miR‑320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物的试剂盒的制作方法

本实用新型属于医疗器械领域，具体涉及一种将miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物的试剂盒。

背景技术：

慢性下肢缺血源于下肢动脉粥样硬化狭窄或闭塞导致的下肢供血不足，是最常见的使人失去正常行走能力的一类疾病，称之为下肢动脉硬化闭塞症，主要表现为间歇性跛行、下肢静息痛以及坏疽等，严重影响患者的生活质量甚至危及生命。随着我国生活水平的改善以及人口老龄化，下肢动脉硬化闭塞症的发病率也在逐年提高。

近年来随着医疗技术的飞速发展，下肢动脉硬化闭塞症的治疗也呈现多元化，如，旁路术、内膜剥脱术以及介入治疗等均能够有效恢复血供、改善症状³。在临床诊疗中，由于下肢动脉硬化闭塞症患者罹患疾病时往往年龄较高，且常合并冠心病、心力衰竭、脑梗等多种疾病，综合评估患者一般情况对旁路术和内膜剥脱术的耐受性较差。介入治疗以其创伤小、术后恢复快等优点相对于其他两种治疗方法在下肢动脉硬化闭塞症的手术治疗中更被广泛应用。与此同时，有学者关注到“暂时灌注提高”现象，即下肢动脉硬化闭塞症导致的慢性下肢缺血在介入治疗后，闭塞段动脉灌注得以暂时改善，为缺血组织的修复和闭塞段动脉周围侧枝循环的形成争取了一定时间，但当介入干预后的动脉再次狭窄或闭塞时，就会使得原有病变处于亚临床缺血状态。因此，术后再狭窄成为了影响部分患者远期疗效的关键问题之一。

目前，针对术后再狭窄的CTA、血管造影等检查手段，因诊疗资源有限、检查费用昂贵等多种因素，往往不能在患者长期随访中常规实施，而需要患者再次出现间歇性跛行、静息痛甚至坏疽时才得以实施，此时往往需要再次手术甚至已失去保肢治疗的机会，严重者危及患者生命。因此，寻找下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄的早期诊断生物标记物成为了亟待解决的关键科学问题之一，这对及时采取有效治疗措施、监测病情发展以及避免严重并发症发生具有重要意义。

Ranasinghe等提出了理想的早期诊断指标应具备的一般特点：灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉、具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商。为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄生物标记物的研究提供了理论标准。

在临床诊疗过程中，许多实验室检查项目以其迅速、能够在床边完成、并且对疾病具有较高的敏感度和特异度等特点，得到了广泛应用。近年来科学的重大发现微小RNA(mircoRNA，miRNA)是一类在人类和动物广泛存在并高度保守的小分子非编码RNA，其在心血管组织细胞发育与分化及结构形成异常过程中扮演了极为重要的角色。

新近研究表明，miRNA因具有组织特异性及高度保守的特性，使其具有作为疾病生物标记物的强大潜质。Ai等通过急性心肌梗死患者与对照组比较，结合模型小鼠中miR-1的过表达，证实在急性心肌梗死患者循环血中miR-1水平显著增高，两周后恢复到基础水平的变化趋势；荆清教授等报道了急性心肌梗死患者较健康人循环血中显著增高的miR-208a，其血浆水平随病情转归而变化，且外周血中miR-208a早于心肌肌钙蛋白出现的特性，提示miR-208a可能是急性心肌梗死一个更敏感的早期生物标志物。

那么，下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄的过程中是否也伴随着特定miRNA的表达改变，这些miRNA中是否会存在下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄潜在生物标记物呢，至今尚未有人给出答案。

现有技术中不乏以miRNA作为鉴别标记物的试剂盒，该种试剂盒能够快速简便地将血液或组织中的miRNA提取出来，并对其进行逆转录和实时定量PCR以达到鉴别疾病的目的。

然而，在这些试剂盒中，逆转录和实时定量PCR中的试剂瓶是直接插在冰盒内的冰中的。若检测的时间过长，冰盒里的冰就容易溶化成水，这时就需要将冰盒里的水倒掉，重新填入冰。进行换冰操作时，首先将试剂瓶全部从冰盒中拿出，将冰盒中的水倒掉，而后重新向内装填冰，然后将试剂瓶挨个插入冰上，最后将冰盒放入试剂盒内。本领域技术人员均知晓，逆转录和实时定量PCR中的试剂瓶多达几十种，上述换冰操作不仅会浪费掉操作人员大量的时间，而且容易致使试剂瓶脱离冰的时间过长而发生变化，致使无法有效的将miRNA提取出来。

实用新型的内容

本实用新型是为解决上述问题而进行的，通过提供一种以miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物且其内的冰盒中的固定板和冰盒盒体可拆卸连接的试剂盒，从根本上解决上述问题。本实用新型采用了如下技术方案：

本实用新型提供的miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物的试剂盒，具有盒体和盖体，具有这样的特征，盒体被隔板分成四部分，分别为：耗材容纳部，被设置在盒体内的左下方，用于容纳离心管、配液管以及吸附柱；总RNA提取液容纳部，被设置在盒体内的右下方，用于容纳提取RNA所用的装有磁珠的试剂瓶以及分别装有裂解液、去蛋白液、洗脱液或不含核酸酶的水的试剂瓶；RNA逆转录试剂容纳部，被设置在盒体内的左上方，用于容纳装有RNA逆转录试剂的试剂瓶；以及实时定量PCR试剂容纳部，被设置在盒体内的右上方，用于容纳装有实时定量PCR试剂的试剂瓶。

其中，试剂盒内还包括冰盒，该冰盒被设置在所述RNA逆转录试剂容纳部以及所述实时定量PCR试剂容纳部的内部，用于将RNA逆转录试剂以及实时定量PCR试剂处于冰点的环境中，包括：冰盒盒体，用于容纳冰；固定板，设置在冰盒盒体的上方和冰盒盒体可拆卸连接，固定板上设置有多个贯穿孔，用于装有RNA逆转录试剂的试剂瓶和装有实时定量PCR试剂的试剂瓶的下半部分穿过并进入冰中；以及保护盖，设置在固定板的上方，和固定板转动连接，该保护盖由隔热材料制成，用于将固定板和外界环境隔离。

进一步的，RNA逆转录试剂容纳部以及所述实时定量PCR试剂容纳部的内壁上均设置有保温材料层，用于冰盒的保温。

进一步的，固定板的下表面积大于冰盒盒体的上开口面积，冰盒盒体的外壁面上分别设置有两个向外延伸的凸起，两个凸起之间形成一个凹槽，固定板和凹槽相对应的位置上设置有向下延伸的凸片，该凸起和所述凹槽嵌合连接。

进一步的，隔板的上表面设置有标签部，用于粘贴相应的标签。

实用新型的作用与效果

根据本实用新型提供的miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物的试剂盒，该试剂盒内设置有冰盒，该冰盒包括冰盒盒体、固定板以及保护盖。一方面，由于固定板设置在冰盒盒体的上方和冰盒盒体可拆卸连接，使得在对于冰盒内的冰进行更换的时候，无需将置于冰上的试剂瓶挨个取下，只需将固定板和冰盒盒体拆开即可对冰盒内的冰进行更换；另一方面，由于保护盖由隔温材料制成，并且和固定板转动连接，既使得固定板能够和外界环境隔离，又能够在冰盒盒体内的冰被更换完毕将固定板安装在冰盒上时，对试剂瓶起到一定的阻挡作用，以便于试剂瓶的下半部分被顺利插入冰中。

附图说明

图1是本实用新型的miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物的试剂盒的结构示意图；

图2是本实用新型的冰盒的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图来说明本实用新型的具体实施方式。

图1是本实施例的miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物的试剂盒的结构示意图。

如图1所示，试剂盒10包括盖体11和盒体12，盒体12被横挡板13和竖挡板14分隔成分成四部分，这四部分分别为耗材容纳部15、总RNA提取液容纳部16、RNA逆转录试剂容纳部17以及实时定量PCR试剂容纳部18。横挡板13和竖挡板14的宽度为8mm，用于粘贴相应的标签。

耗材容纳部15被设置在盒体12内的左下方，该部分又被挡板分隔成四部分，这四部分分别用于容纳离心管、配液管、吸附柱以及其他用量较少的耗材。

总RNA提取液容纳部16被设置在盒体12内的右下方，用于容纳提取RNA所用的装有磁珠的试剂瓶以及分别装有裂解液、去蛋白液、洗脱液或不含核酸酶的水的试剂瓶。

RNA逆转录试剂容纳部17被设置在盒体12内的左上方，其内设置有冰盒19，装有RNA逆转录试剂的试剂瓶被放置在冰盒内。在本实施例中，RNA逆转录试剂容纳部中容纳有十二个盛放有RNA逆转录试剂的离心管，其横截面为圆形，分别用于盛放RNA酶抑制剂溶液、逆转录酶溶液、逆转录酶缓冲液、外源参照物溶液、外源参照物逆转录引物溶液、miR-320a逆转录引物溶液以及四种脱氧核糖核苷酸的混合溶液(dNTPs)。其中RNA酶抑制剂、逆转录酶各一管，其他试剂各二管；

实时定量PCR试剂容纳部18被设置在盒体12内的右上方，和RNA逆转录试剂容纳部17一样，其内也设置有冰盒，装有实时定量PCR试剂的试剂瓶同样被放置在冰盒内。在本实施例中，实时定量PCR试剂容纳部容纳有十二个盛放有实时定量PCR试剂的离心管，横截面为正六边形，分别盛放含有DNA聚合酶的实时定量PCR混合液、外源参照物特异引物和探针溶液以及miR-320a特异引物和探针溶液，其中含有DNA聚合酶的实时定量PCR混合液为八管，外源参照物特异引物和探针溶液以及miR-320a特异引物和探针溶液各二管。

图2为本实施例中的冰盒的结构示意图。

如图2所示，冰盒19包括冰盒盒体20、固定板21以及保护盖22。冰盒盒体20用于容纳冰；固定板21设置在冰盒盒体20的上方，其下表面积大于冰盒盒体20的上开口面积，即，固定板21覆盖在冰盒盒体上。同时，固定板21上设置有多个贯穿孔26，用于装有RNA逆转录试剂的试剂瓶或装有实时定量PCR试剂的离心管的下半部分穿过并进入冰中；保护盖21和固定板21转动连接，该保护盖由泡沫塑料制成，在离心管均插入冰中后，盖在固定板21上，使固定板21和外界环境相隔离。

冰盒盒体20的外壁面上分别设置有两个向外延伸的凸起24，两个凸起24之间形成一个凹槽，固定板21和该凹槽相对应的位置上设置有向下延伸的凸片23，该凸片和凹槽嵌合连接，使得固定板21能够和冰盒盒体保持一种可拆卸的连接关系。

在本实施例中，RNA逆转录试剂容纳部17以及实时定量PCR试剂容纳部18的内壁上均设置有一层泡沫塑料层，用于冰盒放入后对冰盒进行保温。

在本实施例中，当试剂盒敞开时间过长，需要对冰盒中的并进行更换时的步骤为：首先，将冰盒拿出；其次，将覆盖有保护盖22的固定板21向上提起，将其从冰盒盒体20上抽下来；然后，将冰盒中的水倒出并添加新的并；最后，将固定板安装在冰盒盒体上，放入试剂盒中即可。

上述RNA提取试剂和耗材与Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit相同，RNA逆转录试剂和实施定量PCR试剂与ABI公司的MicroRNA Assays货号(4427975)、MicroRNA Reverse Transcription Kit(货号4366597)和Universal PCR Master Mix II,no UNG(货号4440048)相同。其中，MicroRNA Assays包括两部分，一部分用于逆转录为：5×RT primer(逆转录引物)；一部分用于PCR扩增，包含了扩增引物和特异性探针，为：Small RNA Assay(20×)。ABI公司的miRNA assays使用统一货号，具体某个miRNA又有其编号，涉及本项目的miR-320a的Assays ID为002277；外源参照物cel-miR-39-3p的Assays ID为000200。

实施例的作用与效果

根据本实用新型提供的miR-320a作为下肢动脉硬化闭塞症术后再狭窄鉴别标记物的试剂盒，该试剂盒内设置有冰盒，该冰盒包括冰盒盒体、固定板以及保护盖。一方面，由于固定板设置在冰盒盒体的上方和冰盒盒体可拆卸连接，使得在对于冰盒内的冰进行更换的时候，无需将置于冰上的试剂瓶挨个取下，只需将固定板和冰盒盒体拆开即可对冰盒内的冰进行更换；另一方面，由于保护盖由隔温材料制成，并且和固定板转动连接，既使得固定板能够和外界环境隔离，又能够在冰盒盒体内的冰被更换完毕将固定板安装在冰盒上时，对试剂瓶起到一定的阻挡作用，以便于试剂瓶的下半部分被顺利插入冰中。

本实用新型不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所述的权利要求限定和确定的本实用新型的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本实用新型构思的发明创造均在保护之列。