一种优质肉鸡多目标性状的快速聚合育种方法与流程

本发明涉及优质肉鸡多目标性状多基因聚合育种方法，属于家禽育种方法，具体涉及多目标性状的组装与聚合、多基因聚合性状筛选、目的基因型的快速固定与纯合等选育方法。

背景技术：

优质肉鸡饲养业是我国的特色产业，优质肉鸡育种永恒的目标是“高效与优质”。与国外快大型白羽肉鸡相比，我国优质肉鸡不仅要在风味物质含量和肌肉品质等性状上有较高要求，而且还要求种鸡具有繁殖性能较高，商品代鸡具有适当生长速度的特点。种鸡能提供更多的商品代苗鸡数和商品代鸡适当的生长速度和优良的肉质是优质肉鸡“高效与优质”性的具体表现。尽管近来年在以产蛋量为代表性指标的种鸡繁殖性状较原地方鸡种取得了较大的选育进展，但合格种蛋数、出雏率等代表孵化效率的性状仍然偏低，随着制种企业之间竞争的加剧，优质肉鸡的制种成本和商品代鸡上市日龄的迟早问题日显重要。如何运用经典的数量遗传学理论和现代分子生物技术对影响“高效”主要性状进行选择提高，寻找“优质”与“高效”的平衡点，是优质肉鸡育种领域需要创新和突破的关键技术之一。

性成熟是决定优质肉鸡上市的最基本条件之一。目前如要达到一定的性成熟要求，商品代鸡的饲养期则相对较长。国内外在对鸡性成熟性状方面的研究主要有气温、纬度、季节等气候因素，光照、饲料营养等饲养因素，体重、生殖激素水平及遗传因素对性成熟的影响，性成熟对肉质的影响以及性成熟相关性状的遗传参数估计等。在分子研究方面主要集中在QTL定位及单个候选基因DNA变异与性早熟性状的相关性上。发现与开产日龄有关的QTL位于鸡l号、3号与Z染色体。被最早作为性早熟候选基因研究的为dw基因，其后是鸡内源性病毒基因。近年来，随着候选基因法逐渐被应用到鸡的经济性状研究中，越来越多的候选基因被发现与鸡的性早熟性状有关。现有的研究已表明，鸡冠的大小可以有效地反应性成熟时间。

我国对优质肉鸡最为重要的要求是：上市时要冠大、髯红、羽毛光亮。这是区别于国外快大型肉鸡的一个重要的标志，也是国人消费需求的特点。鸡的性早熟可以影响到鸡冠的大小、羽毛色泽等第二性征；同时，有研究证实，鸡在接近性成熟时，身体组成发生改变，胴体品质提高，肌间脂肪等风味物质含量提高，这些风味物质是肌肉味道香醇、多汁性和风味的物质基础，越是性成熟早的鸡，鸡肉风味越好。国外快大型肉鸡肉质不佳也正是因为其生长期短，性成熟迟原因。

就目前国内总体情况看，具有适合市场需要的父母代鸡高繁、商品代鸡早熟、饲养期较短，即能结合“优质与高效”特点的优质肉鸡新品种(配套系)还不多，不能满足我国优质肉鸡产业现阶段生产的需要。培育早熟高繁优质的肉鸡是整个行业发展的需要，但是常规育种培育的新品种(系)周期较长，一般5年以上，且耗费多巨大，要求测定的指标较多，花费人工多。本发明克服常规方法周期长的缺点，在1-2年内快速创制综合性状优良的新品种(系)，大大加快育种的效率和进程。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种多目标性状的快速聚合育种方法，本发明方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。这种技术克服了优质肉鸡常规选择育种中基因型纯合慢、性状选择效率低的问题，充分发挥生物技术在家禽育种中的作用，从而形成一种高效、快速的优质肉鸡聚合育种新技术。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种多目标性状的快速聚合育种方法，包括以下步骤：

1、鸡的基因组DNA提取；

2、引物设计：根据生长分化因子9(GDF9)、雌激素受体(ESR)、多巴胺受体1(DRA1)、多巴胺受体2(DRA2)、血管活性肠肽受体2(VIP2)基因序列设计聚合酶链式反应(PCR)扩增引物；

生长分化因子9(GDF9)上游引物序列5’-tggagggtacgtggaggat-3’,下游引物序列5’-cacacctacctgtaatcggt-3’；

雌激素受体(ESR)上游引物序列：5’-gatgcacgcatagcttttca-3’，下游引物序列：5’-acggaaaagagtcagcctca-3’；

多巴胺受体1(DRA1)上游引物序列：5’-gctgtggctgagtttccttc-3’，下游引物序列：5’-acccttggaacacactgagg-3’；

多巴胺受体2(DRA2)上游引物序列：5’-aacccaccctcctcagactt-3’；下游引物序列：5’-ggatggagatgggagacaga-3’；

血管活性肠肽受体2(VIP2)基因序列上游引物序列：5’-gttggggagtggaggttcag-3’；下游引物序列：5’-attgggctggagatggcaaa-3’；

3、聚合酶链式反应(PCR)；采用20μL反应体系：在PCR反应管中加入10×buffer(25mmol/L)2μL；Mg2⁺(10pmol/μL)2.2μL；dNTPs(2.5mmol/L)0.8μL，DNA模板1μL，上述任一对引物的上、下游引物(均为10pmol/L)各1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，加超纯水至20μL，充分混匀后短暂离心；将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存，5对引物的退火温度分别为58℃、60℃、60℃、59℃和61℃。

4、单核苷酸多态性反应(SSCP)；2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃变性10min，然后冰浴5min。5对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％，凝胶交联度为29：1，电压都为150V，过夜电泳；

5.目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据5个图谱中的带型选择选择生长分化因子9(GDF9)、雌激素受体(ESR)、多巴胺受体1(DRA1)、多巴胺受体2(DRA2)、血管活性肠肽受体2(VIP2)基因的基因型分别为QQ、GG、KK、TT、TT基因型的个体；

6.各基因多态性与鸡冠、繁殖性状相关分析。确定聚合基因型为QQGGKKTTTT的个体鸡冠生长最快，产蛋数最大，在选择QQGGKKTTTT基因型个体留种；

7.选留QQGGKKTTTT基因型个体的公母鸡选配，基因型固定，其后代不会产生基因分离现象，使后代的繁殖性能在5个基因型效应上具有最佳效果，而且稳定遗传，使鸡冠和繁殖性能基因在1个世代内即可达到纯合，加速优质肉鸡早熟和高繁殖品系的培育。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：克服了常规选择育种中基因型纯合慢、性状选择效率低的问题，一个世代就完成基因聚合，多基因聚合育种方法在10周龄鸡冠面积、43周产蛋数和66周产蛋数上分别提高了22.49mm²、2.6个和2.9个。而且多基因聚合方法操作简单，可以在出壳时就可以选种，减少了种群测定的数量，节约了成本和人力。

附图说明

图1是GDF9基因的SSCP图谱。图中：1：QQ型；2：PP型；3：PQ型；4，5：OQ型；6，8：OP型；7：OO型。

图2是GDF9基因的测序图。

图3是ESR基因的SSCP图谱。图中：1，2：GG型；5，6：AA型；3，4：AG型

图4是ESR基因的测序图。

图5是DRA1基因的SSCP图谱。图中：1，2，6：KK；3，5：LL；4：KL

图6是DRA1基因的测序图。

图7是DRA2基因的SSCP图谱。图中：2,3,4,6,7,9：CC型；5,10：TT型；1,11：CT型

图8是DRA2基因的测序图。

图9是DRA2基因的SSCP图谱。图中：2,5,7,8：CC型；4：TT型；1,3,6：CT型

图10是DRA2基因的测序图。

图11为优质肉鸡多目标性状快速聚合育种方法的示意图。

具体实施方式

如图11所示，一种多目标性状的快速聚合育种方法，包括以下步骤：

1、鸡的基因组DNA提取；

2、引物设计：根据生长分化因子9(GDF9)、雌激素受体(ESR)、多巴胺受体1(DRA1)、多巴胺受体2(DRA2)、血管活性肠肽受体2(VIP2)基因序列设计聚合酶链式反应(PCR)扩增引物；

生长分化因子9(GDF9)上游引物序列5’-tggagggtacgtggaggat-3’,下游引物序列5’-cacacctacctgtaatcggt-3’；

雌激素受体(ESR)上游引物序列：5’-gatgcacgcatagcttttca-3’，下游引物序列：5’-acggaaaagagtcagcctca-3’；

多巴胺受体1(DRA1)上游引物序列：5’-gctgtggctgagtttccttc-3’，下游引物序列：5’-acccttggaacacactgagg-3’；

多巴胺受体2(DRA2)上游引物序列：5’-aacccaccctcctcagactt-3’；下游引物序列：5’-ggatggagatgggagacaga-3’；

血管活性肠肽受体2(VIP2)基因序列上游引物序列：5’-gttggggagtggaggttcag-3’；下游引物序列：5’-attgggctggagatggcaaa-3’；

3、聚合酶链式反应(PCR)；采用20μL反应体系：在PCR反应管中加入上下游引物混合物2.0μL、10×buffer(25mmol/L)2μL；Mg2⁺(10pmol/μL)2.2μL；dNTPs(2.5mmol/L)0.8μL，DNA模板1μL，上述任一对引物的上、下游引物(均为10pmol/L)各1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，加超纯水至20μL，充分混匀后短暂离心；将PCR反应管放入PCR仪分别进行反应扩增：：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存，5对引物的退火温度分别为58、60、60、59和61℃。

4、单核苷酸多态性反应(SSCP)；2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃变性10min，然后冰浴5min。5对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％，凝胶交联度为29：1，电压都为150V，过夜电泳；

5.目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱(见图1-10)，根据5个图谱中的带型选择选择生长分化因子9(GDF9)、雌激素受体(ESR)、多巴胺受体1(DRA1)、多巴胺受体2(DRA2)、血管活性肠肽受体2(VIP2)基因的基因型分别为QQ、GG、KK、TT、TT基因型的个体；

6.各基因多态性与鸡冠、繁殖性状相关分析。确定聚合基因型为QQGGKKTTTT的个体鸡冠生长最快，产蛋数最大，在选择QQGGKKTTTT基因型个体留种；

7.选留QQGGKKTTTT基因型个体的公母鸡选配，基因型固定，其后代不会产生基因分离现象，使后代的繁殖性能在5个基因型效应上具有最佳效果，而且稳定遗传，使鸡冠和繁殖性能基因在1个世代内即可达到纯合，加速优质肉鸡早熟和高繁殖品系的培育。

实施例：优质肉鸡早熟、高繁S3系的选育。

以鸡冠大小及均匀度、43周产蛋数及66周产蛋数为选育的性状。

常规选择：采用个体选择、家系选择的选择方法。母鸡选留率25～35％，公鸡选留率5～7％。各世代闭锁繁育，避免1/4近亲交配。

选育程序：

1.出壳时按系谱戴翅号；

2.10周龄全群测量鸡冠大小，按家系的平均体重及变异系数大小进行排序，淘汰鸡冠平均值太小及变异系数太大的家系；

3.在所选留的家系中，对所有个体按鸡冠大小进行排序，淘汰10％体重鸡冠最大的个体，然后根据选留率确定鸡冠下限，进行选取留。

4、母鸡进行个体产蛋记录至66周。

5、根据43周和66周的产蛋量，选留家系，淘汰产蛋量少的家系，在所选留的家系中，对所有个体按产蛋数大小进行排序，根据选留率确定母鸡产蛋下限，进行选取留。

6、43周后按非近亲组建新家系，继代繁殖。

多基因聚合育种选择：多基因聚合分子标记选择方法

1.出壳时按系谱戴翅号；翅静脉采血

2.提取总DNA，按发明步骤方法进行。

表1 S3系常规选育选育进展

表2 S3系多基因聚合选育进展

由表1-2可见，常规选育方法在10周龄鸡冠面积、43周产蛋数和66周产蛋数上分别提高了9.21mm²、2.2个和2.3个，而多基因聚合育种方法在10周龄鸡冠面积、43周产蛋数和66周产蛋数上分别提高了22.49mm²、2.6个和2.9个。虽然2种方法之间的选育结果差异不显著，但多基因聚合方法略好于常规选择方法，而且多基因聚合方法操作简单，可以在出壳时就可以选种，减少了饲养的数量，节约了成本和人力。

一种优质肉鸡多目标性状的快速聚合育种方法

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120>一种优质肉鸡多目标性状的快速聚合育种方法

<160> 10

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 鸡

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<221>生长分化因子9上游引物

<400> 1

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<212> DNA

<213> 鸡

<220>

<221> 生长分化因子9下游引物

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 鸡

<220>

<221>雌激素受体上游引物

<400> 3

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<210> 4

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<213> 鸡

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<221>雌激素受体下游引物

<400> 4

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 鸡

<220>

<221>多巴胺受体1上游引物

<400> 5

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<210> 6

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<213> 鸡

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<221>多巴胺受体1下游引物

<400> 6

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸡

<220>

<221>多巴胺受体2上游引物

<400> 7

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<212> DNA

<213> 鸡

<220>

<221>多巴胺受体2下游引物

<400> 8

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<212> DNA

<213> 鸡

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<221>血管活性肠肽受体2基因序列上游引物

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<212> DNA

<213> 鸡

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<221>血管活性肠肽受体2基因序列上游引物

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