本发明涉及分子生物学检测领域，尤其涉及一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法。
背景技术：
日本血吸虫病是世界性分布的人兽共患寄生虫病，是世界卫生组织(WHO)界定的“六大热带病之一”，也是我国五大寄生虫病之一。日本血吸虫病是由尾蚴感染接触疫水的人和动物等终宿主引起的。幼虫在终宿主体内通过吸收宿主营养发育，造成宿主营养不良；通过转变抗原、抗原伪装和减弱宿主的免疫力等途径来抵抗宿主免疫的杀伤作用，逐渐发育至成虫，寄生于门脉-肠系膜静脉系统。急性期症状表现为发热、肝肿大、腹痛、腹泻和便血等；慢性期症状主要表现为肝脾肿大或慢性腹泻；晚期，主要与肝脏门静脉周围纤维化有关，临床表现为巨脾、腹水等。
日本血吸虫(Schistosomajaponicum)属于扁形动物门、吸虫纲、复殖目、裂体科、裂体属、日本种，雌雄异体。雄虫平均长13mm，雌虫平均长15mm。虫卵圆形，淡黄色，卵壳薄，无盖，在其侧方有一小刺，成熟的卵内含毛蚴。毛蚴呈长椭圆形，卵内毛蚴在水中孵出，侵入钉螺，钉螺是其唯一的中间宿主，所以日本血吸虫病的流行地理分布和钉螺的地理分布相一致，有一定的地方性。血吸虫的基因组由8对染色体组成，其中7对为常染色体，1对性染色体。
在我国血吸虫病的病原是日本血吸虫，我国血吸虫病主要分布在江苏、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、广西、广东、福建等12个省的433个县(市、区)，共有钉螺面积148亿平方米，累计感染者达1160万例，受威胁人口在1亿以上。我国的血吸虫病经过60年的积极防治，全国的血吸虫病疫情已得到有效控制，但近年来由于生物、自然、社会经济、人口流动、政策保障等因素变化较大，一些地方呈现血吸虫病疫情扩散蔓延的态势，表现为老疫区血吸虫病患者增加，钉螺扩散明显，新钉螺区出现，感染性钉螺分布范围扩大，部分已达血吸虫病传播控制和传播阻断的地区可能出现疫情回升，各地输入性血吸虫病病例增加，我国的血吸虫病防治工作还任重道远。
在血吸虫病的防控中，诊断与检测工作显得更为重要，它为防治活动的计划、实施和防治效果评价等个环节提供必要的信息和科学依据。用于血吸虫诊断的方法主要有病原学诊断、免疫学诊断和超声诊断等，但是传统的血吸虫检测方法检测周期长、漏检率高、程序复杂、检测结果滞后，已经远远不能满足现代的检测要求。近年来，随着科学技术的发展，特别是分子生物学的不断发展，国内外研究学者已经建立了较多快速、灵敏以核酸为基础的血吸虫检测方法，目前已有多种日本血吸虫的核酸诊断方法包括PCR，Q-PCR以及LAMP等检测方法。PCR及Q-PCR法依赖于热循环仪器，对操作环境及人员有较高的要求，并且耗时长，而LAMP法的问题在于扩增产物对环境的污染，会导致假阳性的出现，对操作环境及操作技巧的要求更高，这些方法不适合在基层单位和现场检测中的应用。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简单、耗时短、易于检测结果的低温血吸虫DNA检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测血吸虫DNA的方法，包括以下步骤：将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；
所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物；
所述血吸虫DNA特异性引物包括正向引物和反向引物：
正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,
反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；所述荧光探针序列为：
5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’
所述等温扩增的温度为35～45℃；
所述等温扩增的时间为5～20min。
优选的，所述扩增体系包括以下浓度的组分：Tris缓冲液(0～60]mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量浓度为5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP 1～6mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白300～1000ng/μL、重组酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30-200ng/μL、荧光探针50-150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM。
优选的，所述聚乙二醇的分子量为30000～40000。
优选的，所述扩增体系的体积为25～100μL。
优选的，所述血吸虫DNA的体积为0.5～1.5μL，浓度为10～100ng/μL。
优选的，所述等温扩增在恒温条件下进行，所述等温扩增的温度为37～42℃。
优选的，所述等温扩增的时间为10～20min。
优选的，所述扩增体系由冷冻干燥粉末状态的扩增体系原料溶解得到，用于溶解所述扩增体系原料的溶剂为反应缓冲液。
优选的，所述反应缓冲液为质量浓度为5.5～6.5％、分子量为30000～40000的聚乙二醇水溶液。
本发明还提供了一种检测血吸虫DNA的等温扩增体系，包括以下含量的组分：Tris缓冲液(0～60]mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量浓度为5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP 1～6mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白300～1000ng/μL、重组酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30-200ng/μL、荧光探针50-150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM；
正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,
反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；
所述荧光探针序列为：
5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’
本发明的有益效果：
本发明提供的检测血吸虫DNA的方法，采用扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；所述扩增体系中包括Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物，本发明的扩增体系可以在恒定的相对较低的温度下完成扩增，不依赖热循环仪，操作简单，能够在较低的温度(35～45℃)下对血吸虫DNA进行检测，并且扩增所用时间短(5～20min)，荧光信号易于收集，适合基层和现场检测。
附图说明
图1为血吸虫DNA检测过程中阴性和阳性的荧光信号变化曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测血吸虫DNA的方法，包括以下步骤：将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；
所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物；
所述血吸虫DNA特异性引物包括正向引物和反向引物：
正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,
反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；所述荧光探针序列为：
5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’；
所述等温扩增的温度为35～45℃；所述等温扩增的时间为5～20min。
本发明为了实现对血吸虫DNA的检测，提供扩增体系，将所述扩增体系与血吸虫DNA混合进行等温扩增。在本发明中，所述扩增体系优选由冷冻干燥粉末状态的扩增体系原料溶解得到，所述扩增体系以冷冻干燥粉末的形貌储存，以便扩增体系的长期保存和运输。在本发明中，用于溶解所述扩增体系原料用溶剂优选为反应缓冲液。在本发明中，所述反应缓冲液优选为聚乙二醇水溶液，所述聚乙二醇水溶液的质量浓度优选为5.5～6.5％，更优选的为6％；所述聚乙二醇的数均分子量优选的为30000～40000，更优选的为35000。
在本发明中，所述扩增体系的体积优选的为25～100μL，更优选的为40～60μL。在本发明中，所述的扩增体系包括Tris缓冲液，所述Tris缓冲液在扩增体系中的浓度优选为(0,60]mM，更优选为20～55mM，最优选为30～50mM。在本发明中，所述Tris缓冲液具有良好的缓冲能力，能够维持扩增体系在稳定的pH值范围，所述扩增体系的pH值范围优选的为7.0～7.5。
在本发明中，所述扩增体系包括醋酸钾，所述醋酸钾在扩增体系中的浓度优选的为50～150mM，更优选的为60～120mM，最优选的为75～85mM。在本发明中，所述醋酸钾中钾离子在等温扩增过程中能够促进引物退火。
在本发明中，所述的扩增体系包括醋酸镁，所述醋酸镁在扩增体系中的浓度优选的为8～30mM，更优选的为10～20mM，最优选的为12～16mM。在本发明中，所述醋酸镁中的镁离子在等温扩增过程中能够提高扩增的特异性和产量。
在本发明中，所述的扩增体系中包括二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇在扩增体系中的浓度优选的为4～9mM，更优选的为5～8mM，最优选的为6～7mM。在等温扩增中，所述二硫苏糖醇可以打断二硫键，使与染色体DNA结合的蛋白质从DNA上释放出来，导致更多的DNA与引物结合，提高扩增效率。
本发明所述的扩增体系包括聚乙二醇，所述聚乙二醇在扩增体系中的质量浓度优选的为5.5～7.8％，更优选的为6.0～7.5％，最优选的为7.1～7.3％。在本发明中，所述聚乙二醇的数均分子量优选的为30000～40000，更优选的为35000；本发明中所述的聚乙二醇作为缩合剂，与单链结合蛋白共同作用，使得整个等温扩增化学平衡朝着扩增产物方向发展，提高等温扩增产物的产量。
本发明所述的扩增体系包括ATP，所述ATP在扩增体系中的浓度优选的为1～6mM，更优选的为3～5.5mM，最优选的为5mM；
本发明所述的扩增体系中包括dNTPs，所述dNTPs在扩增体系中的浓度优选的为0.1～0.4mM，更优选的为0.15～0.35mM，最优选的为0.2～0.3mM；
本发明所述的扩增体系中包括磷酸肌酸，所述磷酸肌酸在扩增体系中的浓度优选的为20～100μg/U，更优选的为25～70μg/U，最优选的为30～50μg/U；
在本发明所述等温扩增过程中，dNTPs为等温扩增反应提供原料，ATP提供反应所需的能量，而磷酸肌酸能够促进ATP的再生，为等温扩增反应源源不断的提供能量，实现核酸的高效扩增。
本发明所述的扩增体系包括单链结合蛋白，所述单链结合蛋白在扩增体系中的浓度优选的为300～1000ng/μL，更优选的为400～700ng/μL，最优选的为450～550ng/μL。在本发明中，所述的单链结合蛋白与上述技术方案所述聚乙二醇作共同作用，提高等温产物的产量。
本发明所述的扩增体系包括重组酶，所述重组酶来源可以是噬菌体T2、T4、T7也可以来源于细菌和真菌中的重组酶，所述重组酶能够起到解开双链DNA功能。所述重组酶在扩增体系中的浓度优选的为50～500ng/μL，更优选的为100～450ng/μL，最优选的为380～4200ng/μL；
本发明所述的扩增体系包括UvsY蛋白，所述UvsY蛋白在扩增体系中的浓度优选的为50～200ng/μL，更优选的为60～150ng/μL，最优选的为65～85ng/μL；
本发明所述的扩增体系中包括核酸外切酶，所述核酸外切酶在扩增体系中的浓度优选的为30-200ng/μL，更优选的为50～150ng/μL，更优选的为80～90ng/μL；本发明中所述核酸外切酶为核酸外切酶Ⅲ。
本发明所述的扩增体系中包括荧光探针，所述荧光探针的在扩增体系中的浓度优选的为50～150nM，更优选的为100～140nM，最优选的为120nM；所述荧光探针的序列为：
5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’。在本发明中，所述荧光探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，所述报告荧光基团优选的为FAM荧光基团；所述的猝灭荧光基团为TAMRA或BHQ；荧光探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，无荧光信号；当目标靶基因成功扩增时，5’端的报告基团随着荧光探针水解而脱落下来，不再与淬灭基团发生能量传递作用，从而能发出荧光信号；在荧光检测过程中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与扩增产物形成完全同步，荧光量强弱与扩增产物成正比；因此，荧光量与扩增产物之间存在一一对应关系，通过对检测荧光信号的强弱变化，实现实时检测血吸虫DNA扩增产物。
本发明所述的扩增体系包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶在扩增体系中的浓度优选的为60～150ng/μL，更优选的为70～120ng/μL，最优选的为85～95ng/μL；
在本发明中，UvsY蛋白是重组蛋白，对目标序列具有高度特异性，与重组酶、DNA聚合酶共同作用，完成等温扩增，减少非特异性扩增，实现产物的无本底背景的高效扩增。
本发明所述的扩增体系包括血吸虫DNA特异性引物，所述血吸虫DNA特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物在扩增体系中的浓度优选的为200～600ng/μL，更优选的为150～450ng/μL，最优选的为180～220ng/μL；所述反向引物在扩增体系中的浓度优选的为200～600ng/μL，更优选的为150～450ng/μL，最优选的为180～220ng/μL。本发明中正向引物的序列为：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,反向引物序列为：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；在本发明中血吸虫DNA特异性引物能够以血吸虫DNA为模板，进行特异性核酸扩增。
在本发明中，所述扩增体系由冷冻干燥粉末状态的扩增体系原料溶解得到，用于溶解所述扩增体系原料的溶剂为反应缓冲液。
优选的，所述反应缓冲液为质量浓度为5.5～6.5％、分子量为30000～40000的聚乙二醇水溶液。
在本发明中，所述血吸虫DNA作为等温扩增的模板，体积优选的为0.5～1.5μL，更优选的为0.8～1.2μL，最优选为1μL；所述血吸虫DNA的体积与扩增体系体积比优选的为(0.5～1.5):49，更优选的为1:49；所述血吸虫DNA的浓度优选的为10～100ng/μL，更优选的为20～80ng/μL，最优选的为40～60ng/μL。
在本发明中，优选的将所述扩增体系与血吸虫DNA混合后进行等温扩增反应。所述等温扩增在恒温条件下进行，所述等温扩增的温度为35～45℃，优选的为37～42℃，更优选的为38～41℃；所述等温扩增的时间为5～20min，更优选的为10～20min；所述等温扩增反应优选的在能够检测FAM荧光的仪器中进行。
本发明在等温扩增过程中，利用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，当目标靶基因成功扩增时，荧光探针发出荧光信号；在荧光检测过程中，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与扩增产物形成完全同步，荧光量强弱与扩增产物成正比；因此，荧光量与扩增产物之间存在一一对应关系，通过对检测荧光信号的强弱变化，可以实现实时检测血吸虫DNA扩增产物。
本发明还提供了一种检测血吸虫DNA的等温扩增体系，包括以下含量的组分：Tris缓冲液(0～60]mM、醋酸钾50～150mM、醋酸镁8～30mM、二硫苏糖醇4～9mM、质量浓度为5.5～7.8％的聚乙二醇、ATP 1～6mM、dNTPs 0.1～0.4mM、磷酸肌酸20～100μg/U、单链结合蛋白300～1000ng/μL、重组酶50～500ng/μL、UvsY蛋白50～200ng/μL、核酸外切酶30-200ng/μL、荧光探针50-150nM、DNA聚合酶60～150ng/μL、正向引物200～600nM和反向引物200～600nM；
正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,
反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’；荧光探针的序列为：
5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’
本发明提供的检测血吸虫DNA的等温扩增体系与上述检测血吸虫DNA的方法中的扩增体系相同，具体参见上述技术方案所述的扩增体系的组成，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的检测血吸虫DNA的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
样品来源：由日本血吸虫成虫提取的基因组DNA，DNA的浓度为50ng/μL。
设计以下血吸虫引物和探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成：
正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,
反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’。
荧光探针的序列为：
5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’
配制扩增体系
在200μL离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制(体积为50μL)：
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉未状扩增体系。
向离心管中加入终浓度为6％(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇作为反应缓冲液将扩增体系重新溶解成为49μL，再加入制备好的1μL血吸虫基因组DNA，混合均匀，瞬时离心，放入能够检测FAM荧光的仪器中，在39℃条件下反应15分钟。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。检测结果如附图1所示，由图1可以看出，添加血吸虫DNA的样品随着等温扩增荧光信号成对数曲线增长，而阴性对照的荧光信号则不增长。
实施例2
样品来源：由日本血吸虫成虫提取的基因组DNA，DNA的浓度为70ng/μL。
设计以下血吸虫引物和探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成：
正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,
反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’。
荧光探针的序列为：
5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’
配制扩增体系
在200μL离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制(体积为100μL)：
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉未状扩增体系。
向离心管中加入终浓度为6％(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇作为反应缓冲液将扩增体系重新溶解成为98μL，再加入制备好的2μL血吸虫基因组DNA，混合均匀，瞬时离心，放入能够检测FAM荧光的仪器中，在38℃条件下反应15分钟。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。通过观察荧光信号强弱变化判断样品中是否存在血吸虫DNA。
实施例3
样品来源：由日本血吸虫成虫提取的基因组DNA，DNA的浓度为82ng/μL。
设计以下血吸虫引物和探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成：
正向引物序列：5’-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3’,
反向引物序列：5’-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3’。
荧光探针的序列为：
5’CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3’
配制扩增体系
在200μL离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制(体积为50μL)：
将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉未状扩增体系。
向离心管中加入终浓度为6％(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇作为反应缓冲液将扩增体系重新溶解成为49μL，再加入制备好的1μL血吸虫基因组DNA，混合均匀，瞬时离心，放入能够检测FAM荧光的仪器中，在39℃条件下反应10分钟。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。通过观察荧光信号强弱变化判断样品中是否存在血吸虫DNA。
以上实施例说明使用本发明的方法能够快速检测血吸虫DNA，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，不依赖热循环仪，操作简单，能够在较低的温度(35～45℃)下对血吸虫DNA进行检测，并且扩增所用时间短(5～20min)，荧光信号易于收集，能够实时检测，适用于基层和现场的大规模筛选检测。另外，本发明所提供的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。