一种检测kras基因7种突变的引物系统的制作方法

本实用新型属于基因突变技术领域，尤其涉及一种灵敏检测kras基因7种突变的引物系统。

背景技术：

RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS组成，基因家族各成员间同源性可达85%。RAS基因编码p21蛋白，分子量为21KD，位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增殖信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活性致癌基因的主要部位是第12、13和61密码子的突变，其中以第12密码子点突变最常见。

RAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15%-30%，在结直肠癌患者中为20%-50%。作为EGFR信号通路下游最重要的的效应因子，KRAS在肿瘤信号转导中发挥重要作用。对KRAS基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。

西妥昔单抗和帕尼单抗都是特异性针对人类EGFR胞外区的单克隆抗体。美国FDA批准该药单药用于治疗难治性结肠癌，及在放疗基础上治疗进展性头颈部癌。已知EGFR信号途径下游的基因突变则会使患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗产生耐药性。KRAS基因第12或13密码子突变的患者接受治疗无生存获益；不推荐这两种表皮生长因子受体（EGFR）抗体用于KRAS基因突变的转移性结直肠癌（mCRC）患者治疗。根据这一提示，临床医生可以将KRAS基因突变的患者排除在接受抗EGFR单抗治疗之外，重新安排其接受其他药物替代治疗，避免对不能获益的患者进行不必要的治疗。

虽然有很多系统装置应用于KRAS基因突变检测，如DNA测序，焦磷酸测序，AMRS，HRM等。这些方法的缺陷是很难在高干扰下检测低拷贝的基因突变。检测KRAS基因2 号外显子 12、13 密码子上的 7个突变热点：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V/D。准确判断患者对该类治疗的预测疗效，以供临床医师参考，也尽最大的努力筛选出有效人群，避免错过治疗。

技术实现要素：

针对以上不足，本实用新型提供了一种抗干扰能灵敏检测kras基因7种突变的引物系统。

本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案如下：

一种检测kras基因7种突变的引物系统，包括检测系统标准的建立模块和验证系统模块，检测系统标准的建立模块内设有引物合成仪、荧光PCR扩增仪一、琼脂糖凝胶电泳仪、DNA测序仪、荧光PCR扩增仪二，引物合成仪旁设有荧光PCR扩增仪一，荧光PCR扩增仪一旁边设置有琼脂糖凝胶电泳仪，琼脂糖凝胶电泳仪旁设有DNA测序仪，DNA测序仪旁设置荧光PCR扩增仪二；验证系统模块内设有涡旋震荡仪、高速离心机、分光光度仪、荧光PCR扩增仪三，涡旋震荡仪旁设有高速离心机，高速离心机旁设有分光光度仪，分光光度仪旁设有荧光PCR扩增仪三，检测系统标准的建立模块和验证系统模块中的仪器电连接计算机。

作为优选的，所述的荧光PCR扩增仪一、荧光PCR扩增仪二和荧光PCR扩增仪三都为ABI Prism 7500。

本实用新型的有益效果是：

1 、抗干扰性强。

2 、非常灵敏的检测kras基因7种突变。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1 为本实用新型结构框图。

图2为本实用新型基因突变效果图。

图3为本实用新型质粒稀释后的扩增曲线。

图中1、引物合成仪，2、荧光PCR扩增仪一，3、琼脂糖凝胶电泳仪，4、DNA测序仪，5、荧光PCR扩增仪二，6、涡旋震荡仪，7、高速离心机，8、分光光度仪，9、荧光PCR扩增仪三，10、计算机。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本实用新型的内容做进一步的详细说明：

如图1、2所示，一种检测kras基因7种突变的引物系统，包括检测系统标准的建立模块和验证系统模块，检测系统标准的建立模块内设有引物合成仪1、荧光PCR扩增仪一2、琼脂糖凝胶电泳仪3、DNA测序仪4、荧光PCR扩增仪二5，引物合成仪1旁设有荧光PCR扩增仪一2，荧光PCR扩增仪2一旁边设置有琼脂糖凝胶电泳仪3，琼脂糖凝胶电泳仪3旁设有DNA测序仪4，DNA测序仪4旁设置荧光PCR扩增仪二5；验证系统模块内设有涡旋震荡仪6、高速离心机7、分光光度仪8、荧光PCR扩增仪三9，涡旋震荡仪6旁设有高速离心机7，高速离心机7旁设有分光光度仪8，分光光度仪8旁设有荧光PCR扩增仪三9，检测系统标准的建立模块和验证系统模块中的仪器电连接计算机10。

检测系统标准的建立模块：引物合成仪1合成KRAS基因12和13密码子7种突变引物序列，荧光PCR扩增仪一2为ABI Prism 7500扩增7种突变序列，琼脂糖凝胶电泳仪3分析、纯化、连接至T载体，经DNA测序仪4验证序列系列稀释后，荧光PCR扩增仪二5为ABI Prism 7500检测本系统的检测能力。本部分相当于建立一个标准系统，其中的荧光PCR扩增仪ABI Prism 7500是重点，反应条件是经过温度的变化，实现DNA双链的变性、聚合、延伸，通过电脑检测探针上荧光物质的量的从而达到检测的目的。选用携带KRAS基因12和13密码子突变，克隆KRAS质粒。首先PCR扩增，50 ul PCR体系包含：20ng DNA，300nM上游和下游引物（PGEM-F1/R1 野生型质粒，PGEM-F2/R2 克隆突变质粒），500nM dNTP mix，Lamp Taq DNA聚合酶 2U，1X Buffer，3mM Mg2+。其次，PCR扩增程序为：1）变性 95度3min；2）富集10循环95度30s，62～52度45s（每循环降低1度），72度50s；3）10个循环95度 30s，72度 50s；4） 25循环95度30s，58度30s，72度50s；5）最后延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析、产物纯化，连接至T-载体后转入DH5alfa 大肠杆菌，经扩培后提取质粒。质粒经DNA 测序后10倍梯度稀释，1E+5copies、1E+4copies 、1E+3copies 、1E+2 copies、1E+1copies、1E+0copies ，备用。验证系统模块：血浆或组织标本经DNA提取试剂盒在生物安全柜内提取，需要的仪器有涡旋震荡仪6，高速离心机7，Nanodrop2000分光光度仪8进行微量DNA定量，得到DNA 模板；（50ul荧光PCR反应体系（1X）：Buffer（10X）5ul，Mg2+ 1.0～5mM，dNTP 100nM～1000nM，引物 100nM～500nM，探针，100nM～1000nM，Taq DNA聚合酶 1U~3U，DNA 模板5～10ng）加入8连管，放进PCR仪，按照设计好的条件进行扩增；荧光PCR扩增仪三9扩增条件为：酶激活，95度 10min；突变富集，95度30s，68度 30，64度50s，72度25s，16循环；扩增检测，30循环，95度30s，58度32s，72度18s，于“58度32s”该步骤收集荧光信号FAM和HEX。计算机10收集信号，数据分析处理。

上述实施例仅为本实用新型的较佳实施例，并非以此限制本实用新型的保护范围，所以，凡是依本实用新型的结构、形状、原理作出的等效变化均涵盖于本发明的保护范围之内。