本发明涉及遗传工程领域，尤其涉及一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。
背景技术：
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。启动子作为基因工程的工具，在菌株的代谢工程改造中具有重要作用。研究表明，关键基因的过量表达有时会给菌体本身带来压力，而基因的适度表达往往会取得更好的效果。葡萄糖激酶编码基因glck和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi是枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖合成途径的关键基因，在枯草芽孢杆菌基因组上实现乙酰氨基葡萄糖合成途径关键基因启动子的精细调控对进一步提高乙酰氨基葡萄糖合成效率与细胞生长性能具有现实意义。
鉴于上述原因，本发明人人积极加以创新研究，以期创建一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，使其具有产业上的利用价值。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。本发明的构建方法简单，便于操作，所构建的重组枯草芽孢杆菌通过控制glck和pgi基因的适度表达能够高产乙酰氨基葡萄糖，在代谢工程上具有良好的应用前景。
在一方面，本发明提供了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其由木糖诱导型启动子PxylA调控枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck表达和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi表达得到。
在一具体实施例中，本发明的高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌由木糖诱导型启动子PxylA替代枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck启动子序列和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子序列而得到。
进一步的，葡萄糖激酶编码基因glck如NCBI-Gene ID:938206所示。
进一步地，磷酸葡糖异构酶编码基因pgi如NCBI-Gene ID:937165所示。
在另一具体实施例中，木糖诱导型启动子PxylA调控glck和pgi表达所使用的枯草芽孢杆菌为BSGN6，BSGN6是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达而得到。枯草芽孢杆菌BSGN6的构建方法可参阅文献“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作进一步描述。
在另一方面，本发明还公开了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建包括木糖诱导型启动子PxylA的葡萄糖激酶编码基因glck启动子替换框，通过同源重组将glck启动子替换框中的木糖诱导型启动子PxylA替换枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck启动子序列；及
(2)构建包括木糖诱导型启动子PxylA的磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子替换框，通过同源重组将pgi启动子替换框中的木糖诱导型启动子PxylA替代步骤(1)中得到的枯草芽孢杆菌中的磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子序列，得到高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。
在一具体实施例中，在步骤(1)中，葡萄糖激酶编码基因glck启动子替换框还包括博来霉素抗性基因zeo，通过同源重组将glck启动子替换框中的博来霉素抗性基因zeo和木糖诱导型启动子PxylA替换枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck启动子序列，使葡萄糖激酶编码基因glck在木糖诱导型启动子PxylA下调控表达；并向枯草芽孢杆菌中转化质粒pDG148，促使其表达环化重组酶，以消除博来霉素抗性基因zeo。
在另一具体实施例中，在步骤(2)中，磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子替换框还包括博来霉素抗性基因zeo，通过同源重组将pgi启动子替换框中的博来霉素抗性基因zeo和木糖诱导型启动子PxylA替代步骤(1)中得到的枯草芽孢杆菌中的磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子序列，使葡萄糖激酶编码基因glck和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi均在木糖诱导型启动子PxylA下调控表达；并向枯草芽孢杆菌中转化质粒pDG148，促使其表达环化重组酶，以消除所述博来霉素抗性基因zeo，得到高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。
在又一具体实施例中，上述构建方法中所使用的枯草芽孢杆菌为BSGN6，BSGN6是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达而得到。枯草芽孢杆菌BSGN6的构建方法可参阅文献“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作进一步描述。
在又一方面，本发明还提供了一种上述高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌制备乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
在一具体实施例中，种子在35-37℃下在种子培养基中活化，活化后的种子在35-37℃下发酵培养。
进一步地，上述种子培养基包括以下成分：蛋白胨，酵母粉，氯化钠。
在一具体实施例中，种子培养基以其总重量为基准，由以下成分配制而成：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
进一步地，上述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。
在一具体实施例中，发酵培养基以其总重量为基准，包括以下成分：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙和10ml/L微量元素溶液。
进一步的，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。
更进一步地，微量元素溶液以其总重量为基准，包括以下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸在一具体实施例中，将活化后的种子以3％～：的接种量转入所述发酵培养基。
在一具体实施例中，诱导剂为木糖，每升发酵培养基的木糖用量为5g，发酵过程中葡萄糖的浓度维持在3-7g/L。
借由上述方案，与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，该构建方法以枯草芽孢杆菌(BSGN6)作为出发菌株，通过基于Cre/lox系统PCR介导的基因组整合技术，以木糖诱导型启动子PxylA调控葡萄糖激酶编码基因glck表达和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi表达，控制glck和pgi基因的适度表达，从而能够提高枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖产量。加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的作进一步详细描述。然而，应理解的是，以下实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明保护范围的限制。
实施例1
构建枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glck
根据对NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)葡萄糖激酶编码基因glck进行序列分析获得glck启动子区域，根据其上下游序列设计启动子替换框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：glck-L-F：5’-AGATCCTGATGTTTTTCTTGCTCGAA-3’；glck-L-R:5’-AGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGACAAAAAAGCCAGCTTCCTTTCC-3’；
右臂上下游引物分别为：glck-R-F:5’-CACTTAAATCAAAGGGGGAAATGTACAATGGACGAGATATGGTTTGCGG-3’；glck-R-R:5’-TTAACAATTTTGATGTTTCAGCCATTC-3’。
采用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增替换框中包含的左臂和右臂，扩增的具体条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/1min，30个循环；72℃延伸10min，12℃保温。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列(NCBI accession no.EU541492)设计引物，扩增博来霉素抗性基因zeo，上下游引物分别为：glck-Z-F:5’-GGAAAGGAAGCTGGCTTTTTTGTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCT-3’；glck-Z-R:5’-AGGAACGTACAGACGGCTTAAAAGCGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-3’。
根据NCBI上公布的pSTOP1622质粒序列，设计引物，扩增启动子序列PxylA，上下游引物分别为：glck-P-F:5’-GTCGACCTGCAGGCATGCAAGCGCTTTTAAGCCGTCTGTACGTTCCT-3’和glck-P-R:5’-CCGCAAACCATATCTCGTCCATTGTACATTTCCCCCTTTGATTTAAGTG-3’，扩增的具体条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/1min，30个循环；72℃延伸10min，12℃保温。通过融合PCR方法，将左臂、博来霉素抗性基因、启动子序列和右臂融合为替换框。通过测序确认glck启动子替换框构建成功。为不影响后续实验进行，向重组枯草芽孢杆菌中转化质粒pDG148，促使其表达环化重组酶，消除博来霉素抗性基因zeo。
将构建好的glck启动子替换框转化枯草芽孢杆菌(BSGN6)，通过博来霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，确认葡萄糖激酶编码基因glck启动子序列已整合替换为木糖诱导型启动子PxylA，得到枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glck。
实施例2
构建重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glck-PxylA-pgi
根据对NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)磷酸葡糖异构酶编码基因pgi进行序列分析获得pgi启动子区域，根据其上下游序列设计启动子替换框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：pgi-L-F：5’-ATTTGGAGGTTTTACTATGGAAAATTTCA-3’；pgi-L-R：5’-AGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCCTTCAAGCGCAATTTCTTTATCT-3’；右臂上下游引物分别为：pgi-R-F:5’-CACTTAAATCAAAGGGGGAAATGTACAATGACGCATGTACGCTTTGACTACTC-3’和pgi-R-R:5’-GCTTCTCTACGTTCAGGACCGTTTC-3’。运用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增替换框中包含的左臂和右臂,扩增的具体条件98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/1min，30个循环；72℃延伸10min，12℃保温。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列(NCBI accession no.EU541492)，设计引物，扩增博来霉素抗性基因zeo，上下游引物分别为：pgi-Z-F:5’-AGATAAAGAAATTGCGCTTGAAGGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCT-3’和pgi-Z-R:5’-AGGAACGTACAGACGGCTTAAAAGCGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-3’。
根据NCBI上公布的pSTOP1622质粒序列设计引物，扩增启动子序列PxylA，上下游引物分别为：pgi-P-F:5’-GTCGACCTGCAGGCATGCAAGCGCTTTTAAGCCGTCTGTACGTTCCT-3’和pgi-P-R：5’-GAGTAGTCAAAGCGTACATGCGTCATTGTACATTTCCCCCTTTGATTTAAGTG-3’，扩增的具体条件98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/1min，30个循环；72℃延伸10min，12℃保温。通过融合PCR方法，将左臂、博来霉素抗性基因、启动子序列和右臂融合为pgi启动子替换框。为不影响后续实验进行，向重组枯草芽孢杆菌中转化质粒pDG148，促使其表达环化重组酶，消除博来霉素抗性基因zeo。
将构建好的pgi启动子替换框转化实施例1中得到的枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glck，通过博来霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，确认磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子序列已整合替换为木糖诱导型启动子PxylA，得到重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glck-PxylA-pgi。
实施例3
采用实施例2构建的重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖
种子培养基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
发酵培养基的成分包括：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙和10ml/L微量元素溶液。
其中微量元素溶液以其重量为基准包括如下组份：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。
在种子培养基中将重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glck-PxylA-pgi于37℃、220rpm下培养9h，然后将种子以3％的接种量转入发酵培养基，于3L发酵罐中37℃、600rpm条件下发酵培养72h，发酵过程中，葡萄糖浓度维持在7g/L。发酵31h结束时，检测发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。结果表明，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到35.12g/L，比对照菌株BSGN6(22.86g/L)提高了52.6％，乙酰氨基葡萄糖对细胞得率和乙酰氨基葡萄糖生产强度达到1.91g/g cell和0.49g/L/h，分别比对照菌株提高了65.4％和36.7％(对照菌株的分别为0.66g/g cell和0.31g/L/h)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。