本发明涉及一种利拉鲁肽的制备方法，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：利拉鲁肽由诺和诺德公司研制，是一种人胰高糖素样多肽-1(GLP-1)的类似物，与人天然GLP-1同源性达97％，具有GLP-1受体激动作用。具有降血糖、减轻体质量、促进胰岛细胞再生及保护心血管系统等多重作用，可与其他抗糖尿病药物联用治疗II型糖尿病。利拉鲁肽历经10年研发，于2009年7月和2010年1月分别在欧盟和美国获准上市，并于2011年3月在中国上市。诺和诺德基于其开发的独特的脂肪酸链修饰技术平台，通过将天然GLP-1分子的34位赖氨酸取代为精氨酸、且在26位赖氨酸上增加一个16碳脂肪酸侧链而获得利拉鲁肽。由于该脂肪酸侧链的存在，致使该药与血浆白蛋白的可逆性非共价键结合增加，这不仅使得该药能暂时躲避二肽基肽酶-4(DPP-4)的降解作用，还使得该药因与白蛋白形成可逆的复合体而缓慢释放，导致其体内吸收与分布过程减缓，半衰期较天然GLP-1明显延长，给药频率达到一天一次。最新LEADER研究显示，利拉鲁肽使得心血管死亡风险降低22％，是第一种有心血管获益的GLP-1药物。利拉鲁肽的分子式为C172H265N43O51，分子量为3751.20，CAS号为204656-20-2，其结构如下所示：NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(Nα-Palmitoyl-γ-Glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH诺和诺德研制的生产工艺为通过基因重组技术，利用酵母菌发酵获得利拉鲁肽。专利CN104592381公布了一种通过基因重组技术，以大肠杆菌为载体，发酵获得利拉鲁肽的工艺。总体来说，基因重组的技术难度较大，工艺复杂，生产成本较高。且由于发酵获得的GLP-1(7-37)-OH的侧链处于未保护状态，在连接侧链的反应过程中易产生杂质，从而导致纯化更加困难，工艺更加复杂。随着固相合成法制备多肽技术的成熟，越来越多的利拉鲁肽合成工艺被开发出来。CN102286092、CN103145828和CN103980358等专利报道了利用Fmoc保护策略，逐步偶联的固相合成方法制备利拉鲁肽。由于利拉鲁肽序列中有15个疏水性氨基酸，在偶联过程中树脂的收缩较为严重，易产生缺失肽，导致收率降低。同时粗肽中与产品性质相近的杂质较多，纯化非常困难。因此，在合成过程中控制杂质的产生，减少产品纯化的次数，提供一种收率高、周期短的利拉鲁肽制备方法具有重要的现实意义。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明提供一种利拉鲁肽的制备方法。该方法为片段缩合法，具有收率较高、合成周期短、稳定性好等优点，适于大规模的工业生产。本发明的目的在于提供一种利拉鲁肽的制备方法，该方法包括如下步骤：1)固相合成利拉鲁肽的4个肽片段。其中肽片段1为利拉鲁肽主链序列中的第1-9位氨基酸；肽片段2为利拉鲁肽主链序列中的第10-14位氨基酸；肽片段3为利拉鲁肽主链序列中的第15-23位氨基酸；肽片段4为利拉鲁肽主链序列中的第24-31位氨基酸。2)将各肽片段逐步偶联，得到全保护的利拉鲁肽主链肽。3)脱除第20位赖氨酸的保护基，并完成侧链的连接，得到全保护的利拉鲁肽肽树脂。4)经裂解、纯化、冻干，得到利拉鲁肽。上述方法具体包括如下步骤：1)采用固相合成法，以树脂为载体，在缩合剂与活化剂的作用下，分别合成利拉鲁肽的肽片段1、2、3、4的树脂；其中肽片段1为利拉鲁肽主链序列中的第1-9位氨基酸；肽片段2为利拉鲁肽主链序列中的第10-14位氨基酸；肽片段3为利拉鲁肽主链序列中的第15-23位氨基酸；肽片段4为利拉鲁肽主链序列中的第24-31位氨基酸；2)在裂解液的作用下，分别将肽片段1-3从树脂上裂解下来，得到全保护肽片段1-3；脱去肽片段4树脂上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，将肽片段3与肽片段4树脂偶联，得到肽片段5树脂；脱去肽片段5树脂上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，将肽片段2与肽片段5树脂偶联，得到肽片段6树脂；脱去肽片段6树脂上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，将肽片段1与肽片段6树脂偶联，得到利拉鲁肽主链肽树脂。3)脱去利拉鲁肽主链肽树脂第20位的赖氨酸侧链保护，并连接侧链得到利拉鲁肽肽树脂。4)在裂解液的作用下，裂解利拉鲁肽肽树脂得到利拉鲁肽粗肽；利拉鲁肽粗肽经纯化、冻干，得到利拉鲁肽。优选的，步骤1)固相合成肽片段使用的树脂为王树脂或2-氯三苯甲基氯树脂，更优选为2-氯三苯甲基氯树脂。其中使用树脂的替代度优选0.3～0.8mmol/g，更优选0.4～0.6mmol/g。优选的，步骤1)固相合成肽片段选用的缩合剂与活化剂的组合为DIC与HOBt的混合物、DIEA与TBTU的混合物或DIEA与HATU的混合物，更优选DIEA与TBTU的混合物。缩合剂与活化剂的摩尔比为1.5～2.0:1，使用的溶剂为DMF，脱Fmoc保护液为体积百分比为20％哌啶的DMF溶液。优选的，步骤2)所述的裂解液为体积百分比为1％TFA的DCM溶液。优选的，步骤2)所述偶联选用的缩合剂与活化剂的组合为DIC与HOBt的混合物、DIEA与TBTU的混合物，更优选DIC与HOBt的混合物，缩合剂与活化剂的摩尔比为1.0～1.5:1。优选的，步骤3)所述的脱去赖氨酸侧链Dde保护的试剂为水合肼与DMF的混合物，二者的体积比为1:(10～13)。优选的，步骤4)所述的裂解试剂为TFA、EDT、PhSMe、TIS与H2O的混合物；上述TFA、EDT、PhSMe、TIS与H2O的体积比为(80～85):(3～6):(3～5):(1～2):(2～4)。优选的，步骤4)所述的纯化步骤包括反相高效液相色谱纯化和调节等电点析出、沉降。上述方法，的一些优选方案具体包括如下步骤：1)在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Asp(Otbu)-OH与替代度为0.4～0.6mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Gly-树脂载体。然后加入DIEA/TBTU，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ala-OH、BOC-His(trt)-OH，得到肽片段1树脂BOC-His(trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-树脂；在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Leu-OH与替代度为0.4～0.6mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Leu-树脂载体。然后加入DIEA/TBTU，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Val-OH，得到肽片段2树脂Fmoc-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-树脂；在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Ile-OH与替代度为0.4～0.6mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Ile-树脂载体。然后加入DIEA/TBTU，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH，得到肽片段3树脂Fmoc-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-树脂；在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Gly-OH与替代度为0.4～0.6mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Gly-树脂载体。然后加入DIEA/TBTU，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Ala-OH，得到肽片段4树脂Fmoc-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；2)使用体积百分比为1％TFA的DCM溶液作为裂解试剂，分别对肽片段1、2、3树脂进行裂解，得到全保护的肽片段1、肽片段2、肽片段3；使用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱去肽片段4树脂上的氨基保护基，将肽片段3以DIC与HOBt的混合物活化后，加入到上述树脂的DMF溶液中，反应得到肽片段5树脂；使用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱去肽片段5树脂上的氨基保护基，将肽片段2以DIC与HOBt的混合物活化后，加入到上述树脂的DMF溶液中，反应得到肽片段6树脂；使用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱去肽片段6树脂上的氨基保护基，将肽片段1以DIC与HOBt的混合物活化后，加入到上述树脂的DMF溶液中，反应得到利拉鲁肽主链肽树脂；3)使用体积比为1:13的水合肼与DMF混合溶液，脱去利拉鲁肽主链肽树脂第20位的赖氨酸的Dde保护。随后将Fmoc-Glu-OtBu与20位的赖氨酸偶联，脱去Fmoc保护后，再加入棕榈酰氯，完成侧链连接。4)使用TFA、EDT、PhSMe、TIS与H2O体积比为85:5:4:2:4的混合溶液为裂解液，裂解利拉鲁肽肽树脂，得到利拉鲁肽粗肽；利拉鲁肽粗肽经反相高效液相色谱纯化后，调节溶液pH值至等电点，析出产品后，离心沉降，冻干，得到利拉鲁肽。本专利所使用的的英文缩写释义：缩写及英文释义Fmoc9-茐甲氧羰基Boc叔丁氧羰基tBu叔丁基trt三苯甲基Pbf2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基Dde1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基DMFN,N-二甲基甲酰胺DIEAN,N-二异丙基乙胺DICN,N-二异丙基碳二亚胺DCM二氯甲烷TBTUO-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸HOBt1-羟基苯并三唑HATU2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯TFA三氟乙酸PhSMe苯甲硫醚EDT1,2-乙二硫醇PhOH苯酚TIS三异丙基硅烷本发明有益效果：本发明通过技术优化，提供了一种效率高、成本低、收率较高、适合于工业化生产的利拉鲁肽的制备方法，其优点主要体现在：1)本发明所述工艺稳定，制得的利拉鲁肽，纯度可达到99.5％以上，总收率可达到40％以上；2)本发明所述的工艺可以4个多肽片段同时进行合成，可有效的缩短合成周期，提高生产效率。3)由于利拉鲁肽肽链过长、疏水性氨基酸较多，易产生缺失肽。本发明所采用的多片段合成法，可减少缺失肽的产生，其主要杂质不是缺失肽，而是未偶联的片段，杂质与主成分的氨基酸序列相差较多，使得产品更易于纯化。4)粗肽纯化后的缓冲液，采用调节pH值至等电点析出的方法脱盐，相对于采用色谱柱脱盐的方法，本发明的方法避免了硅胶吸附问题，减少了产品损失，收率更高。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。实施例1：本实施例提供了一种利拉鲁肽的制备方法，按照如下步骤进行制备：1、肽片段制备1.1肽片段1的制备称取替代度为1.2mmol/g树脂300g(0.36mol)，加入至多肽合成反应器中，加入2LDCM溶胀树脂30分钟，用DCM洗涤一次。称取119.3gFmoc-Asp(Otbu)-OH(0.29mol)和69.8gDIEA(0.54mol)用DCM溶解，加入上述反应器中，反应1.5小时后抽干，用DCM洗涤1次。加入体积比为10:1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30分钟。抽干溶剂，DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Asp(Otbu)-2-氯-三苯甲基树脂，经检测，树脂替代度为0.45mmol/g。称取Fmoc-Asp(Otbu)-2-氯-三苯甲基树脂360g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Asp(Otbu)-2-氯-三苯甲基树脂。称取Fmoc-Ser(tbu)-OH(2eq)、TBTU(2eq)和DIEA(2eq)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，随后再向反应器中加入DIEA(1eq)，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Fmoc-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-2-氯-三苯甲基树脂。重复上述脱Fmoc和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ala-OH、BOC-His(trt)-OH的偶联，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段1树脂。用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段1树脂1小时，过滤除去树脂，将滤液旋蒸至原体积的1/4，随后加入至10L乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到256.3g肽片段1：BOC-His(trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)，纯度95.2％，收率94.8％。1.2肽片段2的制备称取替代度为1.2mmol/g树脂300g(0.36mol)，加入至多肽合成反应器中，加入2LDCM溶胀树脂30分钟，用DCM洗涤一次。称取102.5gFmoc-Leu-OH(0.29mol)和69.8gDIEA(0.54mol)用DCM溶解，加入上述反应器中，反应1.5小时后抽干，用DCM洗涤1次。加入体积比为10:1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30分钟。抽干溶剂，DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂，经检测，树脂替代度为0.50mmol/g。称取Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂360g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到Leu-2-氯-三苯甲基树脂。称取Fmoc-Tyr(tbu)-OH(2eq)、TBTU(2eq)和DIEA(2eq)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，随后再向反应器中加入DIEA(1eq)，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。重复上述脱Fmoc和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Val-OH的偶联，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段2树脂。用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段2树脂1小时，过滤除去树脂，将滤液旋蒸至原体积的1/4，随后加入至5L乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到131.8g肽片段2：Fmoc-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu，纯度96.8％，收率95.9％。1.3肽片段3的制备称取替代度为1.2mmol/g树脂300g(0.36mol)，加入至多肽合成反应器中，加入2LDCM溶胀树脂30分钟，用DCM洗涤一次。称取102.5gFmoc-Ile-OH(0.29mol)和69.8gDIEA(0.54mol)用DCM溶解，加入上述反应器中，反应1.5小时后抽干，用DCM洗涤1次。加入体积比为10:1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30分钟。抽干溶剂，DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Ile-2-氯-三苯甲基树脂，经检测，树脂替代度为0.49mmol/g。称取Fmoc-Ile-2-氯-三苯甲基树脂360g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到Ile-2-氯-三苯甲基树脂。称取Fmoc-Phe-OH(2eq)、TBTU(2eq)和DIEA(2eq)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，随后再向反应器中加入DIEA(1eq)，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Phe-Ile-2-氯-三苯甲基树脂。重复上述脱Fmoc和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH的偶联，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段3树脂。用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段3树脂1小时，过滤除去树脂，将滤液旋蒸至原体积的1/4，随后加入至10L乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到304.6g肽片段3：Fmoc-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(Otbu)-Phe-Ile，纯度95.7％，收率95.3％。1.4肽片段4的制备称取替代度为1.2mmol/g树脂300g(0.36mol)，加入至多肽合成反应器中，加入2LDCM溶胀树脂30分钟，用DCM洗涤一次。称取86.2gFmoc-Gly-OH(0.29mol)和69.8gDIEA(0.54mol)用DCM溶解，加入上述反应器中，反应1.5小时后抽干，用DCM洗涤1次。加入体积比为10:1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30分钟。抽干溶剂，DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂，经检测，树脂替代度为0.54mmol/g。称取Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂350g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到Gly-2-氯-三苯甲基树脂。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2eq)、TBTU(2eq)和DIEA(2eq)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，随后再向反应器中加入DIEA(1eq)，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。重复上述脱Fmoc和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Ala-OH的偶联，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段4树脂。2、肽片段的偶联取全保护的肽片段4树脂，加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到NH2-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂。称取98.8g肽片段3(57mmol)，10.4gHOBt(68mmol)，溶于适量DMF中，加入8.6gDIC(68mmol)搅拌活化5分钟，加入至反应器中，室温反应4小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的肽片段5树脂。加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到NH2-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂。称取42.1g肽片段2(57mmol)，10.4gHOBt(68mmol)，溶于适量DMF中，加入8.6gDIC(68mmol)搅拌活化5分钟，加入至反应器中，室温反应3.5小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的肽片段6树脂。加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到NH2-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂。称取90.6g肽片段1(57mmol)，10.4gHOBt(68mmol)，溶于适量DMF中，加入8.6gDIC(68mmol)搅拌活化5分钟，加入至反应器中，室温反应3.5小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的利拉鲁肽主链肽树脂。3、脱保护与侧链的连接向上述全保护的利拉鲁肽主链肽树脂中加入1L水合肼与DMF混合溶液(体积比1:13)，室温下搅拌15分钟，脱去利拉鲁肽主链肽树脂第20位的赖氨酸的Dde保护，随后用DMF洗涤6次。称取48.5gFmoc-Glu-OtBu(114mmol)、36.6gTBTU(114mmol)和14.7gDIEA(114mmol)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，随后再向反应器中加入7.4gDIEA(57mmol)，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次。称取29.2g棕榈酸(114mmol)、36.6gTBTU(114mmol)和22.1gDIEA(171mmol)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩4次，真空干燥，得到利拉鲁肽肽树脂241g。4、裂解及纯化取上述利拉鲁肽肽树脂241g，加入2.5L裂解液(TFA：EDT：PhSMe：TIS：H2O体积比为85:5:4:2:4)，室温下搅拌反应2.5小时，过滤，收集滤液，树脂用少量TFA洗涤3次，滤液合并后加入至20L预冷的无水乙醚中，静置沉降2小时。过滤，滤饼用适量的无水乙醚洗涤3次，真空干燥，得到利拉鲁肽粗肽101.6g，纯度73.4％，粗肽收率82.2％。取利拉鲁肽粗品，加入20L纯化水搅拌，用氨水调节溶液pH值至8～8.5之间，搅拌直至产品完全溶解。随后用0.45μm滤膜过滤，待纯化。纯化条件：50*250mm色谱柱，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，检测波长220nm，流动相A为0.1％TFA/水溶液，流动相B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为50～60ml/min，梯度为35％B～75％B，循环进样纯化，收集主峰。将纯化合格的产品合并，加入适量的稀氨水调节溶液的pH值至4.9，析出白色的固体，搅拌30分钟后，离心除去上清液，固体用预冷的纯化水洗涤3次，随后分散至适量的纯化水中，冻干，得到利拉鲁肽纯品37.9g，纯度99.6％，纯化收率为50.6％，总收率41.6％。实施例2与实施例1的区别在于：步骤1中Fmoc-Asp(Otbu)-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.32mmol/g；Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.31mmol/g；Fmoc-Ile-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.35mmol/g；Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.31mmol/g；步骤1中缩合剂与活化剂的组合为DIEA/HATU，步骤2中缩合剂与活化剂的组合为DIEA/TBTU。步骤4真空干燥得到利拉鲁肽粗肽92.8g，纯度72.8％，粗肽收率74.5％。步骤4纯化后，最终得到利拉鲁肽纯品33.8g，纯度99.5％，纯化收率为49.8％，总收率37.1％。实施例3与实施例2的区别在于：步骤1中Fmoc-Asp(Otbu)-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.78mmol/g；Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.72mmol/g；Fmoc-Ile-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.75mmol/g；Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.78mmol/g；步骤1中缩合剂与活化剂的组合为DIC/HOBt。步骤4真空干燥得到利拉鲁肽粗肽118.5g，纯度57.6％，粗肽收率75.2％。步骤4纯化后，最终得到利拉鲁肽纯品32.5g，纯度99.3％，纯化收率为47.3％，总收率35.6％。实施例4与实施例2的区别在于：步骤1中采用的载体为替代度为1.02mmol/g的王树脂。制得Fmoc-Asp(Otbu)-王树脂的替代度为0.48mmol/g；Fmoc-Leu-王树脂的替代度为0.52mmol/g；Fmoc-Ile-王树脂的替代度为0.50mmol/g；Fmoc-Gly-王树脂的替代度为0.55mmol/g；步骤2中缩合剂与活化剂的组合为DIEA/TBTU。步骤4真空干燥得到利拉鲁肽粗肽95.8g，纯度56.7％，粗肽收率59.9％。步骤4纯化后，最终得到利拉鲁肽纯品25.5g，纯度99.5％，纯化收率为46.8％，总收率28.0％。对比例1与实施例1的区别在于：步骤4中得到的合格产品，使用色谱柱进行脱盐纯化。具体纯化条件如下：50*250mm色谱柱，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，检测波长220nm，流动相A为0.05％氨水/水溶液，流动相B为乙腈，流速为50～60ml/min，梯度为30％B～60％B。旋蒸除去有机溶剂，冻干，得到利拉鲁肽纯品30.7g，纯度99.6％，纯化收率为41.0％。对比例21、主链肽树脂的合成称取替代度为1.2mmol/g树脂100g(0.12mol)，加入至多肽合成反应器中，加入700mLDCM溶胀树脂30分钟，用DCM洗涤一次。称取29.7gFmoc-Gly-OH(0.10mol)和23.3gDIEA(0.27mol)用DCM溶解，加入上述反应器中，反应1.5小时后抽干，用DCM洗涤1次。加入体积比为10:1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30分钟。抽干溶剂，DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂，经检测，树脂替代度为0.56mmol/g。称取Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂102g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到Gly-2-氯-三苯甲基树脂。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2eq)、TBTU(2eq)和DIEA(2eq)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，随后再向反应器中加入DIEA(1eq)，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。重复上述脱Fmoc和氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ala-OH、BOC-His(trt)-OH的偶联，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的利拉鲁肽主链肽树脂。2、脱保护与侧链的连接向上述全保护的利拉鲁肽主链肽树脂中加入1L水合肼与DMF混合溶液(体积比1:13)，室温下搅拌15分钟，脱去利拉鲁肽主链肽树脂第20位的赖氨酸的Dde保护，随后用DMF洗涤6次。称取48.5gFmoc-Glu-OtBu(114mmol)、36.6gTBTU(114mmol)和14.7gDIEA(114mmol)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，随后再向反应器中加入7.4gDIEA(57mmol)，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10分钟，共两次，随后用DMF洗涤6次。称取29.2g棕榈酸(114mmol)、36.6gTBTU(114mmol)和22.1gDIEA(171mmol)，溶于适量DMF中，搅拌活化5分钟，加入至反应器中，室温反应2小时(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩4次，真空干燥，得到利拉鲁肽肽树脂232g。4、裂解及纯化取上述利拉鲁肽肽树脂232g，加入2.4L裂解液(TFA：EDT：PhSMe：TIS：H2O体积比为85:5:4:2:4)，室温下搅拌反应2.5小时，过滤，收集滤液，树脂用少量TFA洗涤3次，滤液合并后加入至20L预冷的无水乙醚中，静置沉降2小时。过滤，滤饼用适量的无水乙醚洗涤3次，真空干燥，得到利拉鲁肽粗肽96.9g，纯度47.8％，粗肽收率51.1％。取利拉鲁肽粗品，加入20L纯化水搅拌，用氨水调节溶液pH值至8～8.5之间，搅拌直至产品完全溶解。随后用0.45μm滤膜过滤，待纯化。纯化条件：50*250mm色谱柱，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，检测波长220nm，流动相A为0.1％TFA/水溶液，流动相B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为50～60ml/min，梯度为35％B～75％B，循环进样纯化，收集主峰。将纯化合格的产品合并，加入适量的稀氨水调节溶液的pH值至4.9，析出白色的固体，搅拌30分钟后，离心除去上清液，固体用预冷的纯化水洗涤3次，随后分散至适量的纯化水中，冻干，得到利拉鲁肽纯品22.5g，纯度99.4％，纯化收率为48.3％，总收率24.7％。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 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