一种接种工具的制作方法

本实用新型涉及一种接种器具，确切讲是一种将目标真菌与寄主植物的接种部接触，使真菌侵入寄主植物的接种器具，特别是适用于在硬质的木本植物中接种的器具。

背景技术：

人工使病原真菌与寄主植物感病部位接触，创造条件使病原物侵入并诱致寄主发病的过程叫接种。接种是证病过程的重要步骤，在研究寄生现象发病规律，测定品种抗病性，药剂防病效果评价时都需要接种。因此，接种方法直接影响试验效果。

植物病害人工接种方法，是根据病害的传染方式和侵染途径设计的，植物病害的种类很多、其传染方式和侵染途径各异。真菌的接种方法有可采用无接种工具的方法和采用接种工具的方法两类，其中采用接种工具的方法有：

1）喷雾法，这种方法是将配置好的孢子悬浮液，喷在寄主表面，病原菌可以从气孔、伤口或表皮侵入。

2）涂抹法，即将病原菌用毛笔或刷涂抹在植物表面，使孢子萌发侵入。

3）注射法，将孢子悬浮液用注射器注射入记住生长点或幼嫩部分。

4）针刺法，人工制造机械损伤后，将菌饼贴在伤口处诱发病害。

现有的接种方法可参见《植病研究方法》方中达，1998。但传统的接种方法往往具有接种效率低，症状发生慢，接种一致性差等缺点，而且前述的方法中1和2的方法在接种后还需要保湿48小时，而方法3和4的对于幼苗阶段的较小个体，以及离体叶片等组织结构，很难定量实施侵染。

中国发明专利201410604178.7公开了一种食用菌木签菌种的制作方法，属于食用菌生产种植领域。该方法包括如下步骤：将纱布或牛皮纸订于木签的一端放入石灰水中浸泡至木签内部无白心，捞出木签晾干表水；将面粉、玉米粉、白砂糖、石膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、菇丰素、维生素B₁加到水中，加热至浆糊状得到粘合剂；将木签与粘合剂混合搅拌至粘合剂均匀附着在木签表面，加入麸皮或米糠搅拌至其均匀粘附木签表面70-80%时，将木签装入聚丙烯袋或菌种瓶中，封口后灭菌；在无菌条件下接种菌种，置于20-26℃培养10-20天，即可长满菌丝。但这种木签菌种却不适合用于真菌接种，特别是不适合于在树木类的硬质植物上接种。

中国发明专利申请201310720075.2公开一种木钉菌种方法，该专利所用的接种木钉是用枝丫、废材、次品食签棍、油条、杏条制作成粗度为0.5cm的带有尖端的棒状木钉，其使用时是用5%浓度的常温白糖水浸泡24小时捞出再拌入菌钉体积的10%的营养料即可装袋用于接种。但这种木钉浸入培养基会软化，再用这种木钉在质地较硬的寄主，例如树木上，接种时将可能无法剌入寄主，实现接种作业。

技术实现要素：

本实用新型给出一种可克服现有技术不足的真菌接种工具。

本实用新型的接种具由带有尖端的棒状金属件和镶嵌于棒状金属件上的的接种体构成，其中的接种体由木质或竹质或其它可以使细菌、真菌在上附着的材料构成，且接种体至少有一部分外露于棒状金属件的外表面。

本实用新型的接种方法使用的接种具还可以是由木制或竹制其一端带圆锥体、圆锥体后设置为圆柱体的接种体和固定于圆锥体头部的金属尖端构成。

优选地，本实用新型的接种具的金属尖端与木制或竹制圆锥体间嵌镶固定，或者用螺纹固定。

本实用新型的接种工具所用的金属为不锈钢。

本实用新型的优点是：

1、由于本实用新型采用带有尖端的金属棒状结构，特别是不锈钢针尖便于组织刺伤，尤其适合于树干坚硬的林木接种， 完全不存在现有技术中接种木钉软化的不足。另一方面，本实用新型的接种具在使用后只要洗净、灭菌后即可重复使用，也可在特殊情况下将更换接种体，因此使用本实用新型的接种具可节省成本。

2、本实用新型的接种具上设置的木质或竹质的接种体，即可以染菌以侵染寄主，同时更便于精确观测病原菌侵入点，精准定点观测和统计。

3、误差小。以往制备孢子悬浮液或者孢子涂抹，为了保证达到较高的病原菌浓度，需要用血球计数板配制孢子悬浮液。但血球计数板统计数据仅仅是一个倍数换算的统计学估计值，往往和实际情况误差较大（如：用血球计数板统计孢子浓度达到1×10⁶个/ml，而实际可能只有1×10⁵个/ml，最多能差10倍）。采用本实用新型的工具将不用配制孢子悬浮液，在摇床上能保证每个接种体所带菌量均匀一致，避免产生误差。

4、均匀性好。传统的孢子悬浮液接种、涂抹接种等方法，只是将一定浓度的孢子接种至植物，但均匀性很难保证，尤其是接种种子、幼苗等较小个体，可能发生漏接种的现象（如喷雾接种法：有些种子表面可能在喷雾中，接触到10个孢子，而有些可能1个都没有）。本实用新型的接种工具制备过程中，匀速摇床使接种具上木质或竹质接种体与病原菌充分混匀，从最大概率上保证了每个接种具带菌量的一致，接种过程中刺入植物，保证了接种过程中病原物数量的均匀，与处理间的一致。

5、发病快。喷雾接种法、涂抹接种法等方法，需等待病原菌萌发，芽管生长，再形成附着孢，侵入植物，会受到植物表皮蜡质层、角质层等影响,出现症状往往需要10天左右时间。采用本实用新型的接种工具接种，可直接造成创伤，能迅速使病原物侵入植物,大约3-4天即可观察到症状，考察病原菌对植物造成的危害，测量病原菌在植物中的生长、扩展速度。

6、定点性强，便于观察。采用现有的接种工具不容易从宏观上确定究竟是哪些孢子萌发侵入植物，具体观测时容易受到多处侵入点的互相影响。而使用本实用新型，其侵入点固定，即从针刺处开始侵染，容易观测病原菌侵入植物的过程、程度，并定点测量病原菌在植物上的扩展速度。

7、本实用新型的接种具更为实用并可使操作更加方便简单。传统针刺法后，也用孢子悬浮液或者菌饼接种。孢子悬浮液仍存在上述的缺点。而菌饼接种法存在以下问题：1菌落不同区域产生的菌饼带菌量不同，病原菌活性不同，所以不同菌饼处理间一致性差；2菌饼接种过程需要其他工具辅助制造伤口，菌饼接种后还要封闭保湿，易污染；木质的接种工具易发生软化而难于剌入较硬的寄主。本实用新型的接种具前端为一金属的尖端，本身就是制造创伤的工具；再加上是用金属制备，由于材料质地的原因，使其有相当的刚度而容易剌入坚硬的木质寄主内，同时当接种体在与培养基作用时不影响其金属尖端的刚度，更不会造成现有的木钉前端变软的不足；接种具中的嵌入的木质或竹质部件本身形成一个接种体，它可以与病原菌共同培养，可携带大量病原菌，使接种作业简捷方便。所以本实用新型的方法及接种具集合了多重作用，并可使操作更为简单。

附图说明

附图1为本实用新型的接种具示意图。图中：1为接种具的棒状金属件，2为镶嵌于棒状金属件上的木质或竹质的部件，3为棒状金属件的尖端部分。

附图2为附图1的A-A向剖面示意图。

附图3为本实用新型的另一实施例示意图。

具体实施方式

以下是本实用新型的实施例。

本实用新型的接种工具的一个实施例如图1所示，是由棒状金属件1和镶嵌于棒状金属件上的木质或竹质的接种体2构成，棒状金属件1的前端是一个尖端部分。在实际制备中可以如附图1所示在棒状金属件1上开设一个通孔，再在通孔内嵌镶一块由木质或竹质材料的接种体2，这样接种体2的两端将可以外露以与培养菌接触。接种工具也可以制成在棒状金属件1上开设一个盲孔，在盲孔内嵌镶一块由木质或竹质材料的接种体，这一结构中接种体将只有一个露在外面，在盲孔的孔顶可以设置一个顶丝，旋转顶丝可以将嵌镶入盲孔的接种体顶出盲孔以便于更换。

本实用新型的接种工具的第三个实施例如图3示，它是由木制或竹制其一端带圆锥体、圆锥体后设置为圆柱体，及嵌镶于圆锥体头部的金属尖端构成。本实用新型的接种工具中，其金属尖端与木制或竹制圆锥体间嵌镶固定，或者用螺纹固定，即在金属制的尖端和木制或竹制圆锥体与金属制尖端相配合处各自设置相互配合的阳螺纹的阴螺纹。

本实用新型的接种工具所用的金属最好采用不锈钢。

本实用新型的接种工具的一个实际制品的尺寸如下：其圆柱体部分长10mm、直径2mm，尖端部分长5mm。

使用本实用新型进行接种的过程如下：

将纯化后的目标病原菌，打出5mm直径菌饼，加入前述的三角瓶内的液体培养基中，放在恒温摇床（依据不同病原菌调整温度）上，转速150r/min，培养10-15天，病原菌持续生长。然后将接种具121℃高压30min灭菌2次，第3次浸入马铃薯葡萄糖液体培养基中灭菌后，再在无菌环境下将接种具转移到液体培养的病原菌三角瓶中，每250ml中加入数十枚接种具。然后继续放在恒温摇床（依据不同病原菌调整温度）上进行病原菌培养，摇床转速150r/min，培养时间约72h。再从培养基中取出染菌的接种具，在无菌环境下利用其前部的尖端刺入确定为寄主的幼苗根茎部，或叶片或树木茎部等部位，造成人为创伤，使接种体部分与寄主接种部位相接触，即可促进病原菌从伤口侵入，用于离体叶片侵染、病害系统侵染等试验。

采用本实用新型的方法接种与未接种的进行对比可见：寄主的接种部位已经呈现感染现象，表明已经被接种感染，而相对比的未染菌的接种具剌伤的植株虽然也被剌伤，但却并不呈现感染现象。

为检验接种体的可靠性，将10个接种具放在灭菌培养皿（90mm）中，加入5ml无菌水，充分搅动摇匀，洗下接种体表面的孢子形成悬浮液。在普通显微镜下（100×）统计20个视野中的孢子数量，根据显微镜的视野直径和培养皿内径计算每个接种体上的孢子数量。共10个重复。用目镜测微尺测得，显微镜100×下每个视野的直径为2mm，90mm培养皿底盖内径为85mm，培养皿底盖共有1805.25个视野，每个接种体带孢子数为：

。每个接种体所带孢子数为48～62，平均为56个，经SPSS方差分析，每个接种体所带孢子数量无显著差异。