖作为单一碳源的基本培养基中，在摇瓶发酵系统中对比菌株BSGN和本发明的glmS核酶敲除菌株BSGNR的GlcNAc滴度的比较结果，图1c为以葡萄糖作为单一碳源的基本培养基中，摇瓶发酵系统中BSGN和BSGNR的特异性细胞生长速率和GlcNAc生产力的比较。从图中可以看出，本发明重组枯草芽孢杆菌BSGNR的比生长速率达到0.84h-1，其发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到321.3mg/L，分别是敲除前菌株的2.09倍和2.57倍。BSGNR的乙酰氨基葡萄糖产率为10.04mg/L/h，说明本发明通过敲除氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法
<160> 29
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物 GlmS-F
<400> 1
TCTGCTATTA TGCTGATGAA CAC 23
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物 GlmS-1R
<400> 2
GGAATACTCA AAAAAGCCCG CTCATTAGGC GGGCTGCCTT TTTCCGGGCG CTTAGTT 57
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 筛选标记表达盒引物GlmS-2F
<400> 3
GGAATACTCA AAAAAGCCCG CTCATTAGGC GGGCTGCCTT TTTCCGGGCG CTTAGTT 57
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 筛选标记表达盒引物GlmS-2R
<400> 4
ATCAAACTAA GCGCCCGGAA AAAGGCAGCC CGCCAGTGTT TCCACCATTT TTTCAATTT 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> P43启动子引物GlmS-3F
<400> 5
GAAACACTGG CGGGCTGCCT TTTTCCGGGC GCTTAGTTTG ATAGGTGGTA TGTTTTCGC 59
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> P43启动子引物GlmS-3R
<400> 6
CGTCCCCTCC TACATGTTTT TATAATGGTA CCGCTATCAC 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-4F
<400> 7
GTGATAGCGG TACCATTATA AAAACATGTA GGAGGGGACG 40
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-R
<400> 8
TTCTGTCTCA AGTCCTCCAT TGACG 25
<210> 9
<211> 77
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物GlmS-1R
<400> 9
GGAATACTCA AAAAACCCCT CAAGACCCGT TTAGAGGCCC CAAGGGGTTA TGCTAGCCTT 60
TTTCCGGGCG CTTAGTT 77
<210> 10
<211> 80
<212> DNA
<213> 筛选标记表达盒引物GlmS-2F
<400> 10
GGAAAAAGGC TAGCATAACC CCTTGGGGCC TCTAAACGGG TCTTGAGGGG TTTTTTGAGT 60
ATTCCAAACT GGACACATGG 80
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 筛选标记表达盒引物GlmS-2R
<400> 11
ATCAAACTAA GCGCCCGGAA AAAGGCAGCC CGCCAGTGTT TCCACCATTT TTTCAATTT 59
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> P43片段引物GlmS-3F
<400> 12
GAAACACTGG CGGGCTGCCT TTTTCCGGGC GCTTAGTTTG ATAGGTGGTA TGTTTTCGC 59
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> P43片段引物为GlmS-3R
<400> 13
CGTCCCCTCC TACATGTTTT TATAATGGTA CCGCTATCAC 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-4F
<400> 14
GTGATAGCGG TACCATTATA AAAACATGTA GGAGGGGACG 40
<210> 15
<211> 64
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物GlmS-1R
<400> 15
GGAATACTCA AAAAAAACAC CCGCTTGTAT AACGAGCGGA TGGCCTTTTT CCGGGCGCTT 60
AGTT 64
<210> 16
<211> 67
<212> DNA
<213> 筛选标记表达盒引物GlmS-2F
<400> 16
GGAAAAAGGC CATCCGCTCG TTATACAAGC GGGTGTTTTT TTTGAGTATT CCAAACTGGA 60
CACATGG 67
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 筛选标记表达盒引物GlmS-2R
<400> 17
TGACTATGTG TACCGCGCAA AAACCAGTGT TTCCACCATT TTTTCAATTT 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> PsrfA启动子片段引物Psrf-F
<400> 18
AAATTGAAAA AATGGTGGAA ACACTGGTTT TTGCGCGGTA CACATAGTCA 50
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> PsrfA启动子片段引物Psrf-R
<400> 19
CGTCCCCTCC TACATGTTTT CCCCTAATCT TTATAAGCAG TGAAC 45
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-4F
<400> 20
GTTCACTGCT TATAAAGATT AGGGGAAAAC ATGTAGGAGG GGACG 45
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> 上游同源臂引物GlmS-1R
<400> 21
GGAATACTCA AAAAAGCCCG CTCATTAGGC GGGCTGCCTT TTTCCGGGCG CTTAGTT 57
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 筛选标记表达盒引物GlmS-2F
<400> 22
GGAAAAAGGC AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTTGAGA TTCTACCGTT CGTATAGC 58
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 筛选标记表达盒引物GlmS-2R
<400> 23
GCGAAAACAT ACCACCTATC ACTACCGTTC GTATAATGTA TGC 43
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> P43启动子引物GlmS-3F
<400> 24
GCATACATTA TACGAACGGT AGTGATAGGT GGTATGTTTT CGC 43
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> P43启动子引物GlmS-3R
<400> 25
CGTCCCCTCC TACATGTTTT TATAATGGTA CCGCTATCAC 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 下游同源臂引物GlmS-4F
<400> 26
GTGATAGCGG TACCATTATA AAAACATGTA GGAGGGGACG 40
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> trp终止子
<400> 27
AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTT 26
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> T7终止子
<400> 28
TAGCATAACC CCTTGGGGCC TCTAAACGGG TCTTGAGGGG TTTTTT 46
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> ybc终止子
<400> 29
CATCCGCTCG TTATACAAGC GGGTGTTTTT TTT 33