一种菌种固体连续发酵结构和设备及发酵方法与流程

本发明属于发酵设备领域，涉及一种发酵设备，尤其是一种菌种固体连续发酵设备及方法。

背景技术：

100多年前，液体深层发酵得到了长足的发展并日渐成熟，目前在酶、抗生素工业生产中有广泛应用。但是这种发酵方式设备复杂、前期投入大，发酵过程耗能高，如果用于微生物菌种的大规模发酵，且用作生产菌种的成本过高。

传统固体发酵通常是指微生物生长于不溶于水的基质且基质上含有不同量的自由水，传统固体发酵用设备也比较简单，前期投入小。缺点是不能够连续生产，且条件不易控制，通常为批次发酵，后期获取纯化菌种更加困难。上世纪60年代人们提出惰性载体固态发酵，微生物在固态的培养基质中生长，这种发酵方式以惰性载体如蛭石、甘蔗渣为培养基吸附介质，打破了固体发酵以固态物质作为营养来源的培养基形式，初步实现了固态发酵的连续性，但是其应用范围有限，大多数惰性载体适用范围很窄，且菌体不能直接收集。如何将现有的固体发酵设备生产连续化和参数可控化是固体发酵大规模应用的前提。前人对固体发酵装置如何连续生产做了很多研究。

B.Lonsane曾归纳出九种不同形式的工业规模的固体发酵反应器：转鼓式、加盖盘式、木盒式、倾斜接种盒式、垂直培养盒式、浅盘式、传送带式、圆柱式、混合型式。但是固体发酵过程在固体颗粒物质的大小、pH、传热、传质等方面的条件难以控制，同时不能够连续生产。为了克服以上困难，目前人们的研究集中于如何更好地实现固体发酵的连续性和更好的传质、传热。

如申请号为200420094421.1的发明专利公开了一种可进行流水线式生产的多层网带式固体发酵设备，由在一个箱体内安装多层可连续运行的固体物料输送装置，固体物料经进料口通过多层输送装置到达底部，发酵完成。这种设备可以连续生产，但是这种固体发酵最主要的问题是传质、传热问题，固态的培养基中的通气和营养流动受限；此外这种发酵设备运行时固态的物料很难自动均匀的平铺在传送装置上。

申请号为201410757428.0的发明专利公开了一种浅盘式固体发酵设备，该设备包括罐体、罐体内带孔的固定床、固定床上的浅盘，罐体内底部设有无菌空气入口和蒸汽管道、外部连接有温度和湿度的测量调节系统、过滤设备、压力表。罐体内通过无菌空气增湿或加热。发酵完成后在罐内直接采取空气干燥，实现发酵、干燥在一个罐内完成。此发酵设备温度控制比较完善，但是不能连续生产。

陈洪章等人提出以压力脉动法为动力源培养进行固体发酵，通过外界周期性的刺激强化生物反应和细胞内外物质传递的过程，并设计了压力脉动固体发酵技术，传统固态发酵技术通过机械搅拌解决传质、传热问题，但这样会损害菌丝体的生长，压力脉动通过让气相均匀的使固态基质分散，加强供氧与排出CO₂的速度，使固体颗粒起松动作用，为菌丝体的大量繁殖扩充了空间。但是这种发酵方式不能够连续、操作比较繁琐、无法直接获取菌体。

综上所述，固态发酵目前无法大规模应用，关键在于难以进行连续生产、很好的传热传质、和参数可控，而这是采用固态营养供给带来的必然结果，固态的营养物质本身含水量少，难以传递物质和能量，在生产时参数难以调控，所以会出现各种问题限制了固体发酵的大规模应用。据此我们可以将营养供给液体化，选一种基质作为支持物可以吸附培养基，营养物质不再作为支持基质，这样可以增加营养物质的流动性和连续性，固体发酵的颗粒问题、pH、传热、传质也会容易控制。据此更进一步将菌体的营养供给和菌体生长通过特种生长材料隔离开，培养基不断更新，菌体生长不断生长，至一定阶段后能够通过刮取直接获取菌体，而残留的菌种可继续生长，从而实现可固体发酵的连续性。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决目前固体发酵技术无法连续生产、传热传质困难、参数难以控制的问题，提供一种菌种固体连续发酵设备及方法，该装置能够改变营养供给形式，使固体发酵能够实现连续、参数可控、传热传质容易的目的。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种菌种固体连续发酵装置，包括自下而上层叠设置的生长斜面、供养层和生长层；生长层的上方设置滴管，滴管与装有种子液和补料的接种补料瓶的出口相连通，滴管的出口位于生长层的前端，生长层的后端设置菌体收集装置；生长斜面的后端高度低于前端。

本发明进一步的改进在于：

所述生长斜面采用传送带或表面设置有移动刮板的平板，移动刮板能够沿平板表面运动，将菌体收集至菌体收集装置中；在平板上接种时，移动刮板靠近生长层，将菌体均匀涂布在生长层上。

所述滴管通过接种补料管道与接种补料瓶的出口相连；滴管上设置若干滴灌带。

一种菌种固体连续发酵设备，包括罐体，罐体内设置用于安装菌种固体连续发酵装置的支架，支架上自下而上依次安装多层菌种固体连续发酵装置，且每层菌种固体连续发酵装置平行设置；接种补料瓶安装于罐体的顶部，蒸汽入口与蒸汽发生器的蒸汽出口相连，蒸汽发生器的另一个蒸汽出口与罐体相连；接种补料瓶的种子液出口连接接种补料管道，接种补料管道上设置若干滴管，每个滴管的出口位于对应菌种固体连续发酵装置的前端上方，且与生长层之间留有间隙；菌体收集装置设置于罐体的内部，且位于多层菌种固体连续发酵装置的后端，并与收集槽相连通；罐体的顶部开设无菌空气出口并安装有压力表，底部开设废液排出口和蒸汽排出口，废液排出口上设置废液收集槽。

其进一步的改进在于：

所述菌体收集装置包括菌体刮板，菌体刮板上还安装有菌体收集板，菌体刮板能够沿竖直方向运动，收集每层菌种固体连续发酵装置上生长的菌体；罐体的底部设置有开口，当菌体刮板运动至底部时，菌体刮板与菌体收集板组成的腔体与收集槽相连通。

所述罐体上还连接有空气压缩机和温湿度测量仪，空气压缩机通过空气滤膜和温湿度自动调节装置与罐体相连。

所述罐体内侧顶部设置有可视灯，罐体的侧面还开设有可视窗。

所述罐体能够承受的最大压力为0.3MPa。

一种菌种固体连续发酵方法，包括以下步骤：

1)灭菌：

打开蒸汽发生器，关闭除蒸汽排出口外的其他通气口，蒸汽进入接种补料瓶和罐体内部，控制蒸汽进入和排出速度，使罐体内的压力维持在0.15MPa，持续30min，完成灭菌；然后通入无菌空气，使罐体内部维持正压；

2)接种：

将事先准备好的种子液按照无菌操作要求加入接种补料瓶，接种补料瓶的体积为1L-50L，种子液的体积为10-30ml/m²，与生长层的面积和层数成正比；生长层的层数为4～20层，调节生长斜面使生长层正对着滴管，滴加种子液的同时匀速转动生长斜面，使生长层上布满菌种，之后将菌体刮板靠近生长层并匀速转动传送带斜面，使菌种均匀涂布在生长层上；

3)补料：

按无菌操作要求加入补料液，补料速度为0.1～0.5L/m²·h，补料液从供养层的顶部到达底部，废液滴入废液收集槽，排出罐体；补料过程同通过温湿度自动调节装置调节温度和湿度，使温度保持在25～40℃；

4)收集菌种：

当菌体生物量达到要求时，转动传送带用菌体刮板将菌体刮下，或者用移动刮板刮取菌体，从而直接获取菌体；然后将生长斜面转动至初始状态，继续滴加补料液，使生长层上残留的菌种继续生长，继续收集菌体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明固体发酵能够连续：由三层不同的材料组成菌体培养斜面，供养层可以吸附液体培养基，营养物质不再作为支持基质；生长层能够吸附液体培养基，且菌种能够在其表面生长；支持层能够支撑斜面。菌体的营养供给和菌体生长通过特种生长材料隔离开，培养基不断更新，菌体生长不断生长，通过刮取直接获取菌体，而残留的菌种可继续生长，从而实现可固体发酵的连续性。本发明具有良好的传热传质：营养供给液体化可以增加营养物质的流动性，菌体与营养物质接触更加充分，热量和物质传递比传统固体发酵更加有效率。另外，本发明条件可控：固体发酵的颗粒问题、pH、温度更容易控制。传统固体发酵温度、pH、通风等条件受制于固态培养基难以调控，本发明采用液体培养基使这些条件得以控制。其次，本发明菌体收集方便：直接将生长层上的菌体刮取收集，避免使用操作繁琐且耗能大的大型离心机。最后，本发明产量可控：菌体生长斜面层数可以根据不同生产的需要进行调节，能够实现资源的合理利用。

【附图说明】

图1为本发明平板式连续发酵装置的结构示意图；

图2为本发明传送带式连续发酵装置的结构示意图；

图3为本发明滴管的结构示意图；

图4为本发明平板式连续发酵设备的结构示意图；

图5为本发明传送带式连续发酵设备的结构示意图。

其中：1-温湿度自动调节装置；2-空气滤膜；3-空气压缩机；4-收集槽；5-废液收集槽；6-支架；7-传送带；8-滴管；9-接种补料管道；10-接种补料瓶；11-蒸汽发生器；12-无菌空气出口；13-压力表；14-可视窗；15-菌体收集板；16-菌体刮板；17-温湿度测量仪；18-可视灯；19-罐体；20-废液排出口；21-蒸汽排出口；22-移动刮板；23-滴灌带；24-供养层；25-生长层；26-生长斜面。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1和图2，本发明菌种固体连续发酵装置，包括自下而上层叠设置的生长斜面、供养层24和生长层25；生长层25的上方设置滴管8，滴管8与装有种子液和补料的接种补料瓶10的出口相连通，滴管8的出口位于生长层25的前端，生长层25的后端设置菌体收集装置；生长斜面26的后端高度低于前端。生长斜面采用传送带7或表面设置有移动刮板22的平板，移动刮板22能够沿平板表面运动，将菌体收集至菌体收集装置中；在平板上接种时，移动刮板22靠近生长层25，将菌体均匀涂布在生长层25上。滴管8通过接种补料管道9与接种补料瓶10的出口相连；滴管8上设置若干滴灌带23。

如图3所示，本发明菌种固体连续发酵设备。本设备主体结构分由罐体19、接种补料装置、生长斜面和菌体收集装置构成。罐体上有无菌空气出口12、接种补管道9、废液排出口20，罐体20上有无菌空气进口外部连接有控温控湿仪器1、空气过滤设备2空气压缩机3、蒸汽发生器11和调控压力的阀门及仪表13；培养基只在供养层中循环，菌体在生长层25上生长。接种补料装置分接种和补料两部分，采用滴灌的方式，互相独立。本发明装置设计简单，可以直接获取固体发酵的菌种。

如图4所示，本发明可采用传送带7替换平板26，传送带7的斜度是30°～60°。

本发明蒸汽发生器11与接种补料装瓶10和罐体19同时连接，可以同时灭菌。滴管8与供养层24和生长层25斜面有适当距离，种子液和补料的滴管8分别在生长层和供养层始端上方。生长层25的始端和末端分别比供养层24短10cm和30cm。供养层24的末端有一段下垂，呈倒三角形状，在罐体的底部有对应的废液收集槽5，废液收集槽5的底部与废液排出口20相连接。

菌体收集装置由菌体刮板16、菌体收集板15、收集通道和收集槽4组成。菌体刮板16和菌体收集板均固定在一可移动的支架上，可向下移动依次刮取菌体，菌体通过菌体收集板的移动被推入收集管道。菌体刮板16、菌体收集板15、长移动板、短移动板和收集管道组成的空间是密闭的。罐体外部有一可视窗14，顶部有一可视灯18。

本发明还公开了一种菌种固体连续发酵方法，包括以下步骤：

1)灭菌：

打开蒸汽发生器，关闭除蒸汽排出口外的其他通气口，蒸汽进入接种补料瓶和罐体内部，控制蒸汽进入和排出速度，使罐体内的压力维持在0.15MPa，持续30min，完成灭菌；然后通入无菌空气，使罐体内部维持正压；

2)接种：

将事先准备好的种子液按照无菌操作要求加入接种补料瓶，接种补料瓶的体积为1L-50L，种子液的体积为10-30ml/m²，与生长层的面积和层数成正比；生长层的层数为4～20层，调节生长斜面使生长层正对着滴管，滴加种子液的同时匀速转动生长斜面，使生长层上布满菌种，之后将菌体刮板靠近生长层并匀速转动传送带斜面，使菌种均匀涂布在生长层上；

3)补料：

按无菌操作要求加入补料液，补料速度为0.1～0.5L/m²·h，补料液从供养层的顶部到达底部，废液滴入废液收集槽，排出罐体；补料过程同通过温湿度自动调节装置调节温度和湿度，使温度保持在25～40℃；

4)收集菌种：

当菌体生物量达到要求时，转动传送带用菌体刮板将菌体刮下，或者用移动刮板刮取菌体，从而直接获取菌体；然后将生长斜面转动至初始状态，继续滴加补料液，使生长层上残留的菌种继续生长，继续收集菌体。

实施例1

以大肠杆菌菌体生产为例，固体发酵罐生长斜面层数为4层，采用传送带式生长斜面。将大肠杆菌接种至LB液体培养基中，在摇瓶中37℃培养24h，种子液的体积为10ml/m²。将种子液按照无菌操作要求加入接种补料罐10右侧罐体，调节传送带斜面使生长层正对着滴管8，滴加种子液的同时匀速转动传送带斜面7，使生长层上布满菌种，之后将菌体刮板16靠近生长层并匀速转动传送带斜面，使菌种均匀涂布在生长层上。按无菌操作要求加入补料液，补料速度为0.4L/m²·h，补料液通过供养层，从传送带顶部到达底部，这时其营养利用完全，废液滴入废液收集槽5，排出罐体。补料过程同时也是菌体生长的过程，当菌体生物量达到要求时，将菌体刮板16靠近生长层并匀速转动传送带斜面，刮板16将菌体刮下，将菌体聚集到一起，从而直接获取了菌体。将斜面转动至初始状态，继续滴加补料液，使生长层25上残留的菌种继续生长，继续收集菌体，从而实现固体发酵的连续性和可控性。

实施例2

以纳豆杆菌菌体生产为例，固体发酵罐生长斜面层数为20层，采用板式生长斜面。将纳豆杆菌接种至LB液体培养基中，摇瓶中37℃培养24h，种子液的体积为40ml/m²。将种子液按照无菌操作要求加入接种补料罐10右侧罐体，滴加完种子液后，将菌体刮板靠近生长层并匀速移动，使菌种均匀涂布在生长层上。按无菌操作要求加入补料液，补料速度为为0.3L/m²·h，补料液通过供养层，从传送带顶部到达底部，这时其营养利用完全，废液滴入废液收集槽5，排出罐体。补料过程同时也是菌体生长的过程，当菌体生物量达到要求时，移动刮板16将酿酒酵母菌体刮下，将菌体聚集到一起，从而直接获取了菌体。将斜面转动至初始状态，继续滴加补料液，使生长层25上残留的菌种继续生长，继续收集菌体，从而实现固体发酵的连续性和可控性。

实施例3

以酿酒酵母菌体生产为例，固体发酵罐生长斜面层数为10层，采用板式生长斜面。将酿酒酵母接种至YPD液体培养基中，摇瓶中28℃培养24h，种子液的体积为30ml/m²。将种子液按照无菌操作要求加入接种补料罐10右侧罐体，滴加完种子液后，将菌体刮板靠近生长层并匀速移动，使菌种均匀涂布在生长层上。按无菌操作要求加入补料液，补料速度为0.3/m²·h，补料液通过供养层，从传送带顶部到达底部，这时其营养利用完全，废液滴入废液收集槽5，排出罐体。补料过程同时也是菌体生长的过程，当菌体生物量达到要求时，移动刮板16将酿酒酵母菌体刮下，将菌体聚集到一起，从而直接获取了菌体。将斜面转动至初始状态，继续滴加补料液，使生长层25上残留的菌种继续生长，继续收集菌体，从而实现固体发酵的连续性和可控性。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。