一株枯草芽孢杆菌菌株及其在酱油发酵增香中的应用的制作方法

本发明属于食品发酵领域，具体涉及一株可以用于酱油发酵增香的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜热、好氧、产芽孢的革兰氏阳性细菌，具有较好的蛋白酶及淀粉酶分泌能力，在发酵中能促进原料中蛋白质及淀粉的降解。酱油发酵主要原料是富含蛋白质的大豆及淀粉质原料小麦，枯草芽孢杆菌在大豆及小麦为原料的酱油发酵过程中添加将有利于原料中大分子物质的降解。

人们对枯草芽孢杆菌的研究及应用较早，但对其在发酵食品中的应用报道较少。在酱香型白酒酿造中，枯草芽孢杆菌及其酶的作用可以产生香气前体物质，提高原料的利用率。枯草芽孢杆菌的利用对于发展高档酱香型白酒、提高白酒质量和产酒率具有重要意义。尽管枯草芽孢杆菌在酿酒行业中已有所应用，但对于枯草芽孢杆菌菌种在发酵食品中的应用研究基本还是空白，而枯草芽孢杆菌中具体菌株的研究应用更是没有。

另外，我国是酱油的第一生产和消费大国，但目前随着酱油发酵工艺封闭程度的提高，酱油发酵工程中自然接种的风味菌越来越匮乏，从而影响酱油酱香风味物质的形成，导致酱油风味单薄。因此，如何改善酿造酱油的不足和缺陷，已成为本领域人员关注的一个焦点，但迄今为止，本领域中还很少有人提及枯草芽孢杆菌在酱油酿制中的具体应用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种可应用于酱油发酵的枯草芽孢杆菌菌株以及该菌株在酱油发酵增香中的应用，应用后可以显著提高酱油中的氨基酸态氮、挥发性风味成分含量，使酱油酱香浓郁、品质优良。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一株枯草芽孢杆菌菌株，该枯草芽孢杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其命名为枯草芽孢杆菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015791。该枯草芽孢杆菌CS1.03的保藏日期为2015年12月29日，保藏单位的地址位于中国湖北武汉市武汉大学校内。

上述本发明提供的枯草芽孢杆菌CS1.03是从传统的高盐稀态发酵(晒露法)酱醪中分离筛选出一株独特的优势菌。该枯草芽孢杆菌CS1.03的鉴定过程包括：对枯草芽孢杆菌CS1.03进行形态学鉴定、生理生化试验，初步确定为芽孢杆菌属；再对枯草芽孢杆菌CS1.03进行16S rDNA序列鉴定分析，确证此菌株为枯草芽孢杆菌种。

经过我们的检测分析，本发明的上述枯草芽孢杆菌CS1.03可以产高酶活的淀粉酶、蛋白酶、几丁质酶以及乳酸等有机酸。我们创造性地将此菌株添加于酱油发酵中，发现可以有效改善发酵酱油的品质问题，从而达到提升产品品质、提高氨基氮含量及丰富酱油风味的效果。

基于上述研究，作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的枯草芽孢杆菌菌株在酱油发酵增香中的应用。

更优选的，所述的应用具体包括以下步骤：

(1)将制酱油的成品曲与盐水(食盐溶液)按一定质量比混合均匀，然后保温发酵，制得酱醅；

(2)将所述枯草芽孢杆菌CS1.03的菌液喷洒到上述酱醅中，常温下进行一阶段发酵；一阶段发酵完成后开始用盐水进行淋浇发酵，最后得到生酱油。

上述的应用中，优选的，所述步骤(1)中，盐水的质量分数为16％～18％，所述制酱油的成品曲与盐水的混合质量比为1∶1.1～1.2。

上述的应用中，优选的，所述步骤(1)中，保温发酵的温度为40℃～42℃，保温发酵的时间为7～10d。

上述的应用中，优选的，所述步骤(2)中，一阶段发酵和淋浇发酵的温度为35℃～38℃，淋浇发酵的时间为3～4d，一阶段发酵和淋浇发酵的总共发酵时间为15～18d。

上述的应用中，优选的，所述步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌CS1.03的菌液的添加量为1.0～3.0×10⁹个/Kg成品曲。

上述的应用中，优选的，所述步骤(2)中，盐水的质量分数为22％～24％，所述制酱油的成品曲与用于淋浇的盐水的混合质量比为1∶0.8～1.0，且每天循环淋浇一次。

上述的应用中，优选的，所述枯草芽孢杆菌CS1.03的菌液的制备包括以下步骤：

准备5～10g牛肉膏、10～15g蛋白胨、160～180g氯化钠，5g磷酸氢二钾，1000mL蒸馏水，pH 7.0～7.2；高温灭菌(例如121℃灭菌30min)制得培养基；然后将所述枯草芽孢杆菌CS1.03的种子液接入培养基，34℃～38℃好氧培养38～45h。

在上述本发明的应用中，我们通过对添加枯草芽孢杆菌CS1.03发酵的酱油和普通发酵酱油进行氨基酸态氮、挥发性风味成分含量进行测定分析，结果均表明添加本发明枯草芽孢杆菌CS1.03发酵后的酱油氨基酸态氮、挥发性风味成分含量明显高于普通酱油，酱香浓郁、品质优良。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03首次从酱油发酵酱醪(醅)中分离到，且目前尚未报道枯草芽孢杆菌菌株单独添加于酱油发酵进行应用的实例。通过添加本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03的发酵酱油相比于未添加的发酵酱油，本发明产品的氨基酸态氮含量、挥发性风味成分含量都有明显的提高。

生物材料保藏情况说明

本发明涉及的保藏生物材料为一株枯草芽孢杆菌菌株，该枯草芽孢杆菌菌株被命名为枯草芽孢杆菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015791，保藏单位的地址位于中国湖北武汉市武汉大学校内。该枯草芽孢杆菌CS1.03的保藏日期为2015年12月29日。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03接种培养24h后的平板图照片。

图2为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03的革兰氏染色图。

图3为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03的淀粉水解试验图。

图4为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03分子学鉴定试验中16S rDNA序列片段的电泳图。

图5为本发明的枯草芽孢杆菌CS1.03分子学鉴定试验中的系统发育树。

图6为本发明枯草芽孢杆菌CS1.03发酵制得的酱油与普通酱油的氨基酸态氮含量结果对比图。

图7为本发明枯草芽孢杆菌CS1.03发酵制得的酱油挥发性风昧成分的总离子流图。

图8为未添加本发明枯草芽孢杆菌CS1.03发酵制得的酱油挥发性风昧成分的总离子流图。

图9为本发明枯草芽孢杆菌CS1.03在用于发酵酱油时的工艺流程简图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一、菌株的分离筛选

一株本发明的枯草芽孢杆菌菌株，该枯草芽孢杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其命名为枯草芽孢杆菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015791。该枯草芽孢杆菌CS1.03的保藏日期为2015年12月29日，保藏单位的地址位于中国湖北武汉市武汉大学校内。

上述本发明提供的枯草芽孢杆菌CS1.03的筛选过程主要包括：在传统的高盐稀态发酵(晒露法)酱醪和低盐固态发酵酱醅中取样，培养；通过对两份样品进行细菌菌相分析，最终从传统的高盐稀态发酵(晒露法)样品中分离筛选出一株独特的优势菌——枯草芽孢杆菌CS1.03。

二、菌株的鉴定

将从传统的高盐稀态发酵(晒露法)酱醪中分离筛选出一株独特的枯草芽孢杆菌CS1.03进行鉴定，其过程包括：对枯草芽孢杆菌CS1.03进行形态学鉴定、生理生化试验，初步确定为芽孢杆菌属；再对枯草芽孢杆菌CS1.03进行16S rDNA序列鉴定分析(鉴定结果见说明书后所附序列表)，确证此菌株为枯草芽孢杆菌种。

1.形态学鉴定

(1)将枯草芽孢杆菌CS1.03接种于高盐牛肉膏蛋白胨培养基平板，32℃培养24h后(参见图1)，菌落表面干燥，有褶皱状突起。

(2)对枯草芽孢杆菌CS1.03菌落进行革兰氏染色，油镜观察菌株形态特征，发现此菌为革兰氏阳性菌(参见图2)，有芽孢，菌体个体形态呈杆状，大小约为0.5×2μm～0.5×3μm。

上述的高盐牛肉膏蛋白胨培养基的制备步骤为：准备5g牛肉膏，10g蛋白胨，180g氯化钠，15-20g琼脂，1000mL蒸馏水，pH 7.0；121℃灭菌30min。

2.生理生化特征试验研究

(1)进行葡萄糖发酵产酸产气试验、过氧化氢酶试验和V.P.试验，结果如下表1所示，该试验表明枯草芽孢杆菌CS1.03产酸不产气，产过氧化氢酶，V.P.试验为阳性；符合芽孢杆菌的特征。

表1 枯草芽孢杆菌CS1.03的大分子试验结果

注：+代表结果呈阳性；-代表结果呈阴性。

上述葡萄糖发酵产酸产气试验培养基的制备步骤包括：准备1.0g磷酸氢二铵、0.2g氯化钾、0.2g硫酸镁、0.2g酵母膏、0.008g溴甲酚紫和1000mL蒸馏水，pH自然；121℃灭菌30min；灭菌后加入5g葡萄糖。

上述V.P.试验培养基的制备步骤包括：准备7g蛋白胨，5g葡萄糖，5g氯化钠，1000mL蒸馏水，pH自然；121℃灭菌30min。

(2)进行淀粉水解试验，如图3所示，通过透明圈的大小判断出本发明枯草芽孢杆菌CS1.03的淀粉酶酶活高。

上述淀粉水解培养基的制备步骤包括：在牛肉膏蛋白胨培养基的基础上加入1％的可溶性淀粉；121℃灭菌30min。

(3)进行耐盐性试验，结果如下表2所示，由表2可以看出，本发明枯草芽孢杆菌CS1.03可以耐受18％(w/v)的NaCl浓度，适宜在高盐发酵中应用。

表2 枯草芽孢杆菌CS1.03的耐盐性试验

注：+代表能够生长；++代表生长状况较好；+++代表生长状况良好。

上述耐盐性试验培养基的制备步骤包括：在牛肉膏蛋白胨培养基的基础上添加不同质量的氯化钠即可。

3.分子学鉴定

(1)引物设计：采用细菌通用引物进行16S rDNA的PCR扩增，引物设计如下：

Forward primer：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

Reverse primer：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

两引物间距离约为1500bp。

(2)DNA模板制备：从培养好的枯草芽孢杆菌CS1.03斜面挑取少量菌体于50μL菌落PCR模板提取缓冲体系中，80℃变性15min，4000r/min离心10～15min，取上清液作为模板。

(3)PCR获取16S rDNA片段：

反应体系：50uL反应体系中共含有PCR Premix 25μL，Forward primer(20pmol/uL)0.5μL，Reverse primer(20pmol/uL)0.5μL，模板1μL，16S-free H₂O 23μL。

反应条件：预变性94℃5min；变性94℃1min、退火55℃1min、延伸72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸5min。

(4)电泳：采用琼脂糖电泳检测PCR产物结果。

电泳条件：90V恒压，时间20-30min，结果见图4。

(5)16S rDNA序列测序

该枯草芽孢杆菌CS1.03的16S rDNA基因序列测定结果如后附的序列表1。

(6)测序结果比对

测序结果通过GenBank中的Blast搜索数据库进行序列的同源性比较分析，并用MAGE4.0软件构建系统进化树如图5所示。结果表明枯草芽孢杆菌CS1.03与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的亲缘关系最近(登录号：GQ305125.1)，相似度为100％。

二、菌株的应用

经过我们的检测分析，本发明的上述枯草芽孢杆菌CS1.03可以产高酶活的淀粉酶、蛋白酶、几丁质酶以及乳酸等有机酸。我们创造性地将此菌株添加于酱油发酵中，发现可以有效改善发酵酱油的品质问题，从而达到提升产品品质、提高氨基氮含量及丰富酱油风味的效果。

一种上述的枯草芽孢杆菌菌株在酱油发酵增香中的应用，如图9所示，该应用具体包括以下步骤：

(1)将制酱油的成品曲与质量分数16％的盐水按1:1.2(w/w)的质量比混合均匀，40℃～42℃保温发酵10d，制得酱醅；

(2)将上述的枯草芽孢杆菌CS1.03的菌液喷洒到上述酱醅中，36℃下进一步发酵18d；

上述枯草芽孢杆菌CS1.03的菌液的制备包括以下步骤：准备5g牛肉膏，10g蛋白胨，160g氯化钠，5g磷酸氢二钾，1000mL蒸馏水，pH 7.0；121℃灭菌30min；然后将耐盐的枯草芽孢杆菌种子液接入培养基，36℃好氧培养40h；

该枯草芽孢杆菌CS1.03的菌液的添加量为2.3×10⁹个/Kg原料；

(3)淋浇：在添加枯草芽孢杆菌CS1.03发酵4天后用质量分数23％的盐水进行淋浇，发酵原料成品曲与用于淋浇的盐水的混合质量比为1∶0.8(w/w)，每天循环淋浇一次，最后得到生酱油。

(4)酱油品质分析

氨基酸态氮含量分析：取添加CS1.03发酵的生酱油和未添加发酵的生酱油进行氨基酸态氮含量测定，测定方法参照中华人民共和国国家标准GB/T 5009.39-2003中的4.2.1。结果如图6所示，表明添加复合风味菌剂发酵的酱油氨基酸态氮的含量比未添加的普通发酵酱油高19.3％。

挥发性风味成分分析：取添加CS1.03发酵酱油(Sample)和未添加CS1.03发酵酱油(Contrast)进行GC-MS检测，两种酱油的挥发性风味成分的总离子流色谱图分别为图7、图8。比较分析两种酱油样品中的酸、酚、醇、酯、醛酮、杂环类主要化合物含量，其结果见表3。由表3可知，添加CS1.03的发酵酱油样品中酚类物质含量比未添加CS1.03的样品增加了105％，醛酮类化合物含量增加75.6％，酸、酯类化合物也稍有增加，而醇及杂环类化合物的含量则降低。究其原因，是由于CS1.03在发酵过程中产生了愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、麦芽酚、糠醛等物质，致使酚及醛酮类化合物含量增加；而其代谢过程产生的乙酸等有机酸，随着发酵的进行进一步与醇类物质形成酯类，导致醇类物质含量降低，而酸与酯类物质含量微升。从挥发性风味物质种类及含量的增加可以看出，枯草芽孢杆菌CS1.03对酱油风味物质的形成贡献较大，通过其在酱油发酵过程中的代谢作用，促进了发酵向有益的方向发展，提升了酱油的风味。

表3 两种酱油中挥发性风味成分的相对含量比较

<110> 长沙理工大学

<120> 一株枯草芽孢杆菌菌株及其在酱油发酵增香中的应用

<160> 3

<210> 1

<211> 1464bp

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 1

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatgggca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260

caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg 1440

ccgaaggtgg gacagatgat tggg 1464

<210> 2

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

Agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaggaggtga tccagccgca 20