用于检测CYP2C19基因SNP位点rs4986893基因型的试剂盒的制作方法

文档序号:12056594阅读:来源:国知局

技术特征:

1.用于检测CYP2C19基因SNP位点rs4986893基因型的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂;其中,所述引物对为(1)或(2)中的一种:

(1)上游引物:CYP2C19-F 5'- CATCAGGATTGTAAGCACCCCC-3'

下游引物:CYP2C19-R 5'- TTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTGG-3';

(2)与(1)中的互补序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述PCR检测反应试剂包括含EvaGreen 的Green-2-Go qPCRMastermix。

3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:所述PCR扩增时的反应体系为:

Green-2-Go qPCRMastermix(含EvaGreen) 5μl

引物F(10μM) 0.1μl

引物R(10μM) 0.1μl

模板(50ng/μl) 0.5μl

ddH2O 4.3μl

总体积 10μl。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括标准品,所述标准品为重组阴性质粒和重组阳性质粒,所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1,所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2。

5.一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4986893基因型的方法,其特征在于:步骤如下:

(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒:所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1,所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2;

(2)构建PCR扩增时的引物对,所述引物对为a或b中的一种:

a、上游引物:CYP2C19-F 5'- CATCAGGATTGTAAGCACCCCC-3'

下游引物:CYP2C19-R 5'- TTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTGG-3';

b、与a中的互补序列;

(3)提取待测样本的外周血基因组DNA,对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用步骤(2)所述引物,且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析,收集数据;

作为优选,所述HRM分析的条件为:94℃ 90s;60℃ 30s;83-94℃收集数据,温度上升速率为0.06℃/s;

(4)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线,根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本CYP2C19基因SNP位点rs4986893的基因型:

与重组阴性质粒的熔解曲线重合则CYP2C19基因SNP位点rs4986893的基因型为GG;

与重组阳性质粒的熔解曲线重合则CYP2C19基因SNP位点rs4986893的基因型为AA;

在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则CYP2C19基因SNP位点rs4986893的基因型为GA。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述PCR扩增时的反应体系为:

Green-2-Go qPCRMastermix(含EvaGreen) 5μl

引物F(10μM) 0.1μl

引物R(10μM) 0.1μl

模板(50ng/μl) 0.5μl

ddH2O 4.3μl

总体积 10μl。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述PCR扩增时的反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性10s;60℃退火/延伸20s;40个循环。

8.权利要求1-4任一所述的试剂盒的使用方法,其特征在于:步骤如下:

(1)提取待测样本的外周血基因组DNA,对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用相同引物,且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析,收集数据;

所述HRM分析的条件为:94℃ 90s;60℃ 30s;83-94℃收集数据,温度上升速率为0.06℃/s;

(2)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线,根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本CYP2C19基因SNP位点rs4986893的基因型:

与重组阴性质粒的熔解曲线重合则CYP2C19基因SNP位点rs4986893的基因型为GG;

与重组阳性质粒的熔解曲线重合则CYP2C19基因SNP位点rs4986893的基因型为AA;

在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则CYP2C19基因SNP位点rs4986893的基因型为GA。

9.权利要求1-4任一所述的试剂盒在制备与CYP2C19 rs4986893相关的药物个体化治疗试剂中的应用。

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