本发明属于分子生物
技术领域：
，具体涉及一种与大口黑鲈“优鲈1号”快速生长相关的SNP标记及其应用。
背景技术：
：大口黑鲈(MicropterussalmoidesL.)，俗名加州鲈，原产于北美洲，具有生长快、耐低温、肉质鲜美和易捕捞等特点，是重要的淡水养殖鱼类之一。1983年从台湾引种到广东省，现在全国大部分地区均有养殖。然而，目前我国养殖的大口黑鲈是由野生种家养驯化而成的，缺少定向选育，在亲本留种时经常选择个体小，性成熟早的个体作为亲本，致使我国大口黑鲈种质的下降，主要表现在生长速度下降、性成熟年龄普遍提前、饵料转化效率低、抗病力也大幅下降，其中，生长速度关系到大口黑鲈产量的高低，养殖效益的大小。养殖大口黑鲈生长速度慢、产量低直接影响大口黑鲈养殖业的健康稳定发展。因此，从分子遗传学角度加快改良大口黑鲈，提高其生长性能的工作势在必行。大口黑鲈“优鲈1号”养殖新品种是以国内4个养殖群体为基础选育种群，采用传统的群体选育方法，以生长速度为主要指标，经连续5代选育获得的大口黑鲈选育品种。该新品种的生长速度比普通大口黑鲈快17.8%-25.3%，高背短尾的畸形率由5.2%降低到1.1%。该品种2010年通过全国水产原种和良种审定委员会审定，审定编号为GS01-004-2010。挑选优质亲鱼是提高养殖鱼类生长速度的主要方法之一，其目的是为了改变养殖群体的遗传结构，使后代获得更快的生长速度、更好的抗病能力的遗传特点。在生产中，其传统方法是挑选个体较大、身体健壮的鱼作为留种亲本，即根据表型来决定亲鱼是否留种。这种方法方便、快捷、简单，但受人为因素影响很大，加上大口黑鲈属于肉食性为主的鱼类，掠食性强，饵料不足是会互相残食，致使其生长悬殊较大。如此可见，仅从表型判断大口黑鲈亲本质量往往达不到理想的效果。随着分子生物学和遗传学的发展，已涌现出很多种遗传标记，如AFLP、RAPD、SSR、SNP等标记，其中，SNP标记因分布广泛，适宜高通量自动化分析，遗传稳定，日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起，即可实现从DNA水平上进行选择育种，克服了传统方法受人为因素影响大的不利因素，提高了选择的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。通过发现与大口黑鲈“优鲈1号”快速生长有关的基因，提高快长亲本的筛选效率。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种与大口黑鲈“优鲈1号”快速生长相关的SNP位点标记及其应用。本发明所采取的技术方案是：与大口黑鲈“优鲈1号”快速生长相关的SNP标记，所述SNP标记分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示；所述SEQIDNO.1自5’端起第658位碱基为C或A；所述SEQIDNO.2自5’端起第327位碱基为A或G；所述SEQIDNO.3自5’端起第121位碱基为A或G。其中：序列为SEQIDNO.1的SNP标记的CC基因型个体的生长速度显著高于AA基因型个体。序列为SEQIDNO.2的SNP标记的AA基因型个体的生长速度显著高于GG基因型个体。序列为SEQIDNO.3的SNP标记的AA基因型个体的生长速度显著高于GG基因型个体。以上所述的SNP标记在检测大口黑鲈“优鲈1号”样本生长性状中的应用。用于快速检测以上所述的SNP标记的引物对。作为优选的，用于检测SEQIDNO.1所示SNP标记的引物对如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示；用于检测SEQIDNO.2所示SNP标记的引物对如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；用于检测SEQIDNO.3所示SNP标记的引物对如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示。一种用于筛选快速生长大口黑鲈样本的试剂盒，其包括用于检测SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示SNP标记的引物对。一种快速生长大口黑鲈样本的筛选方法，通过对大口黑鲈样本SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3SNP标记的检测，选择SEQIDNO.1SNP标记为CC基因型和/或SEQIDNO.2SNP标记为AA基因型和/或SEQIDNO.3SNP标记为AA基因型的个体。具体包括如下步骤：（1）提取待检样品基因组DNA；（2）以提取得到的DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；（3）对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果确定样品的SNP标记的基因型来筛选快速生长样本。本发明的有益效果是：本发明所发现的3个SNP标记的应用，可大大降低大口黑鲈“优鲈1号”亲本筛选的盲目性，可以快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈个体。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1与大口黑鲈“优鲈1号”快速生长相关的SNP标记的获得一、SNP标记的获得大口黑鲈“优鲈1号”养殖新品种是以国内4个养殖群体为基础选育种群，采用传统的群体选育方法，以生长速度为主要指标，经连续5代选育获得的大口黑鲈选育品种。该新品种的生长速度比普通大口黑鲈快17.8%-25.3%，高背短尾的畸形率由5.2%降低到1.1%。该品种2010年通过全国水产原种和良种审定委员会审定，审定编号为GS01-004-2010。在选育过程中我们比较了大口黑鲈选育群体与非选育群体的生产性能，采用金属线码标志分别标记接近时间繁殖的选育群体与非选育群体各800尾，然后同塘养殖，11月龄时从大口黑鲈“优鲈1号”快长群体中挑选10尾体重最大个体（快长群体）和非选育群体中挑选10尾体重最小个体（慢长群体），然后提取每尾鱼的总RNA，取等量的总RNA构建了快长群体和慢长群体的混合RNA池，并进行转录组测序，经生物信息软件分析获得了大量的潜在SNP位点，其中在phosphoenolpyruvatecarboxykinase1、FOXO3b和heatshockproteinbeta-1基因的3’非编码区存在各一个SNP位点。采用Snapshot方法对该位点进行验证，经实验证实了这3个位点的存在。第一个SNP位点位于大口黑鲈phosphoenolpyruvatecarboxykinase1基因序列（SEQIDNO.1）的第658个碱基处，该SNP位点的等位基因为C和A，有CC、CA和AA三种基因型。第二个SNP位点位于大口黑鲈FOXO3b基因序列（SEQIDNO.2）的第327个碱基处，该SNP位点的等位基因为G和A，有GG、GA和AA三种基因型。第三个SNP位点位于大口黑鲈heatshockproteinbeta-1基因（SEQIDNO.3）序列的第121个碱基处，该SNP位点的等位基因为G和A，有GG、GA和AA三种基因型。二、大口黑鲈3个SNP位点不同基因型与生长性状的关联分析11月龄时，从大口黑鲈“优鲈1号”选育群体中随机挑选340尾作为关联分析群体，并测量了每一尾的体质量、全长、头长、体高和尾柄长。由于该群体同一批繁殖、同池养殖，且采样时间一致，因此在建立分析模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异。利用Snapshot方法对phosphoenolpyruvatecarboxykinase1（PCK1）基因上突变位点在340尾大口黑鲈“优鲈1号”个体进行分型后，采用一般线性模型（GLM）分析不同基因型对体质量、全长、头长、体高和尾柄长进行关联分析。CC基因型个体在体质量、体宽、全长、头长、体高以及尾柄长上的平均值均高于AC型和AA型个体的均值，且CC基因型个体在体重、头长和体高上显著高于AA基因型个体(P<0.05)。利用Snapshot方法对FOXO3b基因上突变位点在340尾大口黑鲈“优鲈1号”个体进行分型后，采用GLM分析不同基因型对体质量、全长、头长、体高和尾柄长进行关联分析。AA基因型个体在体质量、体宽、全长、头长以及尾柄长上的平均值均高于AG型和GG型个体的均值，且AA基因型个体在体重和头长上显著高于GG基因型个体(P<0.05)。利用Snapshot方法对heatshockproteinbeta-1（HSPB1）基因上突变位点在340尾大口黑鲈“优鲈1号”个体进行分型后，采用GLM分析不同基因型对体质量、全长、头长、体高和尾柄长进行关联分析。AA基因型个体在体质量、体宽、全长、体高以及尾柄长上的平均值均高于AC型和AA型个体的均值，且AA基因型个体在体重、头长和体高上显著高于GG基因型个体(P<0.05)。表1大口黑鲈3个SNP位点不同基因型与生长性状的关联分析SNPsiteGenotypeNumberBW/gTL/cmHL/cmBH/cmCPL/cmPCK1AA152507.54±10.36a29.29±0.207.31±0.13a8.39±0.08a8.26±0.207aAC157526.94±10.1929.30±0.207.35±0.138.49±0.088.34±0.07bCC120529.05±11.66b29.52±0.237.70±0.14b8.66±0.09b8.36±0.11FOXO3bAA61545.64±16.30a29.47±0.607.95±0.12ab8.54±0.138.35±0.12AG220530.36±8.5929.54±0.197.42±0.11a8.59±0.07a8.34±0.06GG149504.30±10.43b29.05±0.317.24±0.19b8.37±0.08b8.28±0.08HSPB1AA59554.68±16.62a29.66±0.337.35±0.208.67±0.088.42±0.12AG197524.10±9.0929.36±0.187.54±0.118.51±0.078.31±0.07GG173512.07±9.70b29.25±0.197.35±0.128.42±0.128.30±0.07注：表中数值为平均值±标准误差，同一列不同上标字母表示差异显著(P<0.05)。实施例2上述的SNP位点在筛选快速生长大口黑鲈亲本中的应用利用上述的SNP位点对快速生长大口黑鲈亲本进行筛选，包括如下步骤：1）从待测亲本中剪取鳍条样品，提取DNA；2）以提取得到的DNA为模板，利用特异性引物进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物，3）使用Snapshot方法用初次获得PCR产物为模板，使用延伸引物延伸一个碱基在多态位点终止，在测序仪上检测，根据峰的颜色可知多肽位点的碱基类型，来确定待测亲本是否为纯合体。初次PCR扩增的反应体系为：DNA1μl10×buffer1.5μl25mmol的MgCl21.5μldNTP0.3μl20P上下游引物0.15μlTaq酶0.3μlH2O补至15μl扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min。引物延伸的反应体系为：纯化PCR产物2μlSnapshotMix试剂1μl延伸引物2μl水补至6μl延伸条件为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，30个循环。其中，用于检测PCK1分子标记SNP位点基因型的引物对为：F1：3’-CTGAAAGAGGAGCAATTCTC-5’（SEQIDNO.4），R1：3’-TATTATTCATCTCAGCACCC-5’（SEQIDNO.5），延伸引物：3’-TTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAATTCTCCTCTGATAATT-5’（SEQIDNO.6）；用于检测FOXO3b分子标记SNP位点基因型的引物对为：F2：3’-GTACAGACATGTATGATGCAG-5’（SEQIDNO.7），R2：3’-CATGGTGTAAATCTGATCCAGT-5’（SEQIDNO.8），延伸引物：3’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAGAAAATCCAGTAAACAGAC-5（SEQIDNO.9）；用于检测HSPB1分子标记SNP位点基因型的引物对为：F3：3’-GGAGGACAGCATTTATAATAG-5’（SEQIDNO.10），R3：3’-GTTATGAGTGGTCTTATCAAAG-5’（SEQIDNO.11），延伸引物：3’-AACACCTCAGGTTTTTAGTCTA-5’（SEQIDNO.12）。以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。SEQUENCELISTING<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所<120>与大口黑鲈"优鲈1号"快速生长相关的SNP标记及其应用<130><160>12<170>PatentInversion3.5<210>1<211>900<212>DNA<213>MicropterussalmoidesL.<400>1acacaaaggcaaggtgatcatgcatgaccccttcgccatgcgtcccttctttggctacaa60ctttggacagtacctctctcactggctgagtatggccgaccgccccggcgccaagctccc120caagatctttcacgtcaactggttccgcaagagccccaccgccggatttctgtggcccgg180tttcggcgacaacatccgcgtgcttgactggatgttcaggcgggtgaatggcgaggccgg240cgccgtgccctctgctgtgggctacctgcctcactgtgactctctaaacctccagggcct300gcaggaggacgtggacctcaacgagctgttctccctggatcaggagttctggcagaggga360ggtggatgaggtgaggaagtacttcaccacgcaggtgaacgacgacctgcccagtgaggt420ggcccggcagctggagctcctgcagcagcgagtgaagcagatgtaaagaggaaaaacagg480aggggaagaaaagaagtgtgtccgaaattctgagggaacatgttggtaatctagaaccaa540cttttagtaattgtagaatatctcgttcttgtgctgaagaacacatataaagaattcctt600tctttgaggtgaagccttacaacttcctgaaagaggagcaattctcctctgataattctt660gtttttttcattagctagaaatcctcccccttttcggatgattattctgaaaatactact720gttaaaattccgctgggggtgctgagatgaataatatgaatttgtaggaattgttgagtt780tttcactgtggtttaagtgaaatgtcataaaaatgacagccagagggcaccagtcacaaa840taaatcggaaatctttcttttccatcccttcacatgctgtcgtagcagcactatgttttc900<210>2<211>1196<212>DNA<213>MicropterussalmoidesL.<400>2caacaacaacaacaacaacaaaaagaaagctatgtcaaactcacaaatcgtagaattatg60caattttcctttgacacccagtctgttgatatcaaagagaaactgcttatcagaaggggt120ttcaggtggaacacagggactaaatatcaaggaaagattgaaggagtgcacggtgcagtt180gttcccgctgacgacaaaaaaagacaaagtgtaaagtgaaaaaaatcaagaagtgacatg240gtgtaaatctgatccagtggtttcctgggatgtgttatgttaaaaaaaaatccctctgtt300ctcactttgtgattttaaatgttcagtgtctgtttactggattttctgttttatcatatt360tgtttctgcatcatacatgtctgtacaaaaacatttggtgtattgatgaaatgaaaagat420ggaaatggggtatcttactcactgagtggccacacatacagtacatgcaaacacacagac480aacctaacactttgccccagtttgcaaaacttcagaaccctttgaagttacgatttctta540tttttattgccatgcacttccatttttgtttttttaaattgcttgaattaaattaaatgc600tccacactgagggttatattacaattagccgaatattacaaaaatatttgttatcttttg660tgtgtatctaactgtaaaaaaaaaaaatggaaaaagactaagaggaggaaactctctgtc720atggatatttgtacagtgcagggcagtgaaaagttcaagaaggaggcggtcacatcttgt780ctgtcttttcgtagatttcttaacttctggtgagttctgttgatgtagccaaaatgaata840cctgtgtgctagagttgtgaacatttccacaccataacaggtgctatgtaaacagtgttg900aatcctgccctgagagcaagccgtgcattttgtgtgtttttgtttctgtttttacacatg960acctgcagaagcccaaagctgcagccacttgtagcacagtgaggttgaacctgtagacgg1020caggggtgggggtgggagggaggtgtgaagggttttagcctcattcctctagaagccatt1080tgtttctcgagtaaaacaataagctatctctgtatattgccaaattacttgaaacaaaca1140gtaggatatgctggcagccaaatcacagcacagacacacacacacacacacagaca1196<210>3<211>1694<212>DNA<213>MicropterussalmoidesL.<400>3gacggtgtgttggaaatcactggtgagtgctcttttctccttcactatttgttctgtaca60gttacctgttgcatgctgattcgaggaggacagcatttataatagttatataataaccgc120gtagactaaaaacctgaggtgttgaaggtcctgtcaggaagagccagtctttgataagac180cactcataacacctaaaaatgtgctagtgtacaggacagatgcattggcaggcagattat240agaatgtctcacttggtgtattttatctctagtaggtttgtctcttccctgtagaagaga300aaccgctacagtactgaaaaaaaaagacacaagataaaaaggcaggaaacatttttgcta360ggtcaagcttaaggcagatgcatagctgtagtgttacataatatcttgatacaatagtgt420gggcgggggcttttggctgcacgcctgcgagatgcaaaacaacacacaattcaacatgtg480ggagttgacttttacagctgctctcagatgaacacagtgttttctctccttgccatgaaa540ggttttcattgtccatccctgcctgtgaaagaccaaagcaaaatgggcagacctgaagaa600atgtgtgcggaatggatccgatataatagcttagctctctgagtcagtgtcagcctctgt660gtctgccatttcacaaagagtcacgctcttggagtagggggtttagctgtgactcaccca720gtgagtctgctactttaaaaggactgctggatcttggccaggtccagggtctagggcttg780actatggcttatatctctctgctgagagactgggtatagataaacaaagcacgagatcca840aatcaactttgccgcctgatgtattttatgtcaccagagaacaaggatgatattatgtta900catcatcggttttagtaaagagttttgtatacacaccaaagtgcaacctctttatgccgc960agccctcttctcattcttttcatccatactctgaactaatgacccttcatgagcttgttg1020aaaaagtgcctgcttggcccggcaacaggagtgttgtcctgttgaaacggagggacagat1080ccctcaggacagcaacctatttcagcttgttgtcataacaaacagattatttagagccag1140aatgacgggcaatgtttccacatcacagtcaggcatctttgtgcctaggagagactgaca1200gaaactgattaagactggtgagggtggtatggctgatagacaaaaataccaccacaaaac1260ctcaacaatctcaaagtagcacagtaactattctgttctattctgcaactccatgtgtta1320ctgttacacatggtactacacagtacacacggtactagataatgttgagagtcctcaaaa1380tactggatctagtttagtttgcttctgaaaaaaaacttcagtcaaacttaattttttcaa1440tatttgcattaagtatgtttatgaattgtaggggataagtagaataaatacaaagtcaac1500atgcattctgtctgccacatagtgcagtcattccctcaagcaccttccttatcctttatt1560gcttttatttccatttaatatccattttgcaaatacctacaagattggtgtaccataata1620cattttttgttataaactgaatgaatctttcagattagtgccacatttatgtaagtatgt1680tgtctgcatcttta1694<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ctgaaagaggagcaattctc20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5tattattcatctcagcaccc20<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>6ttttttttttttttttgagcaattctcctctgataatt38<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7gtacagacatgtatgatgcag21<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8catggtgtaaatctgatccagt22<210>9<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>9tttttttttttttttttttttacagaaaatccagtaaacagac43<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10ggaggacagcatttataatag21<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>11gttatgagtggtcttatcaaag22<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>12aacacctcaggtttttagtcta22当前第1页1 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