一种采用新型双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒与流程

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种采用新型双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒及其应用。
背景技术：
：STR遗传标记又称微卫星DNA，其广泛存在于原核及真核生物基因组中，是一类由2～6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列。不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。个体识别DNA荧光检测试剂盒主要采用目前应用最为广泛的多重PCR复合扩增和多色荧光标记毛细管电泳检测技术，用于生物学检材的DNA基因分型。根据国内外已有的和我们自己在STR基因座方面的研究成果，并依据这些基因座在人群中等位基因频率分布的特点，我们选择在人群中具有较高的多态性和杂合度的基因座，在这些基因座附近设计引物并分别在引物上标记荧光素，通过多重PCR扩增体系，对多态性STR基因座进行特异性扩增，然后与已知长度并标有荧光素的分子量标准品混合，在遗传分析仪或测序仪上电泳并收集电泳信息，继而对STR基因座的PCR产物分别进行长度和基因型分析，获取所需数据，达到个体识别的目的。目前市场上国产试剂盒一般采用FAM、HEX、TAMRA、ROX、ATTO633对引物和内标进行标记，测序仪采用的是单一激光，波长为488nm，而FAM，HEX，TAMRA，ROX和ATTO633这5种荧光染料激发波长却分布在500nm-650nm。随着染料激发波长的变大，相同量荧光标记产物，被测序仪激光激发产生的荧光信号逐渐减少，TAMRA和ROX荧光效率远远低于FAM、HEX。特别的，ROX染料标记比FAM标记，相同量的产物，信号强度只有四分之一到八分之一，在这样大的荧光效率差异下，获得各个荧光通道间的较好的均衡性以及较高的灵敏度变的很困难。本发明使用一种新型双荧光标记方法，可以实现荧光能量转移(FRET，fluorescenceenergytransfer)。荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当一个荧光分子(又称为供体)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生FRET；随着距离延长，FRET呈显著减弱。供体和受体之间FRET的效率，可以由E＝1/1+(R/R0)6反映，其中R表示供体和受体之间的距离，R0表示福氏半径，依赖供体发射谱和受体激发谱的重叠程度，以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。目前市场上同类型的常染色体STR试剂盒见表1，本发明与Promega公司的PowerPlex21基因座的选择完全一致，21个基因座包含了13个CODIS和新增的4个CODIS位点，3个在中国人群中具有很高多态性的PentaD，PentaE和D6S1043，以及一个性别识别位点Amelogenin。既包含了所有CODIS基因座，又选择了3个高多态性的基因座，提高了整体的分辨率。这21个基因座也是目前能够录入常染色体数据库的所有的21个基因座，所以，选择这21个基因座是目前性价比最高的方案。表1与市面上主流商业化常染色体STR荧光检测试剂盒基因座对比。注：粗体的为13个CODIS基因座，下划线的为4个新增CODIS基因座。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明提供一种新型荧光染料的标记方法制备的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，并应用于人类常染色体21个STR基因座的复合扩增，具有扩增快速、均衡性好、灵敏度高的特点，满足中国人群个体识别，亲子鉴定，常染色体DNA建库需求。本发明的技术方案如下：一种采用新型双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，包括：21对特异性引物的复合引物组、复合扩增21个基因座、反应混合液以及热启动Taq酶；所述复合扩增21个基因座包括Amelogenin，D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，D8S1179，D21S11，D16S539，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D5S818，FGA，D2S1338，D19S433，D1S1656，D12S391，PentaD，PentaE和D6S1043；所述反应混合液的组成为：MgCl25mM、Tris-HCl125mMpH8.325℃，KCl125mM，dNTPs0.5mM，BSA1.5g/L；所述dNTPs为dATP、dTTP、dCTP、dGTP的等摩尔混合物；所述21对特异性引物的复合引物组的21个基因座的引物对的序列包括SEQIDNO.01-SEQIDNO.42；所述21对特异性引物的复合引物组的各STR基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中至少有一条引物采用新型双荧光染料标记方法进行标记；所述21对特异性引物的复合引物组的21个基因座的引物对分为四组采用新型双荧光染料标记方法进行标记；所述四组包括第一组：D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，PentaE；SEQIDNO.01-SEQIDNO.10；第二组：D8S1179，D21S11，D16S539，D2S1338，PentaD；SEQIDNO.11-SEQIDNO.20；第三组：D19S433，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D6S1043；SEQIDNO.21-SEQIDNO.32；第四组：Amelogenin，D1S1656，D5S818，D12S391，FGA；SEQIDNO.33-SEQIDNO.42。优选地，所述新型双荧光标记方法包括在引物5’端第一个碱基用FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一种进行标记；其中，用FAM、TAMRA和ROX标记的引物，引物5’和3’中间一个碱基用FAM进行标记；用HEX标记的引物，引物5’和3’中间一个碱基用HEX进行标记。本发明所述的采用新型双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将试剂盒内试剂与样品DNA混合、装入PCR扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃3min；94℃5s、60℃1min，26-28个循环；60℃终延伸10min；4-16℃保持；得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件分析基因测序仪上检测到的数据；所述样品DNA包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA，提取检材的来源包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官，或者利用免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。本发明所述的采用新型荧光染料标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，可应用于中国人群的个体识别、亲子鉴定、DNA建库等方面。本发明的有益效果是：1、采用新型荧光标记技术，荧光效率高，从而扩增速度更快、均衡性更好，灵敏度更高；2、本试剂盒是包含21个常染色体STR基因座的高度复合扩增系统，21个基因座与我国DNA建库录入的21个基因座完全一致，系统高度兼容；3、本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不同检材的样本包括：利用Chelex100法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞；4、本试剂盒通过设计特异性引物，具有较强的扩增特异性及温度耐受性(退火温度耐受范围56-62℃，保证了在使用不同品牌或质量的PCR扩增仪时均能得到较好的扩增结果)。对狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鼠、兔、鱼和大肠杆菌DNA，10种不同种属物种进行检测，没有扩增峰，表明本发明具有良好的种属特异性；5、本发明通过在引物上标记具有FRET的TAMRA和ROX，极大地提高了TAMRA、ROX的荧光效率，缩小了与FAM、HEX的差距；毛细管电泳检测时，相比使用常规荧光染料标记方法的STR复合扩增试剂盒，本发明具有更均衡、更快速的系统，同时具有更高的灵敏度。附图说明图1为实施例1中间荧光不同标记位置的引物A-H扩增D13S317的结果图；图2为实施例2中试剂盒等位基因分型标准物图；图3为实施例2扩增阳性标准品9947A的分型结果；图4为实验3中本发明试剂盒Z2015110011F扩增图谱；图5为实验3中21DirectID样本Z2015110011F扩增图谱；图6为实验3中本发明试剂盒Z2015110071M扩增图谱；图7为实验3中21DirectID样本Z2015110071M扩增图谱；图8为实验4中本发明双荧光标记方法对DNA标准品9947A500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg五个浓度的扩增结果；图9为实验4中使用常规单荧光标记方法对DNA标准品9947A500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg五个浓度的扩增结果。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。如图所示，本发明公开一种采用新型双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，包括：21对特异性引物的复合引物组、复合扩增21个基因座、反应混合液以及热启动Taq酶；所述复合扩增21个基因座包括Amelogenin，D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，D8S1179，D21S11，D16S539，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D5S818，FGA，D2S1338，D19S433，D1S1656，D12S391，PentaD，PentaE和D6S1043；所述反应混合液的组成为：MgCl25mM、Tris-HCl125mMpH8.325℃，KCl125mM，dNTPs0.5mM，BSA1.5g/L；所述dNTPs为dATP、dTTP、dCTP、dGTP的等摩尔混合物；所述21对特异性引物的复合引物组的21个基因座的引物对的序列包括SEQIDNO.01-SEQIDNO.42；所述21对特异性引物的复合引物组的各STR基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中至少有一条引物采用新型双荧光染料标记方法进行标记；所述21对特异性引物的复合引物组的21个基因座的引物对分为四组采用新型双荧光染料标记方法进行标记；所述四组包括第一组：D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，PentaE；SEQIDNO.01-SEQIDNO.10；第二组：D8S1179，D21S11，D16S539，D2S1338，PentaD；SEQIDNO.11-SEQIDNO.20；第三组：D19S433，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D6S1043；SEQIDNO.21-SEQIDNO.32；第四组：Amelogenin，D1S1656，D5S818，D12S391，FGA；SEQIDNO.33-SEQIDNO.42。所述新型双荧光标记方法包括在引物5’端第一个碱基用FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一种进行标记；其中，用FAM、TAMRA和ROX标记的引物，引物5’和3’中间一个碱基用FAM进行标记；用HEX标记的引物，引物5’和3’中间一个碱基用HEX进行标记。本发明所述的采用新型双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将试剂盒内试剂与样品DNA混合、装入PCR扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃3min；94℃5s、60℃1min，26-28个循环；60℃终延伸10min；4-16℃保持；得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件分析基因测序仪上检测到的数据；所述样品DNA包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA，提取检材的来源包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官，或者利用免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。本发明所述的采用新型荧光染料标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒，可应用于中国人群的个体识别、亲子鉴定、DNA建库等方面。实施例1、引物设计及荧光标记在引物序列上位置的确定体系共扩增21个STR基因座，为Amelogenin，D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，D8S1179，D21S11，D16S539，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D5S818，FGA，D2S1338，D19S433，D1S1656，D12S391，PentaD，PentaE和D6S1043。对上述21个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Oligo7软件，每条引物Tm值接近60℃。扩增产物长度的最大范围为75-500bp，对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形锋利、峰高较高的扩增峰。再经过复合扩增测试，在56℃-63℃之间，不产生非特异扩增、均有目的峰，不发生其它相互作用或交叉反应。对狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鼠、兔、鱼和大肠杆菌DNA均无扩增。引物序列同表2。本发明所述的新型荧光标记方法利用的是FRET原理，所以FRET的程度与荧光在引物上的位置有关。我们对它进行了研究与实际的测试。对D13S317的同一条引物，在不同位置标记荧光，荧光标记在太靠近3’端可能会影响引物结合模版，所以总长度为24bp的引物，我们选取了5’端2-14位标记中间荧光。5’第一个碱基“C”用TAMRA标记，用粗体表示。标记6-FAM的碱基用下划线+粗斜体表示，如下表：A为常规单荧光标记的引物，B-I为中间荧光标记在不同位置的引物，扩增0.2-0.5ng的DNA提取样本。A-I设置相同的PCR和电泳条件，仅仅荧光引物标记方式不同，实验重复3次。为了避免荧光信号超过检测上限值，将所有扩增产物稀释10倍后再进行电泳。结果表明：D引物扩增的平均峰高最高，标记在5’第6位的荧光效率最高，相比单荧光标记的A引物，可提高至9.2倍。结果如下表和图1：荧光标记引平均检测峰A211.2B1712.6C1794.3D1941.1E1601.7F1497.1G1414.7H1244.9I1118.3可以看出，5’-3’之间增加一个短波长荧光标记可显著提高长波长染料TAMRA的荧光效率，ROX的测试亦如此，此处不再赘述；短波长荧光标记的位置影响荧光效率，对于TAMRA，将6-FAM标记在5’第6位的荧光效率最高，为了使整个引物体系以及背景荧光均一，我们将本发明中所有荧光引物的中间荧光都标记在5’第6位碱基上，具体见表2。表2.本发明引物信息注：加粗字体的5’荧光标记的碱基，下划线的为中间荧光标记的碱基，对应的荧光素为对应相同的加粗或下划线标记。实施例2扩增体系的优化及确定为使扩增均衡及，对引物浓度及扩增组分做了系列测试，最终确定了引物加量及扩增缓冲溶液的组分。试剂盒包括以下成份：2.5×的缓冲液成分及其浓度为：MgCl25mM，Tris-HCl125mM(pH8.3，25℃)，KCl125mM，dNTPs0.5mM，BSA1.5g/L。dNTPs是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的等摩尔混合物。MarkerOrange-500按专利201610988458.1方法制备。本发明还提供了用于分析的等位基因分型标准物，各个基因座引物分别扩增对应等位基因，扩增产物组合而成。图2为Allellicladder电泳图谱。DNA标准品DNA9947A购自美国promega公司。热启动酶购自大连宝生物。本试剂盒在56-62℃退火温度范围内都能良好扩增，扩增体系在各种反应热循环仪上，如ABI9700、ABI2720、Bio-RadT100、博日LifePro等，采用以下的程序可以得到较好的结果：95℃预变性3分钟；94℃变性5秒钟，60℃退火延伸1分钟，该步骤运行26-28个循环；60℃保温10分钟；4-16℃保温。以9947A标准品DNA为模板，按下表加样：组分加量(μL)2.5×PCRMix105×Primers55U/μL热启动TaqDNA聚合酶19947A0.5无核酸酶去离子H2O补至总体积为25uL在ABI9700上以程序95℃3分钟；94℃5秒钟，60℃1分钟运行26个循环；60度10分钟扩增。1μL扩增产物+0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺加样，在ABI3130XL上以1kv，1s进样，15KV电压进行电泳40min。结果以GeneMapper软件进行分析。图3为9947A扩增检测结果图谱，与理论分型一致。实施例3、比较本发明与其他商品化试剂盒分型的一致性为了检测本发明与其他商品化试剂盒分型的一致性，本实施例选取了MicroreaderTM21DirectIDSystem作为参照对象，分别使用本发明与21DirectID试剂盒对1316个样本(其中无关个体663个)进行扩增，产物经过ABI3100遗传分析仪毛细管电泳进行分型，并对分型结果进行分析比对。21DirectID试剂盒按照其说明书操作，本发明使用步骤如下：3.1.聚合酶链式反应(PCR)扩增1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μL。本发明：组分加量(μL)2.5×PCRMix105×Primers55U/μL热启动TaqDNA聚合酶1模版DNA(来自血滤纸或FTA卡)1片1.2mm孔径血痕无核酸酶去离子H2O补至总体积为25uL21DirectID：组分加量(μL)MicroreaderTM1.25×BufferB20MicroreaderTM21-D5×PrimerMix5MicroreaderTMTaqDNAPolymeraseII0.5模版DNA(来自血滤纸或FTA卡)1片1.2mm直径反应终体积25.5uL2)按照本发明和21DirectID说明书，设置热循环仪(ABI9700DNA扩增仪)参数，然后将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。本发明：95℃3分钟；94℃5秒钟，60℃1分钟运行26个循环；60度10分钟，4-16℃持续保温，直至取出样品。21DirectID：95℃2分钟；94℃5秒钟，60℃70秒运行28个循环；60度30分钟，4-16℃持续保温，直至取出样品。3.2.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI3100遗传分析仪进行电泳和检测。1)取(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液混匀后分装，每管10μL。2)再分别加入1μL扩增产物或等位基因阶梯(AllelicLadder)，简短离心将液体收集到离心管管子底部样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态将样品放入基因分析仪的样品托盘中。3)设置仪器参数(本发明进样电压1kV，进样时间1秒钟；21DirectID进样电压3kv，10s)，开始电泳检测大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果。3.3分型结果对比本发明与21DirectID都包含20个常染色体STR位点和一个Amelogenin性别位点。20个常染STR位点中，二者有19个位点相同，D3S1358，vWA，D7S820，CSF1PO，D8S1179，D21S11，D16S539，TH01，D13S317，TPOX，D18S51，D5S818，FGA，D2S1338，D19S433，D12S391，PentaD，PentaE，D6S1043。对上述19个位点以及Amelogenin的分型进行比对。通过对分型结果进行比对，1316个样本(其中无关个体663个)的52640个等位基因，本发明与21DirectID两个试剂盒的分型结果完全一致。对其中2个样本分别用两个试剂盒的扩增结果进行举例，扩增图见图4-图7。实施例4、本发明与常规标记方法扩增体系灵敏度比较对本发明扩增DNA模版的灵敏度进行测试，与常规单荧光标记的引物进行对比。分别配制本发明的双荧光标记和单荧光标记的两组引物池，引物浓度按各自最有条件组配，具体见下表。按实施例2配置扩增体系，加入倍比稀释的DNA标准品9947A(500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg)，扩增程序按两套引物各自最佳程序进行，具体如下：双荧光标记引物组：95℃3分钟；94℃5秒钟，60℃1分钟运行26个循环；60度10分钟，4-16℃持续保温，直至取出样品。单荧光标记引物组：95℃3分钟；94℃10秒钟，60℃1分钟，72度1分钟，运行28个循环；60度30分钟，4-16℃持续保温，直至取出样品。扩增反应结束后，取出反应管，用ABI3100遗传分析仪进行电泳和检测。1)取(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液混匀后分装，每管10μL。2)再分别加入1μL扩增产物或等位基因阶梯(AllelicLadder)，简短离心将液体收集到离心管管子底部样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态将样品放入基因分析仪的样品托盘中。3)设置仪器参数(双荧光标记进样电压1kV，进样时间1秒钟；单荧光标记进样电压3kv，10s)，开始电泳检测大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果。常规单荧光标记的引物扩增的色间均衡性和整体峰高不如双荧光标记的引物。采用双荧光标记的引物，由于信号的提高，引物用量较常规单荧光标记引物用量要少。尤其TAMRA、ROX这两种荧光发射波长大的荧光标记引物，常规单标记引物用量是双标记引物用量的数倍，然而扩增信号强度及均衡性仍不及双标记引物。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。当前第1页1 2 3