基于近缘种基因组开发的柿树炭疽病菌SSR引物对及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及SSR引物，具体涉及一套基于近缘种基因组开发的柿树炭疽病菌SSR引物对及其应用。
背景技术：
：柿子在我国已有3000多年的栽培历史，因其味道鲜美，具有较高的营养价值和药用价值而广受人们喜爱。柿树炭疽病是柿树上非常重要的一种病害，是由哈锐炭疽菌(Colleotrichumhorii)引起的，该病在世界主要柿生产国家均有发生。在我国的富平尖柿和广西水柿子上发生较重，对我国柿产业的发展造成了重大的经济损失。柿树炭疽病为害的逐年加重与该病菌与柿树的长期协同进化，以及与当地气候环境的适应密不可分，深入分析柿树炭疽病菌的遗传多样性以及遗传分化可以了解该病原菌的适生性与遗传进化，对于柿树炭疽病的有效防控具有十分重要的意义。随着现代生物学技术的发展，分子标记广泛应用于种质资源遗传多样性分析以及辅助育种工作中。AFLP、ISSR、RAPD等标记均是采用无基因组序列信息的标记，尽管有一定的实用性，但随机性强，稳定性差。与其它分子标记相比，SSR标记，由于其多态性高、共显性、操作简便、稳定可靠、重复性好等优点而广泛用于遗传结构分析的研究。但柿树炭疽病菌刚刚作为一个新的物种哈锐炭疽菌从胶孢炭疽菌中分离出来，其基因组尚未测序完成，EST数据库也未建立，所以本发明尝试从其近缘种胶孢炭疽菌的基因组中开发可用于哈锐炭疽菌的SSR引物，为深入研究柿树炭疽病菌的遗传结构提供有力工具。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一套基于近缘种基因组开发的柿树炭疽病菌SSR引物对及其应用。本发明利用胶孢炭疽菌的基因组为基础通过MISA软件寻找SSR，开发了30对SSR引物，经过6株不同柿树炭疽病菌的筛选，得到了15对具有多态性的SSR引物，可用于柿树炭疽病菌的遗传结构分析。本发明采用的技术方案如下：基于近缘种基因组开发的柿树炭疽病菌SSR引物对，所述柿树炭疽病菌SSR引物对共有15对，其核苷酸序列如下：第1对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；第2对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；第3对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；第4对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；第5对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；第6对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；第7对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；第8对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；第9对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；第10对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示；第11对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示；第12对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示；第13对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示；第14对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.27和SEQIDNO.28所示；第15对引物：其上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.29和SEQIDNO.30所示。上述柿树炭疽病菌SSR引物对的开发方法，包括以下步骤：(1)通过NCBI网站下载柿树炭疽病菌的近缘种胶孢炭疽菌的全基因组序列；(2)采用MISA软件对步骤(1)下载的全基因组序列进行SSR位点搜索，选择单核苷酸重复次数≥10次、二核苷酸重复次数≥6次、三核苷酸重复次数≥5次、四核苷酸重复次数≥5次、五核苷酸重复次数≥5次和六核苷酸重复次数≥5次的SSR位点；(3)利用PRIMER5软件进行SSR引物设计，引物设计的原则为：引物序列长度为18-22bp，预计扩增产物长度150-350bp，GC含量40％-60％，退火温度50-65℃，上、下游引物的退火温度值相差不大于4℃；(4)SSR引物筛选与多样性分析：提取6株不同地理来源的柿树炭疽病菌菌株的DNA，对步骤(3)设计的SSR引物对进行引物有效性筛选，若6株柿树炭疽病菌均有与预计扩增产物大小相同的扩增条带出现，而且扩增条带为多态性条带，则该引物对为有效引物；筛选得到的有效引物即为柿树炭疽病菌SSR引物对。根据上述柿树炭疽病菌SSR引物对的开发方法，其中，步骤(1)中所述的胶孢炭疽菌为ColletotrichumgloeosporioidesNaragc5。上述柿树炭疽病菌SSR引物对在柿树炭疽病菌遗传多样性、品种鉴定及亲缘关系研究上的应用。本发明的有益效果：本发明创新性地以柿树炭疽病菌的近缘种——胶孢炭疽菌的基因组为基础给尚未完成基因组测序的哈瑞炭疽菌进行SSR引物设计，经过6株不同柿树炭疽病菌的筛选，得到了15对具有多态性的SSR引物；本发明开发的柿树炭疽病菌引物对是稳定存在的新标记，可用于柿树炭疽病菌的遗传多样性分析，同时还可以用于柿树炭疽病菌品种鉴定及亲缘关系研究上，对柿树炭疽病的有效防控具有十分重要的意义。附图说明图1引物对1、16、18和5的PCR扩增结果；图2引物对2、21、15和29的PCR扩增结果；图3引物对3、4、25和28的PCR扩增结果；图4引物对6、19、20和23的PCR扩增结果；图5引物对7、24、8和9的PCR扩增结果；图6引物对17、22、10和27的PCR扩增结果；图7引物对26、11、13和14的PCR扩增结果；图8引物对12和30的PCR扩增结果；图923株柿树炭疽病菌的聚类分析图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1：柿树炭疽病菌的获得2014年从柿子主产区采集发病的叶片，采用组织分离法分离获得柿树炭疽病菌，并单孢分离进行纯化，即得到柿树炭疽病菌。本发明共分离得到了23株柿树炭疽病菌(见表1)。具体操作如下：采集发病的柿树叶片，切取叶片的小块病组织(病健交界处)，将病组织放入75％酒精中2-3秒，捞出后放入5％次氯酸钠中灭菌2-3分钟(枝条组织块大且粗糙，需灭菌3-5分钟，以防污染)；再用无菌水冲洗三次；用灭过菌的吸水纸吸干病组织的水分，然后将病组织接入PDA培养平板，25℃黑暗条件下进行培养。(4)菌株保存：柿树炭疽病菌长出1周后进行单孢分离，在显微镜下挑取单个孢子放入PDA平板置25℃黑暗条件下继续培养，3天后长出菌落转接于2mL离心管内保存于4-8℃冰箱。表1本发明分离得到的23株柿树炭疽病菌菌株菌株编号分离时间分离部位采集地点12014叶片广西恭城22014叶片广西恭城32014叶片广西恭城42014叶片广西恭城52014叶片广西恭城62014叶片广西恭城72014叶片广西恭城82014叶片广西恭城92014叶片广西恭城102014叶片广西恭城112014叶片广西平乐122014叶片湖北荆州132014叶片未知142014叶片未知152014叶片山东青州162014叶片广西富平172014叶片广西富平182014叶片浙江富阳192014叶片浙江湖源202014叶片浙江湖源212014叶片浙江千岛湖222014叶片浙江千岛湖232014叶片浙江千岛湖实施例2：柿树炭疽病菌DNA的提取采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取柿树炭疽病菌基因组DNA，具体操作如下：(1)将保存的柿树炭疽病菌菌株转入液体PDA中培养3天，挑出菌丝块用滤纸吸干水分，放入研钵中加入液氮研磨成粉状，得到菌丝粉；取50mg菌丝粉于1.5mlEP管中，加入900μl2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液和90μl10％SDS(十二烷基苯磺酸钠)，混匀后置于55-60℃水浴1h；(2)12000rpm/min离心5min，取上清液，加等体积的酚\氯仿\异戊醇(25:24:1)抽提1次；(3)12000rpm/min离心5min，吸取上清液，加等体积氯仿抽提1次；(4)12000rpm/min离心5min，吸取上清液，加0.1×体积的3MNaAC溶液和2×体积的冰无水乙醇过夜沉淀基因组DNA；(5)用预冷的70％乙醇洗涤两次，然后置37℃下干燥；(6)干燥后的DNA用100μlddH2O溶解(含50μg/mlRNase)，37℃静置1h后置-20℃冰箱中备用。实施例3：SSR引物的开发(1)登陆NCBI网站，选择genome数据库，进行炭疽病菌基因组数据检索，找到柿树炭疽病菌的近缘种胶孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesNaragc5)的全基因组，下载该胶孢炭疽菌的全基因组数据，包括所有的scaffold或contig。(2)采用MISA软件对步骤(1)下载的全基因组序列进行SSR位点搜索，其具体过程为：将基因组数据整理成FASTA格式，下载安装Perl语言，运行MISA程序以识别和定位基因组序列中的SSR，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为10、6、5、5、5和5；经过SSR位点搜索，共发现单核苷酸重复序列1981个，二核苷酸重复序列1146个，三核苷酸重复序列1700个，四核苷酸重复序列174个，五核苷酸重复序列98个，六核苷酸重复序列69个。(3)根据分析到的SSR，利用PRIMER5软件进行SSR引物设计，选择重复较多的二核苷酸或三核苷酸重复序列，在重复序列两侧设计上下游引物，其引物设计的原则为：引物序列长度为18-22bp，预计扩增产物长度150-350bp，GC含量40％-60％，退火温度50-65℃，上、下游引物的退火温度值相差不大于4℃。本发明一共设计得到30对SSR引物对(具体见表2)，它们分布于基因组的不同scaffold中，其中二核苷酸重复序列25个，重复单元均大于等于18个，三核苷酸重复序列5个，重复单元均大于等于13个，PCR产物长度为160-330bp。设计的引物送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表2本发明所设计的30对SSR引物实施例4：SSR引物筛选从分离得到的23株柿树炭疽病菌菌株中选取6株不同柿树炭疽病菌菌株(其菌株编号分别为：1、3、4、5、9和11)，按照实施例2所述的方法提取其基因组DNA，以分别以提取得到的基因组DNA为模板对实施例3设计的30对SSR引物对进行筛选(结果见图1-图8)。PCR扩增反应体系(25μl)：2.5μl10×PCR反应缓冲液，1.5μl2.5mMMgCl2，0.5μl2.5mMdNTPs，0.2μl5U/μlTaqDNA聚合酶，0.5μl10μM引物，0.5μl模板DNA，加无菌超纯水至25μl。PCR扩增条件：95℃变性30S，95℃变性30S，55-60℃退火30S，72℃延伸30S，30个循环，72℃延伸5min。扩增产物检测：PCR产物用3％琼脂糖凝胶电泳，75V电泳5h，用0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色，然后用Bio-rad凝胶成像系统照相并记录结果。表3本发明设计得到的15对具有多态性的SSR引物对引物对编号总条带数多态性条带数多态性比率(％)12210022210032210042210054410062210072210083267922100102210011221001222100133310014221001533100由图1-图8可知，30对SSR引物对均可对柿树炭疽病菌进行有效扩增，至少可有效扩增出1株，其中6株柿树炭疽病菌均可扩增出条带的SSR引物对有16对，占所设计引物的53.33％，6株柿树炭疽病菌均可扩增出条带且为多态性条带的SSR引物对有15对(见表3)，占所设计引物的50.00％(见表3和图1-8)。因此，本研究成功开发出15对SSR引物可用于柿树炭疽病菌的遗传结构分析。实施例5：柿树炭疽病菌SSR引物对的应用在SSR引物筛选的基础上，从15对多态性引物中随机选用6对SSR引物对(其引物对编号分别为：1、6、7、10、11和14)对本发明分离得到的23株柿树炭疽病菌(见表1)进行了PCR扩增，其中PCR扩增反应条件、PCR扩增条件和扩增产物检测方法同实施例4。结果显示，6个SSR引物对扩增出的条带均为多态性条带，且条带清晰。将扩增条带进行进一步处理，出现条带的为1，没有的记为0，依次记录下来整理得到[0,1]矩阵图，经过聚类分析软件NTsys-pc2.02分析，得到所有菌株之间的亲缘关系树状图(见图9)，结果表明23株柿树炭疽病菌聚类为21个分支，表现出丰富的遗传多样性；遗传距离为0.7，23个菌株可被分为4个组，第一组为1、9、18、21和22等5个菌株，第二组为10；第三组为12、20和23等3个菌株；第四组为2、3、4、5、6、7、8、11、13、14、15、16、17和19等14个菌株。由此说明，本发明从胶孢炭疽菌中开发的SSR可成功用于柿树炭疽病菌的遗传多样性分析和亲缘关系研究中。SEQUENCELISTING<110>河南省林业科学研究院<120>基于近缘种基因组开发的柿树炭疽病菌SSR引物对及其应用<130>1<160>30<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>1ttcctcccatcttcagcg18<210>2<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>2gacaaggcaaggcaccac18<210>3<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>3ccactggctgtgcttactt19<210>4<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>4gaattggcgcatctttga18<210>5<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>5ccctcctcactgggtcat18<210>6<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>6ggcgtatggtggtgttctat20<210>7<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>7tctttgtccaacggtgtcg19<210>8<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>8cggtggcgtttctactgg18<210>9<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>9tatctggcggccatcttc18<210>10<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>10aggagcggcaatgacgag18<210>11<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>11cagtcgtgtcgtgctcat18<210>12<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>12gaggcacagtgacggaga18<210>13<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>13caagacgacgatgtgccg18<210>14<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>14ggcgttgggtagcattag18<210>15<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>15gacttgggaagacgctgag19<210>16<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>16cggtgtaatgtcggttctg19<210>17<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>17atgagggatgcgatgacg18<210>18<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>18tggactagggcaacgattt19<210>19<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>19gcaagcattgagccataa18<210>20<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>20acgagcgttccataggtt18<210>21<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>21cccgtctggtcttgtctt18<210>22<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>22ggtttactttatcgtccgtag21<210>23<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>23gcaagcattgagccataa18<210>24<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>24acgagcgttccataggtt18<210>25<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>25gtaagaggaatctggacgaa20<210>26<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>26ggaagcgagtgaaacgag18<210>27<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>27ggcgggttgatgaggtta18<210>28<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>28ccagggacagaagcaggag19<210>29<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>29ggaatcgctatccaaacg18<210>30<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>引物<400>30atcttccgcactcagcat18当前第1页1 2 3