本发明属于医药技术领域，特别涉及一种蛋白琥珀酸亚铁及其制备方法和用途。
本发明所涉及的蛋白琥珀酸亚铁（iron(ii)caseinsuccinylate）(琥珀酰酪蛋白-亚铁)，其特征在于铁含量在5%以上，其中琥珀酰酪蛋白与亚铁离子的络合率不低于98%，可用于预防与治疗缺铁性贫血及具有缺铁性症状的患者。
背景技术：
众所周知，铁是人体必需的微量元素之一，是人体血液中血红蛋白、肌红蛋白及多种酶的重要组成部分，对人体具有重要的生理作用。贫血(aniema)是指循环血液中的红细胞数或血红蛋白长期低于正常值的病理现象。通常贫血分为三类：缺铁性贫血(irondeficiencyaneima，ida)、巨幼红细胞性贫血和再生障碍性贫血。缺铁性贫血产生原因主要为血液损失或铁吸收不足所致，如女性月经过多、消化系统溃疡、痔疮等慢性失血性贫血，营养不良、妊娠、儿童生长期等缺铁性贫血。who报告同时指出，缺铁无论是否贫血，对人的健康危害极大。孕妇如果缺铁，将给孕妇和胎儿生命安全带来很大隐患；而儿童缺铁对其身体和智力发育有较大损害；缺铁还能降低体力劳动者的劳动能力和效率。铁是人体需求量最大，而又最容易发生代谢障碍的微量元素。文献报道我国13亿人口中，有约4亿缺铁性贫血病患者，每年2000万孕妇中就有66.3%需要食用补铁药物，在6个月至2岁婴儿铁缺乏发病率为75%~82.5%，6岁至12岁为21.6%,女性发病率为43.3%。铁剂是治疗缺铁症的特效药，是治疗缺铁性贫血的唯一安全、有效和经济的方法，市场潜力巨大。
铁衍生物在药品中广泛使用，用于预防和治疗贫血和妊娠期铁缺乏、吸收不良综合征、哺乳期铁缺乏和生长期铁缺乏；但在铁被人体摄入到达十二指肠时，由于肠液呈碱性，铁离子常会形成难于溶解的氢氧化铁，从而阻碍了铁的吸收利用，因此铁的生物利用率较低。
国内外临床上使用的铁剂主要有三类。第一类为口服无机铁盐，最常见的为硫酸亚铁，氯化亚铁。这些无机金属铁盐被人体摄入后，部分金属离子不仅不易被吸收，还会刺激胃肠，引起腹泻，耐受性极差。此外，不同金属元素之间的拮抗作用也会使吸收进入体内的金属元素利用率和沉积效率受到限制，导致其生物有效性降低。
第二类是有机酸或氨基酸与铁形成的有机小分子铁配合物，比如如草酸亚铁，琥珀酸亚铁；酒石酸亚铁、富马酸亚铁、抗坏血酸亚铁、乳酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、天冬氨酸亚铁等，这类铁剂较无机铁剂而言，副作用减少，在安全性和耐受性方面得到了一定程度的改善，但仍不够理想。第三类是大分子铁配合物，比如右旋糖酐铁、蛋白琥珀酸铁、多糖铁复合物等，其中蛋白琥珀酸铁和多糖铁在安全性和耐受性方面显示了其优点。
文献报道，还原铁即二价铁较三价铁易被人体吸收，所以国内外以口服为主的铁剂无论是无机铁盐还是小分子配合物均以亚铁盐为主。因此将可能会改善铁剂耐受性的大分子与更易吸收的亚铁盐作用生成大分子亚铁配合物应是铁剂研究的一个新方向，当然，二价铁易被氧化成三价铁，如何保持二价铁盐的稳定以及增加大分子与二价铁离子的位点也是需需要解决的问题。总之，研究大分子亚铁配合物，以期获得获得耐受性更好，吸收率更好的铁制剂非常必要。
蛋白琥珀酸亚铁的研究还未见报道，本发明技术首次建立了利用酪蛋白结合琥珀酸酐再与铁进行络合制备琥珀酰酪蛋白-亚铁的工艺，并利用白琥珀酸亚铁具有含铁量高、生物利用率高、耐受性高、顺应性好等特点，将其开发成蛋白琥珀酸亚铁作为新型的补铁药物或报价食品，其市场潜力巨大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于制备琥珀酰酪蛋白-亚铁的方法，所述方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁具有酰化度高、载铁量大、溶解性好、质量稳定、杂质含量低和疗效显著等优点，所述方法包括如下步骤：
(a)在反应釜里加入酪蛋白和8~100倍体积的水，25℃~45℃下搅拌10min~30min；加入4mol/l氢氧化钠溶液调节ph值在7.0~9.0使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中按重量比酪蛋白∶琥珀酸酐1∶1~10∶1连续或分多次缓慢加入琥珀酸酐(时间间隔为30~300秒)，边加边4mol/l氢氧化钠溶液调节ph值在7.0~9.0，琥珀酸酐加完后继续反应10~25min，离心过滤，取上清液或滤液；上清液或滤液用3mol/l盐酸溶液调节ph值至1.0~4.6，使酪蛋白琥珀酸酐沉淀，离心过滤，用水洗沉淀，离心过滤，得酪蛋白琥珀酸。
(b)将上述酪蛋白琥珀酸置于反应釜中，加入8~15倍体积的水，用氮气作为保护气体充满整个反应釜，加4mol/l氢氧化钠溶液调节ph值在7.0~9.0使沉淀溶解，采用铁含量4%~10%且配置成12%的溶液来添加氯化亚铁或硫酸亚铁，25℃~45℃条件下搅拌反应10min~20min并加4mol/l氢氧化钠溶液调节控制ph值在6.0~7.0，得琥珀酰酪蛋白-亚铁溶液。
(c)将上述酪蛋白琥珀酸铁溶液用3mol/l盐酸溶液调节ph值至1.0~4.6，25℃~45℃搅拌反应10~30min，离心过滤，用水洗沉淀，离心过滤，得琥珀酰酪蛋白-亚铁。
(d)将上述沉淀置真空干燥箱(40℃~50℃)或冷冻干燥箱(-40℃)中干燥，得粉末状的琥珀酰酪蛋白-亚铁。
本发明所述的步骤(a)中，酪蛋白∶水的体积比优选1:8~1:15
本发明所述的步骤(a)中，反应的温度优选25℃~30℃。
本发明所述的步骤(a)中，搅拌反应的时间优选为20min~30min。
本发明所述的步骤(a)中，4mol/l氢氧化钠溶液调节ph值优选为8.0~9.0。
本发明所述的步骤(a)中，酪蛋白∶丁二酸酐的重量比优选为1:1~5:1。
本发明所述的步骤(a)中，琥珀酸酐间隔加入的时间优选为300秒。
本发明所述的步骤(a)中，琥珀酸酐反应的时间优选为15~20min。
本发明所述的步骤(a)中，3mol/l盐酸溶液调节ph值优选为3.8~4.6。
本发明所述的步骤(b)中，酪蛋白∶水的体积比优选1:8~1:15。
本发明所述的步骤(b)中，4mol/l氢氧化钠溶液调节ph值优选为8.0~9.0。
本发明所述的步骤(b)中，铁含量优选4%~7%。
本发明所述的步骤(b)中，反应的温度优选25℃~30℃。
本发明所述的步骤(b)中，搅拌反应的时间优选为15min~20min。
本发明所述的步骤(c)中，3mol/l盐酸溶液调节ph值优选为3.8~4.6。
本发明所述的步骤(c)中，反应的温度优选25℃~30℃。
本发明所述的步骤(c)中，搅拌反应的时间优选为20min~30min。
本发明所述的琥珀酰酪蛋白-亚铁的制备方法直接用酪蛋白为原料，反应收率高，产品纯度好。反复精制可以除去可能存在的酪蛋白、琥珀酸、氯化钠等杂质。采用冷冻干燥，得到的琥珀酰酪蛋白-亚铁蓬松，易粉碎，颜色均一，呈白色，无味，可溶于水。冷冻干燥后琥珀酰酪蛋白-亚铁性状良好，其他指标均符合要求。
本发明酪蛋白琥珀酸与铁的络合率可达98%，琥珀酰酪蛋白-亚铁中铁元素的含量可达5%以上。
本发明的又一目的是提供所述的琥珀酰酪蛋白-亚铁在制备治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为绝对和相对缺铁性贫血，由于铁摄入量不足或吸收障碍导致的急性或慢性失血以及各种年龄患者的感染所引起的隐性或显性缺铁性贫血和妊娠与哺乳期贫血。
本发明的又一目的提供所述的琥珀酰酪蛋白-亚铁用于制备药剂的用途，其中该剂型通常用于口服,如胶囊剂、颗粒剂及口服液等。
具体实施方式
以下的实施例用于说明和进一步解释本发明，但决不限制本发明。
如果没有特别指出，本发明中所述的百分比均指重量百分比。
一、实施例琥珀酰酪蛋白-亚铁的制备
实施例1
(a)制备酪蛋白琥珀酸
在25℃条件下，将5g酪蛋白悬浮于40ml水中，搅拌反应30min。加入4mol/l的naoh溶液将ph值调节至8.5。取1g琥珀酸酐，分三次加入到溶液中（每次加入的时间间隔为300s），并将ph维持在8.5，搅拌反应20min。离心过滤，取上清液或滤液。加入3mol/l的hcl调ph至3.8，使酪蛋白琥珀酸沉淀，离心过滤分离，用水洗沉淀。
(b)载铁反应
再加约105ml水，加入4mol/l的naoh溶液将ph值调节至8.5获得酪蛋白琥珀酸溶液，在氮气保护条件下，取1.136gfecl2配置成12%的溶液，缓慢加入到酪蛋白琥珀酸溶液中，搅拌反应15min，并将ph控制在6.0~7.0。
(c)精制
加入3mol/l的hcl调ph至3.8，搅拌反应30min，离心过滤，用水洗沉淀。
(d)冷冻干燥
将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10pa，以每小时升高2℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高2℃升温至30℃，保持6小时，破除真空，出箱得琥珀酰酪蛋白-亚铁4.45g。
实施例2
(a)制备酪蛋白琥珀酸
在25℃条件下，将5g酪蛋白悬浮于45ml水中，搅拌反应30min。加入4mol/l的naoh溶液将ph值调节至9.0。取5g琥珀酸酐，分三次加入到溶液中（每次加入的时间间隔为300s），并将ph维持在9.0，搅拌反应20min。离心过滤，取上清液或滤液。加入3mol/l的hcl调ph至4.6，使酪蛋白琥珀酸沉淀，离心过滤分离，用水洗沉淀。
(b)载铁反应
再加约110ml水，加入4mol/l的naoh溶液将ph值调节至9.0获得酪蛋白琥珀酸溶液，在氮气保护条件下，取1.79gfecl2配置成12%的溶液，缓慢加入到酪蛋白琥珀酸溶液中，搅拌反应15min，并将ph控制在6.0~7.0。
(c)精制
加入3mol/l的hcl调ph至4.6，搅拌反应30min，离心过滤，用水洗沉淀。
(d)冷冻干燥
将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10pa，以每小时升高2℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高2℃升温至30℃，保持6小时，破除真空，出箱得琥珀酰酪蛋白-亚铁4.12g。
实施例3
(a)制备酪蛋白琥珀酸
在30℃条件下，将5g酪蛋白悬浮于75ml水中，搅拌反应20min。加入4mol/l的nahco3溶液将ph值调节至8.0。取5g琥珀酸酐，分三次加入到溶液中（每次加入的时间间隔为300s），并将ph维持在8.0，搅拌反应20min。离心过滤，取上清液或滤液。加入3mol/l的hcl调ph至4.6，使酪蛋白琥珀酸沉淀，离心过滤分离，用水洗沉淀。
(b)载铁反应
再加约110ml水，加入4mol/l的naoh溶液将ph值调节至8.0获得酪蛋白琥珀酸溶液，在氮气保护条件下，取1.63gfecl2配置成12%的溶液，缓慢加入到酪蛋白琥珀酸溶液中，搅拌反应15min，并将ph控制在6.0~7.0。
(c)精制
加入3mol/l的hcl调ph至4.6，搅拌反应30min，离心过滤，用水洗沉淀。
(d)冷冻干燥
将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10pa，以每小时升高2℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高2℃升温至30℃，保持6小时，破除真空，出箱得琥珀酰酪蛋白-亚铁4.06g。
实施例4
(a)制备酪蛋白琥珀酸
在30℃条件下，将5g酪蛋白悬浮于75ml水中，搅拌反应30min。加入4mol/l的nahco3溶液将ph值调节至8.5。取1g琥珀酸酐，分三次加入到溶液中（每次加入的时间间隔为300s），并将ph维持在8.5，搅拌反应30min。离心过滤，取上清液或滤液。加入3mol/l的hcl调ph至4.0，使酪蛋白琥珀酸沉淀，离心过滤分离，用水洗沉淀。
(b)载铁反应
再加约110ml水，加入4mol/l的naoh溶液将ph值调节至8.5获得酪蛋白琥珀酸溶液，在氮气保护条件下，取1.136gfecl2配置成5%的溶液，缓慢加入到酪蛋白琥珀酸溶液中，搅拌反应15min，并将ph控制在6.0~7.0。
(c)精制
加入3mol/l的hcl调ph至4.0，搅拌反应25min，离心过滤，用水洗沉淀。
(d)冷冻干燥
将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10pa，以每小时升高2℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高2℃升温至30℃，保持6小时，破除真空，出箱得琥珀酰酪蛋白-亚铁4.17g。
二、试验例
试验例1实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁及中间体的质量及稳定性研究采用实施例1-4所制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁样品进行研究。
(1)中间体酪蛋白琥珀酰的酰化度测定
本发明所述方法分两步，关键中间体为酪蛋白琥珀酰，酰化度的检测是为了检查酰化的程度，酰化度高有利于载铁反应的进行和样品的粘度、溶液均一性。所以酰化度是控制中间体琥珀酸蛋白的一个重要指标，对最终产物琥珀酸蛋白铁的质量具有至关重要的影响。我们进行了酰化度测定的方法学研究，并建立了中间体质量控制指标(酰化度大于94％)。
方法：参照茚三酮测氨基酸含量的经典方法。茚三酮溶液与蛋白质共热，茚三酮与蛋白质中游离的氨基反应生成氨气，氨气与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与游离氨基的含量成正比，可通过测定570nm波长处的吸光度，测定游离氨基的含量。
仪器：tu-1810型紫外可见分光光度北京普析通用仪器有限责任公司
测定法及计算方法：精密量取酪蛋白对照溶液和供试品溶液各2ml，分别置2个10ml试管，各加1ml显色剂，水浴15min，冷水中冷却至室温，各加40％乙醇5ml，然后分别用水定容至10ml量瓶，放置20min，在570nm波长处测定吸光度，同时做空白校正。
计算公式：
式中：asp为琥珀酸蛋白供试品溶液的吸光度
ap为酪蛋白对照溶液的吸光度
csp为琥珀酸蛋白供试品溶液的浓度
cp为酪蛋白对照溶液的浓度
对实施例1-4的制备过程中酪蛋白琥珀酰酰化度进行了测试，其结果见表1。
表1实施例1-4制备的中间体酰化度结果
(2)实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁的铁含量及杂质测定
2.1氯化物
本品原料在合成过程中由于使用了盐酸，最后不可避免引入氯化物。故应对其在原料中含量进行控制。为检测出原料氯化物含量，采用中国药典2010年版二部附录ⅷa比浊法进行测定。
方法：取本品0.25g，加磷酸盐缓冲液（ph7.6）约30ml，搅拌溶解，然后加入0.05mol/l硫酸溶液调ph值至2.5～3.0使其完全沉淀，过滤，并用适量水洗沉淀，合并滤液，置500ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，依法检查（中国药典2010年版二部附录ⅷa），分别与标准氯化钠溶液1.0ml、2.5ml制成的对照液比较。
对实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁进行了氯化物测试，测试结果见表2。结果表明：实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁溶液显色均浅于2.5ml标准氯化钠溶液制成的对照液的显色，即样品中的氯化物均低于0.5％
表2氯化物测定结果
2.2硫酸盐
本品原料在合成过程中由于使用了硫酸亚铁，最后不可避免引入硫酸盐。故应对其在原料中含量进行控制。为检测出原料硫酸盐含量，采用中国药典2010年版二部附录ⅷb中方法进行测定。方法如下：取本品0.25g，加0.1mol/l氢氧化钠（ph7.6）约30ml，搅拌溶解，然后加入0.1mol/l盐酸溶液调ph值至2.5～3.0使其完全沉淀，过滤，并用适量水洗沉淀，合并滤液，置500ml量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，依法检查（中国药典2010年版二部附录ⅷb）,与标准硫酸钾溶液1.0ml制成的对照液比较，不得更浓（0.2%）。对实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁中硫酸盐进行了测试，测试结果见表3。结果表明均小于0.2%。
表3硫酸盐的测定结果
2.3琥珀酸
本发明的制备方法在制备过程中用到了琥珀酸酐，在水中的形式是琥珀酸，虽然精制过程中可以除去大量残留的琥珀酸，但可能仍有少许残留，为了保证药品质量的安全性，采用高效液相色谱法检测原料中残留的琥珀酸，方法如下：色谱仪：agilent1100serieshplc仪，agilent化学工作站色谱柱：aichrombond-aqc18250mm×4.6mm，5μm。以0.025mol/l磷酸二氢钾溶液(磷酸调节ph值至3.0)为流动相；检测波长为210nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。理论板数按琥珀酸计算应不低于2000。用高效液相色谱法作为琥珀酸残留限度测定方法，精密度高、线性关系良好，样品测定处理方法回收率也符合要求，能够科学、合理、有效的控制本产品的质量。
对实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁中琥珀酸进行了测试，结果见表4，实验结果表明其琥珀酸含量均低于0.05％。
表4琥珀酸含量限度测定结果
2.4总铁的测定
采用岛津gfa6880原子吸收分光光度计,以火焰法测定消化处理的样品。测定模式为积分模式，灯电流为5ma，检测波长为248.3nm,狭峰宽度为0.2mm。对实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁中总铁进行了测试，结果见表5，结果表明其总铁含量均在5%~6％范围内，铁含量较高。
表5铁含量测定数据
2.5游离铁
琥珀酰酪蛋白-亚铁应是一种无离子状态的二价铁的络合物，产品可能存在内在的降解和本身的不纯，都会导致游离铁的存在，它的存在会影响铁含量测定的准确性和产品质量，所以游离铁的测定和限值很重要。与标准铁溶液(中国药典2010年版二部附录viiig)制成的对照液比较，供试品溶液的吸光度小于对照液的吸光度(0.1％)视为未检出。
取10ml、5%琥珀酰酪蛋白-亚铁溶液,在3000r/min下离心15min,倾出上清液,加人10ml去离子水,在同样条件下离心,水洗两次,收集上清液,定容至50ml,用邻菲罗啉法测水洗液中铁离子含量,即为游离铁量。对实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁中游离铁进行测试，结果见表6，结果表明其游离铁含量均小于0.1%。
表6游离铁测定结果
（3）实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁的长期试验
对实施例1-4的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁进行了长期试验，结果见表7，实验结果表明：拟上市包装的蛋白琥珀酸亚铁原料，在25℃±2℃，相对湿度60%±10%的条件下长期考察24个月，其形状、溶液澄清度、干燥失重、游离铁、铁含量等考察指标均无明显变化，琥珀酸的含量有增加，但还在拟定标准之内。
表7长期实验测试结果
试验例2实施例1的制备方法制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁对动物缺铁性贫血的干预效果
方法：40只sd大鼠按照廖氏方法制成贫血模型后随机分为空白组和实验组，空白组给予等量的生理盐水，实验组给予琥珀酰酪蛋白-亚铁的溶液10ml(10mg/kg)，一个月后测定血红蛋白(hb)和红细胞(rbc)。
结果见表8，实验组较空白组hb、sf、rbc含量显著性增加。实施例1制备的琥珀酰酪蛋白-亚铁可明显改善缺铁性贫血大鼠铁营养状况，并且明显优于空白组。
表8琥珀酰酪蛋白-亚铁对动物缺铁性贫血的干预效果
**p＜0.01
虽然，本发明已通过以上实施例得到清楚说明，然而在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的变化和修正，但这些相应的变化和修正都应属于本发明的权利要求的保护范围。