本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种源自于汤普森多毛菌的核糖体毒素（hta）重组基因及其制备重组蛋白的方法与应用。
背景技术：
：汤普森多毛菌（hirsutellathompsonii）是一种真菌杀螨剂，早在上世纪70年代就被用来防治螨等害虫。近年来的研究发现，汤普森多毛菌产生的糖体毒素（hta）与其杀虫活性之间存在紧密联系，其发酵液也存在杀虫活性，而从发酵液中纯化的核糖体毒素同样能杀死昆虫害虫。虽然hta具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然核糖体毒素的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，目前从1升天然发酵液中仅能纯化不到1毫克的蛋白，而利用外源基因表达系统也中能从1升的培养物中获得毫克级的重组蛋白，这就给我们进一步研究该毒素的生物活性及杀虫特性带来了很大的困难。因此，建立高效的外源基因表达系统及其蛋白的制备方法将有助于解决当前所遇到的无法获得大量蛋白的瓶颈。而当前的大肠杆菌和酵母表达系统表达该蛋白还存在明显的不足之处：现有技术将核糖体毒素构建表达载体，然后转化到e.colibl21(de3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过在体外合适的条件下进行溶解、变性、复性和纯化，从每升培养基仅能得到微量的可溶性蛋白质，生产量极低；将构建的表达载体在酵母中表达的方法，但其表达量低且分离纯化十分困难。因此，通过改造hta的dna序列且优化hta表达和纯化方法来高效生产hta重组蛋白将可以彻底解决hta的活性测定、杀虫谱分析和在抗虫中的应用等问题。本发明将首次提供一种完整且高效解决该问题的可行方法。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种核糖体毒素hta重组基因及其制备蛋白的方法与应用。本发明提供基因，为编码核糖体毒素hta类蛋白的基因，为如下（1）-（3）中任意一种的dna分子：（1）由序列表中序列1所示的dna分子；（2）在严格条件下与（1）限定的dna序列杂交且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的dna分子；（3）与（1）限定的dna序列至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的dna分子。所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（sds）、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1%sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1%sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1%sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1%sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1%sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5%sds的溶液中，在65oc下杂交,然后用2×ssc,0.1%sds和1×ssc,0.1%sds各洗膜一次。其中，序列表中的序列1由411个脱氧核苷酸组成，本序列包括hta基因的成熟蛋白全长读码框、终止密码子和基因克隆位点等主要位点，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的重组蛋白质。由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。本发明提供蛋白，是如下（1）或（2）：（1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有毒杀昆虫活性的由序列2衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列2由130个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体ppiczαa的xho和xba酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。本发明的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括以下步骤：s1：将权利要求1所述的基因和表达载体ppiczα分别用xhoⅰ和xbaⅰ双酶切并纯化回收目标dna片段，然后利用连接酶在16°c连接，得重组载体ppiczαa-hta；s2：将所述重组载体ppiczαa-hta用sacⅰ单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过zeocin筛选得到阳性克隆；s3：将所述阳性克隆转接至含有1000~1500μg/mlzeocin的ypd平板，筛选得到高zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用bmgy培养基培养至od600为10~15，离心收集细胞沉淀，用bmmy培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1.0%~1.5%，诱导24小时，收集发酵的上清液；在诱导表达之前，优选地将高zeocin抗性的转化子用bmmy小量诱导表达，筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，再用bmgy培养基培养诱导表达。优选地，在步骤s3的诱导24小时之后且收集发酵的上清液之前，还包括进一步诱导表达的如下步骤：s4：在28°c继续诱导培养72小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1.0%~1.5%。优选地，在步骤s4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：s5：将s4步骤所得的经72小时甲醇诱导的培养液离心分离并取上清液，将上清液利用50~100倍体积的ph8.0~8.5的20mm的tris-hcl透析过夜后，调节ph至8.0~8.5，以大于或等于15000g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液上样到经ph8.0~8.5tris-hcl缓冲液平衡后的cm阳离子交换层析柱，用5~10倍层析柱体积的ph8.0~8.5的含20mmtris-hcl和50~100mmnacl的缓冲液漂洗所述cm阳离子交换层析柱；s6：用含20mmtris-hcl和400~800mmnacl的缓冲液洗脱所述cm阳离子交换层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kda的透析袋于10mmtris-cl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。优选地，在步骤s6之后，还包括保存蛋白的如下步骤：s7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80°c下速冻，然后冷冻干燥。根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。通过步骤s3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达核糖体毒素hta的酵母转化子也属于本发明保护的范围。上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗虫领域中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将上述蛋白的编码基因导入到目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。上述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的抗虫性能得到改良。本发明还提供一种培育转基因病毒的方法，是将上述蛋白的编码基因转入到目的病毒中，得到转基因病毒，所述转基因病毒的抗虫性高于所述目的病毒，所述目的病毒优选为杆状病毒、核型多角体病素和质型多角体病毒中的一种。本发明提供的技术方案具有以下优点：一是根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组核糖体毒素hta能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体ppiczαa-hta上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持核糖体毒素hta的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得核糖体毒素hta的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达昆虫毒素hta的方法和快速高效纯化核糖体毒素hta的方法，可以降低成本且实现大量生产；五是纯化的重组蛋白对昆虫害虫具有显著的杀虫活性。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明图1为本发明实施例中的真核表达载体ppiczαa-hta构建示意图；图2为本发明实施例中高水平分泌表达重组hta的酵母转化子的sds-page检测结果图；图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的sds-page检测结果图；图4为本发明实施例中洗脱所得纯化得hta蛋白的sds-page检测结果图；图5为本发明实施例中纯化hta蛋白浓缩后的sds-page检测结果图；图6为本发明对比例中天然hta基因筛选到的酵母转化子诱导产物的sds-page检测结果；图7为本发明实施例中优化后的重组hta蛋白的细胞水平生物学活性结果示意图；图8为本发明实施例中优化后重组hta蛋白的昆虫注射水平生物学活性结果示意图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒ppiczαa均购自美国invritrogen公司。所用培养基配方如下：1）酵母生长培养基（bmgy）：完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800ml。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100ml1m磷酸钾溶液，100miynb，2ml500×生物素，20ml50%灭菌甘油；2）酵母诱导培养基（bmmy）完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800ml。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100ml1m磷酸钾溶液，100mlynb，2ml500×生物素，10ml甲醇；3）ypd培养基完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900ml，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100ml20%灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.5-1.8%的琼脂可制得ypd固体培养基；4）ypg培养基完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g甘油，定容到1000ml，121℃蒸气高压灭菌15-20min。实施例一本实施例提供了一种优化的人工合成的hta基因，具体序列如序列表中的序列1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列2所示。本实施例的优化前的序列是根据ncbi数据库提供的dna序列，是合成hta的天然dna，然后根据毒素基因和毕赤酵母密码子表达特点，优化并合成优化后的dna。优化后的dna序列与hta的天然dna序列(genbank登录号m27706)经ncbi比对，没有明显相似性。将优化前的hta的天然dna和优化后的dna分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体ppiczαa上，得到重组载体，然后利用invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌x-33中，转化后分别用含有100µg/mlzeocin抗生素的ypd平板进行筛选，利用pcr对转化子进行验证，将pcr验证后的毕赤酵母转化子划线分别接种至含有不同浓度的zeocin抗生素的ypd平板，分别筛选得到含优化前的hta天然dna的高抗性的毕赤酵母转化子和含优化后的人工合成的dna的高抗性的毕赤酵母转化子，然后分别用bmmy小量诱导表达，再进行sds-page分析。分析结果显示用优化前的hta天然dna构建得到的毕赤酵母转化子不会表达目标蛋白，而用优化后的人工合成的dna构建得到的毕赤酵母转化子能表达并分泌目标蛋白。实施例二本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：s1：构建表达载体及转化：将实施例一的优化后的人工合成的dna连接至毕赤酵母分泌型表达载体ppiczαa，得到重组载体ppiczαa-hta，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体ppiczαa-hta构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：（1）用xhoⅰ和xbaⅰ双酶切含优化后合成的hta基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连takara公司）：含合成的hta基因的质粒15μl10×m缓冲液5μlxhoⅰ5uxbaⅰ5u无菌水至50μl（2）用xhoⅰ和xbaⅰ双酶切ppiczαa，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连takara公司）：质粒ppiczαa15μl10×m缓冲液5μlxhoⅰ5uxbaⅰ5u无菌水至50μl（3）将步骤（1）和（2）得到的目的片断和载体片断用dna凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连takara公司，具体操作按试剂盒说明书进行。（4）将步骤（3）回收得到的目的片断和载体用t4dna连接酶（购自大连takara公司）进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：载体ppiczαa片段1μl目的片段落3μl10×缓冲液1μlt4连接酶0.5μl无菌水至10μls2：重组质粒的转化：将所述重组载体ppiczαa-hta用sacⅰ单酶切线性化，按照invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是x-33。转化后用含有100µg/mlzeocin抗生素的ypd平板进行筛选，利用pcr对转化子进行验证。s3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将pcr验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有不同浓度的zeocin抗生素的ypd平板，筛选得到1000-1500µg/ml高zeocin抗性的转化子，将高抗性的转化子用bmmy小量诱导表达，筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，选取高水平分泌表达的酵母转化子单菌落，接种至装有50mlypg液体培养基的250ml三角瓶中，在28℃，300rpm培养条件下培养至菌体od600=6.0，取上述菌液，接种至含500mlbmgy培养基的2l摇瓶中，每甁接种5ml，于28℃，250rpm培养至od600=12；室温下2500g离心5min，收集菌体，用1/7原培养体积的bmmy重悬菌体，向培养基中添加100%甲醇至终浓度（质量分数）为1.0%~1.5%，诱导24小时，在28°c继续诱导培养72小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1.0%~1.5%，收集发酵的上清液。需要说明的是，将高zeocin抗性的转化子用bmmy小量诱导表达，经sds-page分析，从十株高抗性(抗性水平大于或等于1000µg/mlzeocin)转化子中筛选得到一株稳定且高水平分泌表达核糖体毒素hta的酵母转化子，而从50株抗性水平低于500µg/mlzeocinypd平板的转化子没有筛选到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，部分高水平转化子筛选的sds-page结果如图2所示，其中1-8转化子为高zeocin抗性的核糖体毒素hta的酵母转化子，9和10转化子为低zeocin抗性的核糖体毒素hta的酵母转化子，很明显1-8转化子在目标位置有明显的蛋白表达。用sds-page检测甲醇诱导下不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的sds-page检测结果图。经诱导1~4天，在15kda左右均有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甲醇，诱导得到的目的蛋白含量更高，具体目的蛋白占全菌蛋白的总量结果如下表1所示。表1不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果诱导时间1天2天3天4天百分比含量（%）8172220实施例三本实施例提供一种纯化hta蛋白的方法，在步骤s3之后，具体还包括如下步骤：s4：将s3培养3天得到的上清液于4℃离心，将所得上清液利用naoh调节ph在8.0~8.5以大于或等于15000g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液上样到经ph8.0~8.5的20mmtris-hcl缓冲液平衡后的cm阳离子交换层析柱，用5~10倍层析柱体积的ph8.0~8.5的含20mmtris-hcl和50~100mmnacl的缓冲液漂洗所述cm阳离子交换层析柱；s5：用ph8.0~8.5含20mmtris-hcl和400~800mmnacl的缓冲液洗脱所述所述cm阳离子交换层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kda的透析袋于10mmtris-cl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。s6：浓缩产品于-80°c冰箱中速冻后冷冻干燥，即得高纯度的重组hta蛋白冻干粉。需要说明的是，将步骤s5洗脱下来的纯化蛋白进行sds-page分析，结果如图4所示，图4为本发明实施例中可以看出洗脱得到了纯化的目标蛋白。将洗脱液利用分子量10kda的透析袋于10mmtris-hcl缓冲液中透析后利用截留分子量10kda的15ml超滤管将样品浓缩20倍。取20微克的纯化蛋白，sds-page检测结果如图5所示，仅在目标位有蛋白条带，说明得到了高纯度的hta重组蛋白。对比例人工合成的核糖体毒素hta天然dna，以同样的方法连接到ppiczαa载体，以相同的酶进行线性化并以相同的方法转化毕赤酵母x33菌株，转化后用含有100µg/mlzeocin抗生素的ypd平板进行筛选，利用pcr对转化子进行验证。再将所得的转化子涂布到1000~1500µg/mlzeocin的ypd平板，筛选50个转化子，分别接种至装有50mlypg液体培养基的250ml三角瓶中，在28℃，300rpm培养条件下培养至菌体od600=6.0，取上述菌液，接种至含500mlbmgy培养基的2ml摇瓶中，每甁接种5ml，于28℃，250rpm培养至od600=12；室温下2500g离心5min，收集菌体，用1/7原培养体积的bmmy重悬菌体，向培养基中添加100%甲醇至终浓度（质量分数）为1.0~1.5%，诱导24小时，在28°c继续诱导培养72小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1.0~1.5%，收集发酵的上清液。sds-page结果显示未能见到目标蛋白的表达条带，sds-page检测结果如图6所示。本实施例提供的技术方案目的蛋白hta的表达量极大提高，从s3收集发酵的上清液，经过步骤s4和s5纯化，从1l的诱导培养液中可以纯度在95%以上的hta蛋白近30mg，而对比例中，没有目标蛋白的表达。将本实施例得到hta蛋白进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下。实验方法一：在10cm培养皿中将昆虫细胞sf9于昆虫细胞培养基中培养至90%生长密度，胰酶消化并将细胞浓度调整至5×105cell/ml，向96孔细胞培养板中每孔加入100μl的昆虫sf9细胞悬液，培养过夜后，向各培养孔分别加入不同终浓度的a、b或c组的hta蛋白(0、1、2、4、16、32ng/ml)，每个浓度3个平行孔，将上述细胞于标准条件下培养48小时，显微镜下测定细胞的生长成况。实验结果一：图7为本发明实施例中优化后的重组hta蛋白的细胞增殖活性测定结果示意图。如图7所示，1ng/ml的重组hta蛋白就能抑制昆虫细胞sf9的生长，mtt法测得的吸光值明显下降，当浓度达到16ng/ml时细胞已经大量死亡，测得的吸光值与32ng/ml一样都接近于0。细胞增殖活性测定结果表明，本发明所采用的方法制备的hta重组蛋白具有很高的生物学活性。实验方法二：用pbs将纯化后的hta重组蛋白稀释至1mg/ml，按5μg/g体重注射大腊螟幼虫（0.3±0.05g），每组30只，各注射3组；同时以注射相同体积pbs的大腊螟幼虫为对照，观察大腊螟幼虫的中毒症状和死亡比例。实验结果二：实验结果2：结果发现，注射纯化后的hta重组蛋白的大腊螟幼虫表现出了核糖体毒素的中毒症状即昆虫的多酚扭送化酶体系被破坏从面导致虫体呈现褐色甚至黑色，注射hta与pbs的昆虫的昆体的颜色如图8所示。注射hta的虫子在24小时内死亡率达到80%，在48小时内死亡率达到100%，而注射相同体积pbs的对照组幼虫无一出现中毒症状。动物注射实验结果同样体现出该重组蛋白具有的杀虫活性。注射hta重组蛋白后，大腊螟幼虫死亡率具体结果如表2所示：表2生物学活在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。sequencelisting<110>怀化学院<120>一种核糖体毒素及其编码基因与应用<130>1<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>411<212>dna<213>hirsutellathompsonii<400>1ctcgagaaaagagccccaatcgtcacctgcagaccaaagttggacggtagagagaagcca60ttcaaggtcgacgtcgccactgcccaggctcaagccagaaaggccggtttgaccaccggt120aagtccggtgacccacacagatacttcgccggagaccacatcagatggggtgtcaacaac180tgcgacaaggccgacgccatcttgtgggagtacccaatctactgggtcggtaagaacgcc240gagtgggccaaggacgtcaagacctcccagcagaagggtggaccaaccccaatcagagtt300gtctacgccaactccagaggtgccgtccaatactgcggagtcatgacccactccaaggtc360gacaagaacaaccagggaaaggagttcttcgagaagtgcgactaatctaga411<210>2<211>130<212>prt<213>hirsutellathompsonii<400>2alaproilevalthrcyslysprolysleuaspglylysglulyspro151015phelysvalaspvalalathralaglnalaglnalalyslysalagly202530leuthrthrglylysserglyaspprohislystyrphealaglyasp354045hisilelystrpglyvalasnasncysasplysalaaspalaileleu505560trpglutyrproiletyrtrpvalglylysasnalaglutrpalalys65707580aspvallysthrserglnglnlysglyglyprothrproilelysval859095valtyralaasnserargglyalavalglntyrcysglyvalmetthr100105110hisserlysvalasplysasnasnglnglylysgluphepheglulys115120125cysasp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