水稻斑点叶性状控制基因spl29在衰老和抗病上的用途
【专利摘要】本发明公开了一种水稻斑点叶性状控制基因SPL29在衰老和抗病上的用途。本发明通过对水稻斑点叶突变体（spl29）的研究克隆了控制其性状的基因。突变基因spl29的编码核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，其所对应的野生型控制基因SPL29的编码核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。水稻斑点叶突变体表现出斑点叶、加速的叶片衰老以及增强的植株抗病能力，表明SPL29基因在控制衰老和抗病性方面发挥着重要的作用。本发明的性状控制基因为阐明衰老的机制和创造高抗病性作物方面提供了新的理论依据，特别是可利用基因工程方法调控植株的生命和抗病性，在衰老与抗病的理论和应用研究上具有重要的潜在利用价值。
【专利说明】水稻斑点叶性状控制基因SPL29在衰老和抗病上的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种水稻斑点叶性状控制基因SPL29(SPOTTED LEAF29)在衰老和抗病上的用途。
【背景技术】
[0002]斑点叶突变体，也常被称作类病斑突变体，其表现为错误地调节细胞死亡。通过克隆斑点叶突变体的基因，使得调节细胞死亡程序的基因被大量发现，这对解析衰老信号途径、防御反应途径以及它们的交叉调控网络具有重要的意义(Lorrain S，VaiIIeauF，Balague C，Roby D.2003.Lesion mimic mutants:keys for deciphering cell deathand defense pathways in plants.Trends Plant Sci8，263-271.)。如要依靠不同的胁迫处理研究植株反应，来达到这些研究目的，通常是不太可能的。
[0003]叶片衰老是一个复杂的生物学过程，通常发生在叶片发育的最后阶段，通常受年龄发育以及大量内源、外源因素的影响和调控(Balazadeh S，Kwasniewski Mj CaldanaC，Mehrnia Mj Zanor MIj Xue GP，Mueller-Roeber B.2011.0RSlj an H202-responsiveNAC transcription factor,controls senescence in Arabidopsis thaliana.MolPlant4，346-360;Lim PO，Nam HG.2005.The molecular and genetic control of leafsenescence and longevity in Arabidopsis.Curr Top Dev Biol67，49-83.)。虽然叶片衰老相关的问题被大量研究，但是目前人们对于叶片衰老的科学认识仍然不是十分清晰。因此对叶片衰老关键基因的克隆和研究显得十分重要，这使得清晰地阐明叶片衰老在分子水平上的遗传机制成为了可能。例如，从快速衰老突变体Hsl中克隆到了 RLSl基因，该基因在水稻叶衰老过程中参与自噬调节的叶绿体降解途径(Jiao BBj Wang JJj ZhuXDj Zeng LJj Li Qj He ZH.2012.A novel protein RLSlwith NB-ARM domains is involvedin chloroplast degradation during leaf senescence in rice.Mol Plant5，205-217.)。另外，叶片衰老关键基因的克隆，对利用基因工程的手段调控作物叶片的衰老进程、改善作物的光合功能和挖掘作物的产量潜力，提供了潜在的可行性。
[0004]斑点叶突变体在没有病原菌入侵的情况下也呈现类似病斑的表型。通过检测这类突变体的抗病性，通常会发现它们对于病原菌的抗性也大大增强(Jung YHj LeeJHj Agrawal GKj Rakwal Rj Kim JAj Shim JKj Lee SKj Jeon JSj Koh HJj Lee YHj IwahashiH, Jwa NS.2005.The rice(Oryza sativa)blast lesion mimic mutant, blm, may conferresistance to blast pathogens by triggering multiple defense-associatedsignaling pathways.Plant Physiol Biochem43, 397-406;Wu C，Bordeos A，MadambaMR，Baraoidan M，Ramos Mj Wang GL，Leach JE，Leung H.2008.Rice lesion mimic mutantswith enhanced resistance to diseases.Mol Genet Genomics279，605-619.)。在已鉴定基因的这类突变体中，SPLll的突变给与了水稻对稻瘟病病菌和白叶枯病病菌的广谱抗性(Yin Zj Chen Jj Zeng Lj Goh Mj Leung H，Khush GSj Wang GL.2000.Characterizing ricelesion mimic mutants and identifying a mutant with broad-spectrum resistance torice blast and bacterial blight.Mol Plant Microbe Interactl3, 869-876.) ；SPL28的突变传递给植株对一些稻瘟病病菌和白叶枯病病菌的抗性(Qiao Y, Jiang ff, Lee J, ParkB, Choi MS, Piao R, Woo MO, Roh JH, Han L, Paek NC, Seo HS, Koh HJ.2010.SPL28encodes aclathrin-associated adaptor protein complexl, medium subunit microl(APlMl) andis responsible for spotted leaf and early senescence in rice(Oryza sativa).NewPhytol 185, 258-274.) ；GF14e的基因沉默水稻植株对一种水稻黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.0ryza)毒性菌株呈现除了高水平的抗性(Manosalva PM, BruceM,Leach JE.2011.Ricel4-3-3protein(GF14e)negatively affects cell death anddisease resistance.Plant J68, 777-787.) ；NLS1的半显性突变导致水稻中防御反应的组成性激活(Tang J, Zhu X，Wang Y, Liu L, Xu B, Li F，Fang J, Chu C.2011.Sem1-dominantmutations in the CC-NB-LRR-type R gene, NLSI, lead to constitutive activation ofdefense responses in rice.Plant J66, 996-1007.)。斑点叶 / 类病斑突变体的基因克隆和研究对揭示防御反应途径具有重要的作用，也为利用基因工程的手段创造广谱抗性植株提供了线索。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于一种水稻斑点叶性状的突变体spl29基因。
[0006]本发明的目的还在于提供上述spl29基因及其对应的野生型控制基因SPL29的用途。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008]斑点叶突变体spl29是在经过愈伤组织培养而生成的中花11植株中发现了一个斑点叶突变体，该突变体从苗期开始，突变体的叶片在出现类病斑斑点后，会快速的衰老死亡。本发明采用图位克隆的方法将spl29基因定位为L0C_0s08gl0600，spl29基因发生了一个G到T的点突变，导致氨基酸编码从甘氨酸(Gly)变为半胱氨酸(Cys)。L0C_0s08gl0600基因的功能互补实验恢复了 spl29的表型，表明L0C_0s08gl0600就是要找的SPL29基因，SPL29为UDPGP基因家族中的UDP-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因(UAP1)。进一步研究SPL29基因的点突变与叶片早衰和植株抗性的关系发现:水稻斑点叶突变体spl29在出现斑点叶表型后，叶片中叶绿素下降，叶绿体破裂和溶解，衰老转录因子和衰老相关基因表达上调；同时，水稻斑点叶突变体spl29对白叶枯病的抗病能力大大增强，抗病基因表达上调。即SPL29基因的点突变，导致了植物叶片的加速衰老和死亡，并提高了植株抗白叶枯病能力，诱导了体内的抗病反应，表明SPL29基因在控制衰老和抗病性方面发挥着重要的作用。
[0009]一种水稻斑点叶性状的突变体spl29基因，其编码核苷酸序列如Seq ID N0.1所
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[0010]所述的水稻斑点叶性状的突变体SP129基因的核苷酸序列还包括在Seq ID N0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的核苷酸序列。
[0011]spl29基因对应的野生型控制基因SPL29的编码核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。SPL29基因编码的蛋白质的氨基酸序列如Seq ID N0.3所示。SPL29基因所在的基因组核苷酸序列如Seq ID N0.4所示，Seq ID N0.4所示序列包含功能互补实验所用的启动子序列、基因区序列和终止子序列，共7888bp。
[0012]上述水稻斑点叶性状的突变体spl29基因在控制水稻植株早衰和/或抗病方面的应用。
[0013]与SP129基因对应的野生型控制基因SPL29在调控水稻植株衰老和/或抗病方面的应用。
[0014]水稻和其它物种中的与SPL29同源的基因在调控衰老和/或抗病方面的应用；所述的与SPL29同源的基因为编码与Seq ID N0.3所示的氨基酸序列同源性高于30%且行使的功能与SPL29的功能相似的同源基因。
[0015]本发明的水稻斑点叶突变体spl29的控制基因SPL29，在控制衰老和抗病性方面发挥着重要的作用。揭示了衰老与抗病性的新途径，为阐明衰老的机制和创造高抗病性作物方面提供了新的可靠的理论依据，也为利用基因工程调控衰老与抗病性提供了新的靶标。SPL29基因在用于基因工程或遗传工程方法，来调控生物个体的衰老和抗病能力时，拥有重要的潜在利用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为野生型WT和突变体spl29的表型。(A)植株苗期约28天时的表型；(B)植株分蘖期约50天时的表型；(C)植株成熟期约115天时的表型；(D)苗期叶片表型，对应图A植株依先后顺序(从下而上)长出的第二叶；(E)分蘖期叶片表型，对应图B植株主茎从上向下的第一、二、三、四叶；(F)成熟期约90天时的剑叶表型，方框部分进行放大展示。
[0017]图2为SPL29基因的图位克隆和功能互补。(A)初步定位，采用44颗F2突变株，将SPL29定位在第8号染色体的分子标记M1037和M1230之间，并与M1077紧密连锁；(B)精细定位，利用870颗F2突变株，将SPL29定位在新开发的分子标记S8和S26之间97kb的候选区域内，并与S15和S19紧密连锁；(C)在水稻基因组注释项目(Rice Genome AnnotationProject)上查询，候选区域内有10个开放阅读框(ORFs) ; (D) SPL29的候选基因的基因结构:该基因含有15个外显子，G到T的点突变(箭头指示)发生在第8个外显子上，导致氨基酸编码从甘氨酸变为半胱氨酸；(E)功能互补的载体构建:互补载体PSPL29C上构建入一个 7888bp 的包含 L0C_0s08gl0600 的启动子(Pro，2214bp)、基因(SPL29，4674bp)和终止子(Ter，1000bp)的基因组片段；空载体pEmvC作为对照，利用农杆菌转化法将pSPL29C和PEmvC转入spl29的愈伤中，分化成苗；(F)互补载体pSPL29C的转基因植株；(G)空载体PEmvC的转基因植株；(H)载体pSPL29C和pEmvC的转基因植株叶片；(I)载体pSPL29C和PEmvC的转基因植株阳性检测:Barl78:扩增的转基因筛选标记基因(Bar)，长度178bp，野生型ZHll的DNA作为阴性对照，含Bar基因的空载体质粒作为阳性对照；(J)突变体spl29中的点突变位点在PSPL29C和pEmvC的转基因植株中的碱基序列检测:该碱基位点在恢复表型的PSPL29C转基因植株中同时含有G和T，在未恢复表型的空载体pEmvC转基因植株中仍为T。
[0018] 图3为UAP基因的系统进化树以及编码蛋白的同源性分析。(A)系统树基于UAP和UGP基因编码的全长氨基酸序列构建。UAP =UDP-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶；UGP:UDP-葡萄糖焦憐酸化酶。GanBank 号如下:ZmUAPl,玉米(Zea mays, AFW56989.1)；SbUAPl,高梁(Sorghum bicolor, XP_002444024.l)；0sUAPl (SPL29),水稻(Oryza sativa,NP_001061242.1) ；0sUAP2,水稻(Oryza sativa, NP_001053857.1) ；ZmUAP2,玉米(Zeamays, NP_001266496.1) ；SbUAP2,高粱(Sorghum bicolor, XP_002448519.1) ；AtUAPI,拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_564372.3) ;AtUAP2,拟南芥(Arabidopsis thaliana,NP_181047.1) ；GmUAPl,大豆(Glycine max, XP_003524811.1) ；GmUAP2,大豆(Glycinemax, XP_003531103.1)；PtUAPl,毛果杨(Populus trichocarpa，ΧΡ_002303345.2);PtUAP2,毛果杨(Populus trichocarpa, XP_006369046.1) ；HsUAPA,人(Homo sapiens,NP_003106.3, isoform A) ;HsUAPB,人(Homo sapiens, Q16222.3, isoform B);LmUAPl,飞虫皇(Locustamigratoria, JX484802.1) ;LmUAP2,飞幢(Locusta migratoria, JX484803.1)；DmUAPA,黑腹果妮(Drosophila melanogaster, NP_609032.1, isoform A) ；DmUAPB,黑腹果妮(Drosophila melanogaster, NP_723183.1, isoform B) ；ScUAP,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, NP_010180.1) ；CeUAPI,秀 _ 隐杆线虫(Caenorhabditiselegans, NP_497777.1) ;CeUAP2,秀_ 隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, NP_500511.2)；OsUGPl,水稻(Oryza sativa, NP_001063879.1)；0sUGP2,水稻(Oryza sativa,ΝΡ_001045689.1)；AtUGP2,拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_197233.1) ；AtUGPI,拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_186975.1) ；EcGlmU,大肠杆菌(Escherichia coli,P0ACC7.1)。(B)各蛋白与SPL29的氨基酸序列一致性的比对结果，对应展示在蛋白名称后面；“no”表示无序列一致性。
[0019]图4为野生型WT和突变体spl29中叶绿素Ca+b含量变化。(A)苗期叶片中的叶绿素Ca+b含量测定；(B)分蘖期叶片中的叶绿素Ca+b含量测定。
[0020]图5为野生型WT和突变体spl29中叶绿体的超微结构。(A-C)野生型细胞中的叶绿体；(D-F)突变体细胞中破裂的叶绿体，图中箭头所指为叶绿体膜的破裂；(G-1)突变体细胞中溶解的叶绿体，图中箭头所指为溶解状态的叶绿体。
[0021]图6为野生型WT和突变体spl29中衰老转录因子和衰老相关基因的相对表达情况。(A-B)衰老转录因子在苗期和分蘖期的相对表达情况；(C-D)衰老相关基因在苗期和分蘖期的相对表达情况。三个水稻基因(UBC、Profi I in-2和Actinl)用作内参分析，各基因在野生型中的表达量调为1，数据指示三个生物学重复的平均值(mean) 土标准差(SD)，星号指示野生型和spl29之间在统计学意义上的显著差异(#P〈0.005，*#P〈0.0005 ;斯图登检验(student，s test))。
[0022]图7为野生型WT和突变体spl29的抗病能力检测。(A)接种白叶枯病菌PX099后12天的病菌侵染叶，双向箭头指示病斑侵染部分；(B)白叶枯病菌PX099侵染12天的平均叶病斑长度，数据来自5-7颗独立植株的平均值(mean) 土标准差(SD)，星号指示野生型和spl29之间在统计学意义上的显著差异(***P〈0.0005,斯图登检验(student，s test))；(C-D)防御反应相关基因在苗期和分蘖期的相对表达情况，三个水稻基因(UBC、Profilin-2和Actinl)用作内参分析，各基因在野生型中的表达量调为I，数据指示三个生物学重复的平均值(mean) 土标准差(SD)，星号指示野生型和spl29之间在统计学意义上的显著差异(***Ρ〈0.0005,斯图登检验(student’ s test))。
【具体实施方式】
[0023] 为了更充分的解释本发明的实施，下面提供了水稻斑点叶突变体(spl29)的实施实例。这些实施实例仅仅是说明性的、而不是限制本发明的范围。其中所用的原料均有市售。[0024]实施例1
[0025]1、水稻材料:
[0026]水稻(Oryza sativa)斑点叶突变体spl29 (spotted leaf29),保存于湖北省农作物种质资源中期库(保存号HB2014001，湖北省农业科学院粮食作物研究所);其野生型(WT)品种为粳稻品种“中花11”。
[0027]水稻斑点叶突变体spl29是中花11在组织培养过程中突变产生的。突变表型为斑点叶和加速的叶衰老死亡。从苗期到植株发育后期的每一片叶都呈现这种突变表型。经多代繁殖，spl29突变表型稳定遗传。表型结果如图1所示。
[0028]2、群体构建和遗传分析
[0029]以突变体spl29为父本，分别以广占63s和岳恢9113为母本，进行杂交，3个组合F1表型均为正常绿叶表型，F1自交，得到F2群体。在3个&群体中，非斑点表型叶与斑点表型叶植株数目均符合3:1的分离比，表明突变性状受细胞核隐性单基因控制。结果如下表所示:
[0030]表1.突变体sp129的遗传分析
[0031]
【权利要求】
1.一种水稻斑点叶性状的突变体匆基因，其特征在于:该水稻斑点叶性状的突变体SP129基因的编码核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，其所对应的野生型控制基因SPL29的编码核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
2.权利要求1所述的水稻斑点叶性状的突变体匆基因在控制水稻植株早衰和/或抗病方面的应用。
3.与权利要求1所述的水稻斑点叶性状的突变体#7匆基因对应的野生型控制基因SPL29在调控水稻植株衰老和/或抗病方面的应用。
4.水稻和其它物种中的与57?匆 同源的基因在调控衰老与抗病方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述的与57?匆同源的基因为编码与SeqID N0.3所示的氨基酸序列同源性高于30%且行使的功能与57?匆的功能相似的同源基因。
【文档编号】A01H5/00GK103937812SQ201410140545
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】王兆海, 李阳生, 王雅, 胡道恒, 洪潇 申请人:武汉大学