一种具有抗肿瘤活性的查耳酮类化合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种新型的抗肿瘤化合物及其制备方法，特别涉及2’-羟基-2’,3’二甲氧基查耳酮的制备方法，还涉及该化合物在抗肿瘤中的应用，本发明属于药物合成与应用技术领域。

背景技术：

查耳酮类化合物是一类主要由芳香醛与芳香酮通过Claisen-Schmidt缩合反应生成，结构中含有1,3-二苯基丙烯酮结构的化合物。

查耳酮类化合物的二个苯基上有不同取代基团，表现出不同的生物活性。其中2’-羟基-2’,3’二甲氧基查耳酮化合物，未见到有抗肿瘤活性报道。

本发明首次通过芳香醛和芳香酮在氢氧化钠催化下合成出2’-羟基-2’,3’二甲氧基查耳酮，并对其进行了体外和体内肿瘤细胞抑制活性的测试。体外测试结果显示该化合物对人肺癌细胞A549，人结肠癌细胞SW620和人肝癌细胞HepG2有较强的抑制活性。其对人结肠癌细胞SW620和人肝癌细胞HepG2的抑制活性明显优于对照药品5-氟尿嘧啶。在肝癌小鼠体内实验中，抑制肿瘤增殖活性明显优于对照药品5-氟尿嘧啶。

在此基础上，本发明发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的查耳酮类化合物及其制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种具有抗肿瘤活性的查尔酮类化合物，为2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮，其结构式如式I所示：

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的具有抗肿瘤活性的查尔酮类化合物的方法，包括以下步骤：

将2-羟基苯乙酮和2,3-二甲氧基苯甲醛溶于无水乙醇中，在氢氧化钠催化下，室温反应48小时，反应液用稀盐酸调节pH到中性，加水析出沉淀，抽滤，少量水洗，干燥，即得。

在本发明的一个具体实施例中，优选的，所述方法包括以下步骤：

取1.20mL 2-羟基苯乙酮和1.663g 2,3-二甲氧基苯甲醛，溶于80mL乙醇，滴加1.5mL 50％(w/w)NaOH溶液，反应48h。反应液用稀盐酸调pH至中性后，加1倍体积量的水析出沉淀，抽滤，得黄色固体，少量水洗，干燥，称重，得2.072g浅黄色固体，即为2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮固体。

更进一步的，本发明还提出了所述的查尔酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

其中，优选的，所述的肿瘤包括肝癌、结肠癌及肺癌。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明在处理反应液时，采用稀盐酸或NaOH调节pH到中性，较通常调pH3-4方法，避免了查耳酮结构中甲氧基破坏，产率提高10～30％左右。同时，减少盐酸的用量，降低了合成成本，避免了对环境的负面影响。

2、本发明涉及的2’-羟基-2’,3’二甲氧基查耳酮，有明显的抗肿瘤细胞活性，优于对照药品5-氟尿嘧啶。

附图说明

图1为2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮氢核磁共振谱图；

图2为2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮在小鼠肝癌模型中对肿瘤生长影响的时间曲线；

注：9a(H)、9a(M)、9a(L)分别表示2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮的高、中、低剂量组；

图3为2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮在小鼠肝癌模型中对肿瘤生长变化率影响的时间曲线；

注：9a(H)、9a(M)、9a(L)分别表示2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮的高、中、低剂量组。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1 2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮的制备

具体的制备步骤如下：

取1.20mL 2-羟基苯乙酮和1.663g 2,3-二甲氧基苯甲醛，溶于80mL乙醇，滴加1.5mL 50％NaOH溶液，反应48h。反应液用稀盐酸调pH至中性后，加1倍量的水析出沉淀，抽滤，得黄色固体，少量水洗。干燥，称重，得2.072g浅黄色2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮固体。收率为74.8％。

合成路线如下：

2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮氢谱如图1所示：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.87(s,1H,HO-17),8.21(d,J＝15.6Hz,1H,CH-9),7.93(d,J＝8.1Hz,1H,CH-1),7.76(d,J＝15.6Hz,1H,CH-8),7.50(t,J＝7.7Hz,1H,CH-3),7.29(d,J＝7.9Hz,1H,CH-11),7.12(t,J＝8.0Hz,1H,CH-2),7.04(d,J＝8.5Hz,1H,CH-13),7.00(d,J＝8.1Hz,1H,CH-4),6.95(t,J＝7.6Hz,1H,CH-12),3.91(d,J＝4.4Hz,6H,CH₃O-20,21).

实施例2 2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮在三种肿瘤细胞中的活性测定

1、溶液的配制：

10％FBS培养液的配制：购买HyClone RPMI Medium Modified 1640培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的双抗溶液，培养基的配制在超净工作台上进行，后放置冰箱4℃保存。

PBS缓冲液的配制：PBS磷酸缓冲液粉末，加入去离子水，充分溶解，高压灭菌后放置冰箱4℃保存

MTT溶液的配制：MTT干粉0.25g，溶于50mLPBS缓冲液中，用0.22μM滤膜过滤除菌后，放置冰箱-12℃保存。

药品母液配制方法：将药物溶于40μL DMSO中，加入2mL10％FBS，混合均匀，取400μL混合液稀释10倍，配制成4mL 200μM浓度药物母液。

2、肿瘤细胞

本发明抗肿瘤活性测定所用3种肿瘤细胞：人肝癌细胞HepG2，人结肠癌细胞SW620和人肺癌细胞A549。

3、抗肿瘤活性测定

3.1抗人肝癌细胞HepG2的活性测试

HepG2细胞使用的培养液为含1％双抗和10％的胎牛血清的PRMI1640细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO₂的恒温培养箱。具体步骤：

(1)取96孔板，边缘孔用无菌PBS充填，每孔加入100μL细胞悬液(细胞悬液浓度为50000个/mL，每孔约5000个细胞)。

(2)加完细胞的96孔板放入培养箱培养，待贴壁后第二天给药。

(3)将药品母液分别稀释不同倍数，配制成2μM、20μM、50μM、100μM浓度的药物溶液，加入到已贴壁细胞板的相应孔中，调整每孔的浓度分别为1μM、10μM、25μM、50μM、100μM，37℃恒温培养箱孵育48h。

(4)药物作用结束后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，培养3-4h。

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，37℃温箱孵育10分钟或摇床低速振荡10分钟，之后用酶标仪检测490nm下各孔的OD值。

(6)根据OD值计算2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮和5-氟尿嘧啶的IC₅₀值。

3.2抗人结肠癌细胞SW620的活性测试

操作方法同人肝癌细胞HepG2活性测试。

3.3抗人肺癌细胞A549的活性测试

操作方法同人肝癌细胞HepG2活性测试。

4、结果

2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮的抗肿瘤细胞活性测试结果如下表1所示：

表1 2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮的抗肿瘤活性测试结果

实施例3 2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮在肝癌小鼠体内的活性测定

1、肝癌细胞的处理

将复苏的HepG2细胞加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃，5％CO₂含量的培养箱中培养。细胞覆盖率达到80％时，使用0.25％胰酶消化，磷酸盐缓冲液清洗细胞，重新加入新鲜的培养液。继续扩增培养细胞，直到数量达到实验需求。

2、肝癌小鼠模型制备及分组

取4～6周龄雄性SPF级BALB/c nu裸鼠32只，皮下注射HepG2肿瘤细胞(5×10⁶个/只)，两周后皮下肿瘤形成。测量形成的肿瘤体积，将裸鼠随机进行分组。全部裸鼠分为五组，分别为阴性对照组、阳性对照组(氟尿嘧啶组)、2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮高(H)、中(M)、低(L)剂量组。

3、实验步骤

培养HepG2肝癌细胞，当细胞覆盖率达到80％，数量达到实验所需时，收集细胞，制成浓度为5×10⁷个/ml的细胞悬液。将细胞悬液注射到裸鼠体侧髋关节皮下，注射体积为110μL。肿瘤形成后，根据实验设计对裸鼠进行分组，依次是对照组、阳性对照组、2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮高、中、低剂量组。根据分组情况，分别给予腹腔注射不同剂量的不同药物，分组及给药情况如表2所示。裸鼠给药后，每隔24小时观察小鼠的生理状态、体重、肿瘤形态和大小的变化。给药后两周，处死裸鼠，分离肿瘤，保存于-80℃备用，根据实验数据评价药物的肿瘤生长抑制作用(注：9a为2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮，以下同)。

表2分组及给药情况

4、实验结果

4.1通过2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮对肿瘤生长影响曲线(图2)和对肿瘤生长变化率影响的时间曲线(图3)可以发现，与阴性对照组比较，各个剂量组的2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮能够显著抑制肿瘤的生长，并且呈现出较为明显的量效关系。其中，高剂量组的2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮抑制肿瘤生长的效果最为明显，其对肿瘤生长抑制作用与10倍摩耳浓度的5-氟尿嘧啶相当。因此，表明羟基-2,3-二甲氧基查耳酮的抗肿瘤活性明显优于对照药品5-氟尿嘧啶。

4.2给药后各组药物对小鼠身体状态的影响

除了2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮低剂量组以外，其余各组小鼠的体重到实验结束时均有增加，并且在每天观察中，各组小鼠也非常活跃，说明2’-羟基-2,3-二甲氧基查耳酮在一次给药的情况下并不会对裸鼠的身体状态造成太大的影响。