诊断方法和器件与流程
本发明涉及基于用于检测例如疾病生物标记物的生物分析物的纳米粒子技术使用信号放大步骤的方法和器件。
发明背景
本发明针对用于检测如疾病生物标记物的生物分析物(例如遗传突变或非宿主遗传材料)的方法和相关产品和试剂盒。
癌症在eu是第二大最常见的死因，仅在2012年就造成大约1.75百万例死亡，同一年据估计有3.45百万名eu市民经过诊断具有所述病况。癌症诊断的黄金标准是组织的组织学检查；然而，所述程序昂贵，并非对患者无风险，并且需要由专业病理学家进行一致评估。结果，已极大地关注检测用于癌症的诊断和管理的非侵入性生物标记物的技术的开发。在这方面尤其关注的是检测突变型dna序列的技术，因为这些技术具有诊断效用并且可预测对靶向疗法的预后和反应性。这种类型的生物标记物在医学的实践中一般具有显著科学和临床价值，适用于各种疾病和病症的诊断、预后、筛选和风险评估。以这些方式应用生物标记物已经被整合至多种保健系统中，以在针对“个人化医学”的日益重要的行动中实现治疗和疾病预防的个人化。
尽管如此，允许检测所述生物标记物的目前可用的技术受到限制，因为其需要昂贵设备，劳力密集，并且具有长周转时间。此外，大多数市面上有售的技术取决于对标靶dna的先前操纵和扩增，因为其对于可具有有限体积的原始样品中的检测不充分敏感。结果，其用途一般限于专业实验室。
贵金属纳米粒子具有多种独特的生理化学特性，所述特性已经促进调查其用于开发新的生物检测平台的用途。虽然在更具特异性和灵敏性的生物分子诊断工具的寻求中利用贵金属纳米粒子的独特特性的方法和器件已有多个先前描述的实例(关于全面审查，参见doria等人,sensors,2012,第12卷,第1657-1687页)，但其中大多数仍需要在检测之前对标靶dna进行样品操纵和扩增。
wo2005/118870描述了一种用于检测所关注的标靶dna序列的方法，所述方法使用固定的探针寡核苷酸的微电极阵列和多个用针对所述标靶dna的第二区的探针官能化的纳米粒子。测试样品中的标靶dna将通过固定的探针结合于所述电极，这又将导致纳米粒子经由捕捉的dna聚集。这一聚集可作为电极位点处电化学阻抗的改变检测出。
wo2007/044025描述了一种用于检测所关注的标靶dna序列的方法，所述方法使用用对所述标靶dna的两个不同区具特异性的探针官能化的纳米粒子。测试样品中的标靶dna将导致形成金纳米粒子的复合物，所述复合物可通过测量所述样品的光散射特性的改变来检测。
sanromán-iglesias等人,acsappl.mater.interfaces,2015,第7卷,第15692-15695页描述了用于金纳米粒子的光控制释放的结合聚合物，其作为分子闸。通过薄聚合物的光降解使纳米粒子远程释放至水溶液中允许肉眼检测粒子释放。
sanromán-iglesias等人,acssens.,2016,第1卷,第1110-1116页描述了通过纳米粒子的选择性聚集来检测单核苷酸多态性(snp)。调查了在snp的辨别中纳米粒子大小对纳米粒子生物传感器的灵敏度极限的影响。在恒定金浓度下粒子大小的5倍增加导致了检测极限改进3个数量级。
zhou等人,jamchemsoc,2010,第26卷,第6932-6934页描述了一种用于检测所关注的标靶dna序列的方法，所述方法并入了生物矿化扩增过程。在这种方法中，与多个纳米粒子一起提供固定的探针寡核苷酸的阵列，所述纳米粒子用针对标靶dna的第二区和可生物矿化硅蛋白的两种探针官能化。测试样品中的标靶dna将结合于固定的探针，这又将导致纳米粒子经由捕捉的dna聚集。纳米粒子结合的硅蛋白接着催化硅石的合成，硅石可俘获第二个金纳米粒子种类以产生样品的光散射特性的可检测改变。也可使用进一步银染色步骤以允许检测浓度低达50am的所关注的序列。
仍需要以低成本、快速并且高度灵敏性方式检测疾病生物标记物(如遗传突变)的方法和试剂盒。还需要便携性和容易使用。具体说来，需要一种避免在检测之前对标靶dna进行样品操纵和扩增的需要的方法。此外，需要允许检测疾病生物标记物、同时提供便利、器件内置读出的方法和试剂盒。本发明以可快速地并且容易地适于检测多种标靶生物分析物的系统并且在多种生物或环境测试样品中解决了这些和其它需要。
发明简述
本发明提供用于检测测试样品中的标靶分析物的方法和器件。广泛地说，本发明使用了信号放大方法，其中可容易检测的信号的释放取决于标靶分析物诱导的纳米粒子的凝聚。
因此，在第一方面，本发明提供一种用于检测测试样品中标靶分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：
提供多个检测器纳米粒子，其包含用对标靶分析物的第一区具特异性的第一探针官能化的第一检测器纳米粒子和用对所述标靶分析物的第二区具特异性的第二探针官能化的第二检测器纳米粒子；和
使所述检测器纳米粒子与测试样品在适于特异性探针结合于标靶分析物的条件下接触，其中标靶分析物诱导的检测器纳米粒子的凝聚允许从信号贮器释放可检测信号手段。
以这种方式，灵敏并且可适应的检测事件与信号事件有条件地相关；这一信号事件可比所述检测事件更容易地辨别，因此允许检测所关注的分析物而无需先前样品操纵或扩增。以这种方式使检测事件与信号事件相关还允许所述方法可容易地适于简单地通过改变检测器纳米粒子探针来检测多种分析物。
在根据本发明的这一方面和其它方面的一些情况下，标靶分析物可为核酸、蛋白或其它生物分子。所述第一和第二探针提供了选择以便对标靶分析物具特异性(即，展现选择性结合)。在其中标靶分析物包含核酸的情况下，所述第一和/或第二探针可为具有与标靶分析物序列(相应部分)互补的序列的寡核苷酸。在其中标靶分析物包含蛋白(糖基化或其它)的情况下，所述第一和第二探针可例如各自采用选择性结合于所述蛋白上存在的相应表位的抗体分子(例如，单克隆抗体、fab、scfv)的形式。以类似方式，所述第一和第二探针可采用选择性结合于标靶分析物的适体的形式。由于所述第一和第二探针结合于标靶分析物上的不同区(例如，不同表位)，引起夹心或桥接结合布置，导致分析物介导的检测器纳米粒子的凝聚。
在一些情况下，可检测信号手段的释放是经由关闭信号贮器的分隔物的崩溃。在一些优选情况下，这一分隔物是温敏性聚合物层，其可通过由检测器纳米粒子的凝聚物导向的热转移崩溃。例如，所述信号贮器可包含一个或多个包含壳的微球，所述壳例如由温敏性聚合物形成的壳，其封住包含所述可检测信号手段的核心。以这种方式，所述微球的壳提供所述分隔物。在一些情况下，这一热转移是通过用电磁辐射源照射凝聚的检测器纳米粒子而触发。优选地，所述电磁辐射源被配置成在凝聚的检测器纳米粒子的共振波长下或附近提供能量。以这种方式，所述可检测信号手段的释放可仅在标靶分析物诱导的检测器纳米粒子的凝聚并且用电磁辐射后续照射这些凝聚物之后发生。
在一些情况下，所述电磁辐射源包含红色激光二极管。所述红色激光二极管可在凝聚的检测器纳米粒子的共振波长下，如在范围600-650nm中(例如，633nm)递送光。在某些情况下，所述共振波长可远离存在于血液中的hb和hbo2的最大吸收(分别为434nm和414nm)和/或远离所述器件的组分的吸收波长和/或远离血浆的最大吸收波长。在一些情况下，所述电磁辐射源为发光二极管(led)。在特定情况下，这种led可被配置成在415-425nm的波长下提供能量。
在根据本发明的这一方面和其它方面的一些情况下，所述温敏性聚合物包含选自由以下组成的组的至少一种聚合物：聚(苯乙烯磺酸盐)(pss)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)、聚(烯丙胺)(pah)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚[2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯](pdmaema)、羟基丙基纤维素、聚(乙烯基己内酰胺)和聚乙烯基甲醚
在根据本发明的这一方面和其它方面的一些情况下，所述温敏性聚合物包含聚(苯乙烯磺酸盐)(pss)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)或pss和聚(烯丙胺)(pah)的交替层。这允许所述聚合物的厚度容易简单地通过改变层的数目来控制。
在一些情况下，所述温敏性聚合物包含聚(烯丙胺)(pah)。在一些情况下，所述温敏性聚合物包含聚(α)甲基苯乙烯。
在一些情况下，所述温敏性聚合物为60-100nm之间厚。本发明人已发现，优选这一范围中的聚合物厚度以便向聚合物分隔物提供充足刚度并且防止所述信号手段在照射前释放。
在一些特别优选的情况下，所述温敏性聚合物包含奇数个层。已知归因于层间的排斥导致无补偿电荷，奇数个层将使所述温敏性聚合物在高于60℃的温度下膨胀并且破裂。因此，在一些优选情况下，对凝聚的检测器纳米粒子的照射会产生至少20℃、40℃、或60℃的局部温度增加。
在一些情况下，所述温敏性聚合物包含聚(烯丙胺)(pah)的表面层。
在一些优选情况下，检测器纳米粒子凝聚物在凝聚后局限于所述分隔物。在一些情况下，这是经由具体结合对，优选地标靶分析物和所述检测器纳米粒子的第一和/或第二探针。因此，在一些情况下，所述温敏性聚合物的表面层(例如，pah层)可用所述检测器纳米粒子的第一和/或第二探针官能化。以这种方式，凝聚的检测器纳米粒子可使用支撑检测器纳米粒子凝聚的相同结合策略局限于所述分隔物。所述温敏性聚合物可具有结合于或并入其中，例如结合于或并入所述温敏性聚合物的表面层中的探针序列(例如，其特异性地杂交至所关注的突变型序列)。这种布置有助于使凝聚的纳米粒子紧密接近所述温敏性层并且由此增加从照射的纳米粒子至所述温敏性聚合物的能量转移(胜于例如散逸至溶液中的能量)。然而，本文中特定地预期在一些情况下，结合探针可未存在于所述温敏性聚合物中或所述温敏性聚合物上。本发明人已发现在某些条件下，例如视纳米粒子凝聚物的沉降速率而定，凝聚的纳米粒子与所述温敏性聚合物紧密接近而无需所述聚合物中或所述聚合物上的探针。
在一些情况下，所述第一和第二检测器纳米粒子各自包含所述第一和第二探针两者。在特别优选的情况下，所述第一和第二检测器纳米粒子是相同的。
在一些情况下，所述检测器纳米粒子包含金属原子、优选地贵金属核心。具体说来，所述金属可为银。
在一些情况下，所述检测器纳米粒子核心的直径在10至100nm范围中，如在范围40至70nm中。
在一些情况下，所述信号手段是选自由以下组成的组：抗生蛋白链菌素、抗体、酶(例如，辣根过氧化物酶)、荧光团、染料、一个或多个量子点、和一个或多个乳胶珠粒。
在一些情况下，所述信号手段是多个信号纳米粒子。本发明人已发现纳米粒子提供作为信号手段的有用优势，因为其允许使用渗透性或半渗透分隔物来关闭信号贮器。如防止例如液体染料的泄漏将需要的气密密封件对压力的差异敏感；因此，压力诱导的分隔物材料的破裂或弱化可能导致所述信号手段的不想要的释放，和增加的假阳性结果的发生率。有利的是，纳米粒子足够小以含于合适的信号贮器中，但也足够大，使得关闭所述贮器的分隔物可制成渗透性以允许空气压力的平衡。在某些情况下，所述系统可在所述器件中提供负压以促进流动。因此，本文中特定地预期关闭所述贮器的分隔物可不渗透空气。优选地，从所述信号贮器释放的信号纳米粒子的数目超过(优选地极大地超过)实现所述释放所需的检测器纳米粒子的数目。在某些情况下，所释放的信号手段(例如，信号纳米粒子)与检测器纳米粒子的比率为1000:1或超过1000:1，例如10^6:1(即，信号手段(例如，信号纳米粒子)比检测器纳米粒子多百万倍或甚至更高)。相对于检测器纳米粒子的数目，信号手段(例如，信号纳米粒子)的大数目有助于提供信号放大，这又允许更便利的检测(例如，可见检测)而无需高度灵敏性成像装置。
在一些情况下，所述信号纳米粒子包含金属原子、优选地贵金属核心。具体说来，所述金属可为金。在一些特别优选的情况下，所述信号纳米粒子的金属核心和所述检测器纳米粒子的金属核心是不同的金属。这允许检测器纳米粒子用于通过在将不会由所述信号纳米粒子吸收的波长下照射而将热转移导向所述温敏性聚合物。
在一些情况下，所述信号纳米粒子核心的直径在10至20nm范围内。在一些情况下，所述信号纳米粒子具有球形形态。在其它情况下，所述信号纳米粒子具有杆状形态。还预期其它信号纳米粒子形态，并且其可容易地应用于本发明；例如，纳米管、纳米盒、和纳米簇。多种不同的信号纳米粒子形态的使用允许在信号纳米粒子释放后观察到不同的颜色信号。这可为有利的，例如在提供所述方法的可容易观察到的彩色编码输出时。
在一些情况下，所述信号纳米粒子用硫醇封端的聚氧乙烯壬基苯基醚(igesh)官能化。已发现，用igesh官能化会使纳米粒子针对凝聚稳定化，甚至在干燥并且再溶解后。
在一些情况下，所述信号贮器包含一个或多个所述微球，例如所述温敏性微球。所述微球的平均直径可在1至20μm范围内，如在5至10μm范围内。
在一些情况下，所述信号贮器包含多个所述微球，并且所述壳的表面层带负电或带正电。
在一些情况下，所述信号贮器包含多个所述微球，并且所述微球在邻近和/或接触多个具有大于所述微球的直径的包装粒子的微通道中提供。具体说来，所述包装粒子可包含玻璃、硅石或琼脂糖珠粒。所述包装粒子可具有在20至200μm范围内，任选地在50至150μm范围内的平均直径。
在一些情况下，所述信号贮器包含在支撑材料、优选地大孔硅衬底中的一个或多个腔。在一些情况下，所述腔为微腔、微井、或微孔。在一些优选情况下，各腔可含有在至少4×105个纳米粒子/μm3的浓度下的可检测信号手段，例如如果纳米粒子为具有7.5nm的半径的球形，并且所述腔采用半径0.5μm和深度10μm的管形式并且假定所述球形纳米粒子具有相对致密包装。以这种方式，通过潜在少量的凝聚的检测器纳米粒子使关闭信号贮器的分隔物崩溃将导致相当大体积的信号手段的释放，由此产生信号的放大。
在一些情况下，可检测信号手段从所述信号贮器的释放作为颜色信号观察到。在一些优选情况下，可检测信号手段的释放可用肉眼观察到。在一些进一步优选的情况下，可检测信号手段在从所述信号贮器释放后被捕捉用于在保持条上进行检测。以这种方式，极大地促进了对信号手段从所述信号贮器的释放的目测。当所述信号手段为多个信号纳米粒子时，将这些信号手段捕捉于保持条上会允许其释放作为由所述纳米粒子的距离依赖性光学特性引起的颜色改变容易地观察到。
在根据本发明的这一方面的一些情况下，检测器纳米粒子探针是与标靶核酸的第一和第二区互补的寡核苷酸。在一些情况下，一种或两种寡核苷酸探针经由连接基团共价地连接至检测器纳米粒子核心。在某些情况下，所述探针包含经过修饰或非天然核苷酸。具体说来，本文中预期使用向寡核苷酸骨架添加刚性的核苷酸，从而降低天然dna的柔性。更具刚性的寡核苷酸增强探针-标靶特异性，这种特异性尤其在针对野生型dna的背景检测单碱基突变时是需要的。在一些情况下，所述寡核苷酸可包含2’-o-甲基核苷酸。在一些情况下，所述寡核苷酸可包含锁核酸(lna)。
在一些特定情况下，所述连接基团可包含硫醇基团。在一些进一步情况下，所述连接基团可包含c10-c20烷基和/或二醇间隔基。间隔基分子的并入促进了当附接至检测器纳米粒子核心时所述探针结合于标靶核酸。在一些情况下，所述探针包含键结至连接至peg间隔基的纳米粒子核心的硫醇键或由所述硫醇键组成，所述peg间隔基又连接至c18间隔基，所述c18间隔基又连接至探针序列本身。所述间隔基可限制或防止带负电探针直接地结合于纳米粒子表面。
在根据本发明的这一方面的一些情况下，所述第一和第二探针寡核苷酸结合标靶核酸中隔开15-50个碱基对的区。这用于促进标靶核酸的结合以分辨检测器纳米粒子，因为短序列差异在结构上阻碍结合于同一纳米粒子上的第一和第二探针。在一些特别优选的情况下，所述探针寡核苷酸：如实施例1、5、9或10中所陈述。
在一些情况下，各检测器纳米粒子具有200-300之间个探针分子。
在某些情况下，可检测信号手段包含特异性结合对的第一成员。在一些情况下，所述第一成员是生物素或抗生蛋白链菌素。因此，在根据本发明的这一方面的一些情况下，信号纳米粒子包含特异性结合对的第一成员并且保持条包含所述特异性结合对的相应第二成员。在一些优选情况下，所述第一成员和第二成员选自生物素和抗生蛋白链菌素。在一些情况下，所述特异性结合对的第一成员经由连接基团共价连接至信号纳米粒子核心。在一些进一步情况下，这一连接基团包含硫醇基团，并且任选地进一步包含c10-c20烷基和/或二醇间隔基。
在一些情况下，各检测器纳米粒子具有200-300之间个结合成员。
在根据本发明的这一方面的一些情况下，标靶核酸具有作为野生型序列的变体的序列，并且所述第一或第二检测器纳米粒子探针优先于野生型序列结合于变体序列。在一些优选情况下，所述变体序列包含单核苷酸多态性(snp)，并且所述第一或第二检测器纳米粒子探针杂交至标靶核酸中包含snp位置的部分。已证明，用第一和第二寡核苷酸探针官能化的检测器纳米粒子可以具体方式凝聚，以区别标靶核酸中的单碱基差异。
在根据本发明的这一方面的一些情况下，所述核酸为dna。因此，在一些情况下，所述核酸为怀疑与疾病相关的基因或其片段，而在一些其它情况下，所述核酸为已知与疾病相关的基因或其片段。在一些特别优选的情况下，所述核酸为与癌症相关的基因或其片段。在一些其它情况下，所述核酸为rna。
在一些情况下，标靶核酸包含与癌症或具有遗传组分的其它病症相关的突变。具有遗传组分并且可使用根据本发明的突变检测的病症的实例包括：囊肿性纤维化、血色病、苯酮尿、多囊性肾病、镰状细胞疾病、脊髓性肌萎缩、戴萨克斯疾病(tay–sachsdisease)、克罗恩氏病、和亨廷顿氏病。所述突变可选自由以下组成的组：单核苷酸改变、缺失、插入(包括三核苷酸重复)或序列易位。
具体说来，所述突变可在选自由以下组成的组的基因中：ncbi基因id：1956的人类表皮生长因子受体(egfr)；ncbi基因id：672的人类乳癌1早发(brca1)；ncbi基因id：673的人类braf基因；和ncbi基因id：3845的人类kras原癌基因。
在某些情况下，所述突变可选自由以下组成的组：
egfrc.2573t>g(编码l858r)突变；
egfrc.2369c>t(编码t790m)突变；
egfr外显子19缺失突变；和
与结肠直肠癌相关的kras突变。
在一些情况下，测试样品可怀疑含有标靶分析物，而在一些其它情况下，测试样品将已知含有标靶分析物。在一些情况下，测试样品可为环境样品，特别是食物或水样品。在一些其它情况下，测试样品可为生物样品。在一些特定情况下，测试样品可为血液、血浆、尿液、或其它生物流体和其衍生物。
在根据本发明的这一方面的一些情况下，所述方法进一步包括在使测试样品与检测器纳米粒子接触之前使所述测试样品热变性的步骤。在一些进一步情况下，所述方法可进一步包括在测试样品的热变性之前提供热稳定剂的步骤。在一些情况下，所述热稳定剂为葡萄糖。热稳定剂的提供可适用于限制测试样品中的蛋白变性，所述蛋白变性可能在其它方面引起样品粘度的非所需增加。或者或另外，所述方法可包括如下步骤，其中样品用试剂稀释和/或处理以去除白蛋白，如cibacron蓝染料琼脂糖(例如，来自gehealthcarelifesciences的蓝琼脂糖6速流)。
在根据本发明的这一方面的一些情况下，所述方法进一步包括提供多个阻断探针的步骤，所述阻断探针能够特异性结合于标靶核酸的反义链。在一些情况下，所述方法进一步包括使过量的所述阻断探针(例如，相对于检测纳米粒子探针的数目2至10倍过量，如5至7倍过量或甚至6倍过量的阻断探针)与测试样品在适于所述阻断探针结合于标靶核酸的反义链的条件下接触的步骤，由此防止标靶核酸的有义和反义链的再退火。以这种方式，标靶核酸的反义链在与检测器纳米粒子接触之前从系统中去除，从而允许测试样品针对标靶核酸的有义链高度并且特异性地富集。
在某些情况下，所述阻断探针包含经过修饰的核苷酸，如2’-o-甲基核苷酸。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于检测测试样品中标靶核酸的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：
使测试样品热变性；
提供过量的能够特异性结合于标靶核酸的反义链的寡核苷酸阻断探针并且使其与测试样品在适于所述阻断探针结合于标靶核酸的反义链的条件下接触，由此防止所述标靶核酸的有义和反义链的再退火；
提供多个用对标靶核酸的有义链的第一区具特异性的第一探针和对标靶核酸的有义链的第二区具特异性的第二探针官能化的检测器纳米粒子；
使所述检测器纳米粒子与测试样品在适于所述特异性探针结合于标靶核酸的条件下接触，其中测试样品中标靶核酸的存在导致所述检测器纳米粒子的凝聚；
当呈凝聚状态时用配置成在所述检测器纳米粒子的共振波长下提供能量的电磁辐射源照射所述检测器纳米粒子，由此对热转移导向，所述热转移足以引起关闭信号贮器的温敏性聚合物层的至少部分热崩溃；和
观察来自信号贮器的多个信号纳米粒子的释放或其缺乏，其中所释放的信号纳米粒子被捕捉用于在可用肉眼观察的保持条上进行检测。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于检测测试样品中标靶核酸的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：
i)使测试样品热变性；
任选地，ii)提供过量的能够特异性结合于标靶核酸的反义链的寡核苷酸阻断探针并且使其与测试样品在适于所述阻断探针结合于标靶核酸的反义链的条件下接触，由此防止所述标靶核酸的有义和反义链的再退火；
iii)提供多个用对标靶核酸的有义链的第一区具特异性的第一探针和对标靶核酸的有义链的第二区具特异性的第二探针官能化的检测器纳米粒子；
iv)使所述检测器纳米粒子与测试样品在适于所述特异性探针结合于标靶核酸的条件下接触，其中测试样品中标靶核酸的存在导致所述检测器纳米粒子的凝聚；
v)当呈凝聚状态时用配置成在所述检测器纳米粒子的共振波长下提供能量的电磁辐射源照射所述检测器纳米粒子，由此对热转移导向，所述热转移足以引起多个含有信号手段的温敏性微球的至少部分热崩溃(例如，温度诱导的溶解)；和
vi)观察来自所述微球的信号手段的释放或其缺乏，其中所释放的信号手段被捕捉用于在可用肉眼观察的保持条上进行检测。
在根据本发明的这一方面的一些情况下，所述方法进一步包括在使测试样品热变性之前提供热稳定剂的步骤。
在根据本发明的这一方面的某些情况下，所述电磁辐射源是激光二极管或发光二极管，并且对凝聚的检测器纳米粒子的照射会产生至少20℃、40℃、或60℃的局部温度增加。优选地，所述局部温度增加为至少40℃。
在一些情况下，温敏性聚合物层的表面用检测器纳米粒子的第一和/或第二探针官能化，由此使检测器纳米粒子凝聚物局限于所述温敏性聚合物层。
在一些情况下，所述检测器纳米粒子包含银原子核心并且所述信号纳米粒子包含金原子核心。
在一些情况下，所述信号纳米粒子包含生物素-抗生蛋白链菌素结合对的第一成员并且所述保持条包含所述生物素-抗生蛋白链菌素结合对的相应第二成员。
在根据本发明的第二方面的一些情况下，所述阻断探针和监测器纳米粒子探针是2’-o-甲基寡核苷酸。
在第二方面，本发明提供一种用于本发明的第一方面的方法的器件。在一些实施方案中，本发明的这一方面的器件是用于检测测试样品中标靶分析物的存在或不存在，所述器件包括：
检测室，其含有多个检测器纳米粒子，所述检测器纳米粒子包含用对标靶分析物的第一区具特异性的第一探针官能化的第一检测器纳米粒子和用对所述标靶分析物的第二区具特异性的第二探针官能化的第二检测器纳米粒子；和
信号贮器，通过分隔物与所述检测室分隔开并且含有可检测信号手段，其中所述分隔物可在标靶分析物诱导的检测器纳米粒子的凝聚后选择性地破坏。通过提供使检测事件与更容易辨别的信号事件相关的器件，本发明允许器件内置信号放大和读出，其中潜在灵敏性在埃摩尔范围内。所述器件因此充分适于用作现场即时器件，在同一器件上使所有要素从样品制备直至分析读出并且无需先前样品操纵或使用昂贵检测设备。这种类型的器件可容易地适于简单地通过改变检测器纳米粒子探针来检测多种标靶分析物。此外，所述器件经得起与多种测试样品(生物和环境两者)一起使用。
在一些实施方案中，本发明的这一第二方面的器件是用于检测测试样品中标靶分析物的存在或不存在，所述器件包括：
i)检测室，其含有多个检测器纳米粒子，所述检测器纳米粒子包含用对标靶分析物的第一区具特异性的第一探针官能化的第一检测器纳米粒子和用对所述标靶分析物的第二区具特异性的第二探针官能化的第二检测器纳米粒子；和
ii)信号放大区，其含有通过分隔物含于信号贮器中的可检测信号手段，所述分隔物可在标靶分析物诱导的检测器纳米粒子的凝聚后选择性地破坏。
在一些情况下，所述检测室进一步包括集成电磁辐射源，其被配置成在所述检测器纳米粒子的共振波长下提供能量，并且分隔所述检测室与信号贮器的分隔物为温敏性聚合物层。
在一些情况下，所述信号放大区进一步包括集成电磁辐射源，其被配置成在所述检测器纳米粒子的共振波长下提供能量，并且其中所述分隔物包含温敏性聚合物层。
在一些情况下，所述信号贮器包括一个或多个微球，所述微球具有包含所述信号手段的核心和封住所述核心的壳，并且其中所述壳提供所述分隔物。
在一些优选情况下，所述温敏性聚合物如上文关于本发明的第一方面所定义。具体说来，所述温敏性聚合物可包含选自由以下组成的组的至少一种聚合物：聚(苯乙烯磺酸盐)(pss)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)、聚(烯丙胺)(pah)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚[2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯](pdmaema)、羟基丙基纤维素、聚(乙烯基己内酰胺)和聚乙烯基甲醚
在根据本发明的这一第二方面的一些特别优选的情况下，所述温敏性聚合物包含奇数个层，如已知归因于层间的排斥导致无补偿电荷，奇数个层将使所述温敏性聚合物在高于60℃的温度下膨胀并且破裂。
在根据本发明的这一第二方面的一些情况下，所述电磁辐射源可为激光二极管或发光二极管(led)。所述电磁辐射源可适于在对应于当呈凝聚状态时所述检测器纳米粒子的共振频率的波长下产生光。例如，所述电磁辐射源可为具有在范围600至650nm中的波长(例如，633nm)的红色激光二极管。或者，所述电磁辐射源可为优选地配置成在415-425nm的波长下提供能量的led。
在一些情况下，所述器件的检测室可用
在一些情况下，分隔检测室与信号贮器的分隔物用特异性结合对的一个成员官能化以便使检测器纳米粒子凝聚物局限于所述分隔物。在一些特定情况下，所述分隔物用检测器纳米粒子的第一和/或第二探针官能化。以这种方式，可使用支撑纳米粒子凝聚的相同结合策略使凝聚的检测器纳米粒子局限于所述分隔物。探针的这种双重功能就所述器件的设计和制造来说是有利的。
在根据本发明的这一第二方面的一些情况下，所述温敏性聚合物包含聚(烯丙胺)(pah)的表面层。因此，在一些情况下，所述表面pah层用检测器纳米粒子的第一和/或第二探针官能化。
在根据本发明的这一和其它方面的一些情况下，所述第一和第二检测器纳米粒子各自包含所述第一和第二探针两者。在一些特别优选的情况下，所述第一和第二检测器纳米粒子是相同的。
在一些情况下，所述检测器纳米粒子包含金属原子、优选地贵金属核心。在特定情况下，所述金属为银。在一些情况下，所述检测器纳米粒子核心的直径在10至100nm范围中，例如在范围40至70nm中。
根据本发明的这一第二方面，所述信号手段可如关于本发明的第一方面所定义。具体说来，所述信号手段可包含抗生蛋白链菌素、抗体、酶(例如，辣根过氧化物酶)、荧光团、染料、一个或多个量子点、和/或一个或多个乳胶珠粒。
在根据本发明的这一和其它方面的一些情况下，所述信号手段为多个信号纳米粒子。本发明人已发现纳米粒子提供作为信号手段的有用优势，因为其允许使用渗透性或半渗透分隔物来关闭信号贮器。如防止例如液体染料的泄漏将需要的气密密封件对压力的差异敏感；因此，压力诱导的分隔物材料的破裂或弱化可能导致所述信号手段的不想要的释放，和增加的假阳性结果的风险。有利的是，纳米粒子足够小以含于合适的信号贮器中，但也足够大，使得关闭所述贮器的分隔物可制成渗透性以允许空气压力的平衡。优选地，从所述信号贮器释放的信号纳米粒子的数目超过实现所述释放所需的检测器纳米粒子的数目。
在一些情况下，所述信号纳米粒子包含金属原子、优选地贵金属核心。在特定情况下，所述金属为金。在一些情况下，所述信号纳米粒子核心的直径在10至20nm范围内。
在一些特别优选的情况下，所述信号纳米粒子的金属核心和所述检测器纳米粒子的金属核心是不同的金属。以这种方式，所述检测器纳米粒子可用于通过在不会由信号纳米粒子或所述器件的其它组分吸收的波长下照射而将热转移导向所述温敏性聚合物。
在一些情况下，所述信号纳米粒子可具有球形形态。在其它情况下，所述信号纳米粒子可具有杆状形态。还预期其它信号纳米粒子形态并且其可容易地用于在所述器件中使用。不同纳米粒子形态允许在信号纳米粒子释放后观察到不同颜色信号，这在提供所述器件的彩色编码读出时可为有利的。
在一些情况下，所述信号纳米粒子用硫醇封端的聚氧乙烯壬基苯基醚(igesh)官能化。用igesh官能化会使纳米粒子针对凝聚稳定化，甚至在干燥并且再溶解后。
在一些情况下，所述信号贮器包含在支撑材料、优选地大孔硅衬底中的一个或多个腔。大孔硅衬底的使用允许大规模预装载信号手段；所述衬底可接着切割至所需的大小，从而就器件制造来说提供相当大的优势。
在一些情况下，所述腔为微腔、微井、或微孔。在一些优选情况下，各腔可含有在至少4×105个纳米粒子/μm3)的浓度下的可检测信号手段。以这种方式，通过潜在少量的凝聚的检测器纳米粒子使关闭信号贮器的分隔物崩溃将导致相当大体积的信号手段的释放，由此产生信号的放大。优选地，需要使关闭多个腔的分隔物崩溃以产生可检测信号，以便最小化在例如打开少量的腔的分隔物的机械破坏的情况下的假阳性。
在根据本发明的第二方面的一些情况下，所述信号贮器可包括多个如关于本发明的第一方面所定义的微球。具体说来，所述微球可具有在范围1至20μm中，如在范围5至10μm中的平均直径。
在一些情况下，所述信号贮器包含多个所述微球，并且所述壳的表面层带负电或带正电。
在一些情况下，所述信号贮器包括多个所述微球，并且所述微球位于信号放大区中的微通道中并且邻近和/或接触多个包装粒子。所述包装粒子可具有大于所述微球的直径。具体说来，所述包装粒子可包含玻璃、硅石或琼脂糖珠粒。所述包装粒子可具有在范围20至200μm中，如在范围50至150μm中的平均直径。
在一些情况下，其中容纳所述微球连同所述包装粒子的微通道形成微流体保持腔。
在根据本发明的这一第二方面的一些情况下，所述器件进一步包括信号显示区，例如其可与所述检测室连通。在一些优选情况下，这一信号显示区包括保持手段以在可检测信号手段从信号贮器释放后捕捉所述可检测信号手段。在特定情况下，所述保持手段为保持条。所述信号显示区并入所述器件中会允许便利的器件内置读出。
在根据本发明的这一和其它方面的一些情况下，检测器纳米粒子探针是与标靶核酸的第一和第二区互补的寡核苷酸。在一些情况下，一种或两种寡核苷酸探针经由连接基团共价地连接至检测器纳米粒子核心。在一些特定情况下，所述连接基团可包含硫醇基团。在一些进一步情况下，所述连接基团可包含c10-c20烷基和/或二醇间隔基。
在根据本发明的这一方面的一些情况下，所述第一和第二探针寡核苷酸结合标靶核酸中隔开15-50个碱基对的区。
在一些情况下，各检测器纳米粒子具有200-300之间个探针分子。在某些情况下，所述探针寡核苷酸为2’-o-甲基寡核苷酸。
在一些情况下，检测器纳米粒子探针寡核苷酸结合与疾病相关的基因。在一些优选情况下，所述基因为与癌症相关的基因。
在一些情况下，所述第一或第二探针寡核苷酸与作为野生型序列的变体的标靶核酸序列互补。在特定情况下，这一变体序列包含单核苷酸多态性(snp)并且所述第一或第二探针寡核苷酸杂交至标靶核酸中包含所述snp位置的部分。在一些情况下，所述变体序列包含与癌症或具有遗传组分的其它病症相关的突变。具有遗传组分并且可使用相关突变作为根据本发明的标靶分析物的病症的实例包括：囊肿性纤维化、血色病、苯酮尿、多囊性肾病、镰状细胞疾病、脊髓性肌萎缩、戴萨克斯疾病、克罗恩氏病、和亨廷顿氏病。所述突变可选自由以下组成的组：单核苷酸改变、缺失、插入(包括三核苷酸重复)或序列易位。
在一些情况下，所述突变是在选自由以下组成的组的基因中：ncbi基因id：1956的人类表皮生长因子受体(egfr)；ncbi基因id：672的人类乳癌1早发(brca1)；ncbi基因id：673的人类braf基因；和ncbi基因id：3845的人类kras原癌基因。
具体说来，所述突变可选自由以下组成的组：
egfrc.2573t>g(编码l858r)突变；
egfrc.2369c>t(编码t790m)突变；
egfr外显子19缺失突变；和
与结肠直肠癌相关的kras突变。
在根据本发明的这一和其它方面的一些情况下，所述可检测信号手段包含特异性结合对的第一成员。在一些优选情况下，所述第一成员是生物素或抗生蛋白链菌素。因此，在一些特别优选的情况下，所述信号纳米粒子包含特异性结合对的第一成员并且所述信号显示区的保持条包含所述特异性结合对的相应第二成员，其中所述第一成员和所述第二成员是选自生物素和抗生蛋白链菌素。以这种方式，信号纳米粒子可在其释放后被捕捉至保持条上，并且可作为在所述条处由所述纳米粒子的距离依赖性光学特性引起的可见颜色改变容易地观察到。
在一些情况下，所述特异性结合对的第一成员经由连接基团共价连接至信号纳米粒子核心。在一些特定情况下，所述连接基团可包含硫醇基团。在一些进一步情况下，所述连接基团可包含c10-c20烷基和/或二醇间隔基。在一些情况下，各检测器纳米粒子具有200-300之间个结合成员。
在根据本发明的这一第二方面的一些情况下，所述器件进一步包括与所述检测室连通的样品入口。
在一些情况下，所述器件进一步包括安置于所述样品入口与检测室之间的溶解室，所述溶解室包括加热元件。优选地，所述加热元件是薄膜加热元件，因为这些元件比整体加热组件更快速并且有效，并且可通过器件内置电源(例如，纽扣电池)容易地供电。
在某些情况下，所述样品入口可包括血液分离手段。优选地，这将为自供电的集成微流体血液分析系统(simbas)，其比基于其它膜的血液分离技术更有效并且具成本有效性。在其它情况下，所述样品入口含有热稳定剂，如葡萄糖或cibacron蓝。
在一些情况下，本发明的这一和其它方面的器件可为用于检测例如循环dna的器件，其可采用独立、自供电的微流体系统的形式。所述器件可包含和/或由聚合物材料制成。所述器件可设计成使得能够实现连续工作流。具体说来，可提供以下工作流阶段和相应的器件特征：样品上制备(血浆萃取和标靶dna富集)、样品与检测纳米粒子一起孵育、检测信号传导粒子释放和最终对侧向流动分析条的结合分析以生成肉眼可检测信号。在一些情况下，所述器件可容纳少于500微升的样品体积。在一些情况下，所述微流体系统可采用将纸样微流体装置集成至塑料卡匣中的杂合器件的形式。在一些情况下，所述器件内部的样品运输可由负压(例如，定制的聚(二甲基硅氧烷)(“pdms”)微型泵)驱动。
在根据本发明的这一第二方面的一些情况下，所述检测室进一步含有多个对标靶核酸的反义链具特异性的阻断探针。所述阻断探针可如关于本发明的第一方面所定义。
在根据本发明的这一和其它方面的一些情况下，所述阻断探针是2’-o-甲基寡核苷酸。
在第三方面，本发明提供一种用于检测两种或更多种测试样品中标靶分析物的存在或不存在的器件，其包括在同一器件上的平行路径中的本发明的第二方面的元件。
在第四方面，本发明提供一种用于检测测试样品中标靶核酸的存在或不存在的器件，所述器件包括：
样品入口；
与所述样品入口连通的溶解室，所述溶解室包括加热元件；
检测室，其具有：过量的能够特异性结合于标靶核酸的反义链的阻断探针；和多个用对标靶核酸的有义链的第一区具特异性的第一探针和对所述标靶核酸的第二区具特异性的第二探针官能化的检测器纳米粒子；
集成电磁辐射源，其被配置成在所述检测器纳米粒子的共振波长下提供能量；
信号贮器，其含有多个信号纳米粒子，并且通过温敏性聚合物层与所述检测室分隔开；和
与所述检测室连通的信号显示区，所述信号显示区包括保持条以在从所述信号贮器释放后捕捉所述信号纳米粒子。
在第五方面，本发明提供一种用于检测测试样品中标靶核酸的存在或不存在的器件，所述器件包括：
i)样品入口；
ii)与所述样品入口连通的溶解室，所述溶解室包括加热元件；
iii)检测室，其具有：多个用对标靶核酸的有义链的第一区具特异性的第一探针和对所述标靶核酸的第二区具特异性的第二探针官能化的检测器纳米粒子和任选地，过量的能够特异性结合于标靶核酸的反义链的阻断探针；
iv)集成电磁辐射源，其被配置成在呈凝聚状态的所述检测器纳米粒子的共振波长下提供能量；
v)多个温敏性微球，其具有包含信号手段的核心和封住所述核心的壳，其中所述壳包含温敏性聚合物；和
vi)与所述检测室连通的信号显示区，所述信号显示区包括保持条以在从所述温敏性微球释放后捕捉所述信号手段。
在第六方面，本发明提供用于哺乳动物受试者的诊断或预后方法的本发明的第二、第三、第四、或第五方面的器件，其中测试样品为已从所述受试者获得的生物样品。
在第七方面，本发明提供用于检测细菌、寄生虫、或其它生物污染物的方法的本发明的第二、第三、第四、或第五方面的器件，其中测试样品为环境样品。
在第八方面，本发明提供一种试剂盒，其包括：
如下器件，其具有：样品入口；包括加热元件的溶解室；集成电磁辐射源；含有多个信号纳米粒子并且由温敏性聚合物层关闭的信号贮器；和信号显示区，其包括保持条以在从所述信号贮器释放后捕捉所述信号纳米粒子；
能够特异性结合于标靶核酸的反义链的阻断探针的一个或多个群体；和
多个用对所述标靶核酸的有义链的第一区具特异性的第一探针和对所述标靶核酸的第二区具特异性的第二探针官能化的检测器纳米粒子的一个或多个群体。
在第九方面，本发明提供一种试剂盒，其包括：
i)如下器件，其具有：
样品入口；
包括加热元件的溶解室；
集成电磁辐射源；
多个温敏性微球，其具有包含信号手段的核心和封住所述核心的壳，其中所述壳包含温敏性聚合物；和
信号显示区，其包括保持条以在从所述微球释放后捕捉所述信号手段；
任选地，ii)能够特异性结合于标靶核酸的反义链的阻断探针的一个或多个群体；和
iii)多个用对所述标靶核酸的有义链的第一区具特异性的第一探针和对所述标靶核酸的第二区具特异性的第二探针官能化的检测器纳米粒子的一个或多个群体。
本发明包括所述方面的组合和所述的优选特征，除非其中此类组合清楚地为不可允许的或被陈述为明确地加以避免。本发明的这些和其它方面和实施方案在下文中更详细并且参考随附实施例和图式加以描述。
附图简述
图1示出所设计的寡核苷酸探针结合于(合成)突变型和野生型braf基因序列，如通过表面等离子体共振所分析。a：示出突变型(圆形)和野生型(正方形)探针结合于突变型braf基因序列(500nm的合成ssdna100聚体)的程度；所述突变型探针特异性结合于突变型braf基因，而所述野生型探针比较微弱地结合。b：示出如与野生型braf基因序列(500nm的合成ssdna100聚体；三角形)相比，所设计的突变型探针优先结合于突变型braf基因序列(500nm的合成ssdna100聚体；圆形)。c：示出关于三种不同的探针化学，突变型探针结合于突变型braf基因的相对强度。结合曲线的比较确定了关于所述不同的探针化学的解离常数(kd)为：dna＝2.41nm；2′-o-me＝1.81nm；lna＝7.55nm。
图2示出来自indicate器件的计算机模拟的计算建模数据，其用于在制造之前优化所述器件的某些方面。a：示出了当用100mwled激光(1×107w/m2的强度)均匀地照明时，随检测器纳米粒子之间的距离针对凝聚的纳米粒子的数目而变的温度改变(δt)。由此确定了当用100mwled激光均匀地照明时，其中纳米粒子之间的距离>50nm(即，>15个碱基对)的50个检测器纳米粒子的凝聚物将引起超过40℃的温度增加。b：示出了需要打开以产生可检测信号的微孔的数目，其随微孔中信号纳米粒子的浓度和凝聚的检测器纳米粒子的数目两者而变。基于各微孔可含有0.2-1×109之间个信号纳米粒子，确定了将需要至少8个微孔打开以产生可见信号(8×109个信号纳米粒子)。
图3示出全血样品的器件内置分离以通过自供电的集成微流体血液分析系统(simbas)生成血浆。示出随时间增加从全血分离清血浆(a、b、c、和d)。在所述沟槽结构的出口处的清血浆用白线指示以引导眼睛。
图4示出通过turkevich方法合成的金纳米粒子的表征。a：示出了所指示的具有50nm规模的金纳米粒子的透射电子显微术(tem)图像。b：示出了所述金纳米粒子的uv-vis光谱表征，其中在519nm下具有局部表面等离子体带。c：示出了所合成的纳米粒子的大小分布直方图。通过分析超过100个纳米粒子的样品确定了13.3±1.2nm的平均直径。
图5示出在用dna探针官能化后金纳米粒子的表征。a：示出了dna官能化纳米粒子的tem图像，其中结合的dna可作为围绕所述纳米粒子的微弱分子壳(大约厚度1.4nm)观察到。b：示出了官能化纳米粒子的uv-vis光谱表征，其中在dna结合后在所有样品中均观察到大约3nm的等离子体带红移；指示如tem图像中所观察，形成分子壳。
图6示出在标靶核酸存在下纳米粒子的凝聚所需的探针序列的“夹心样”结合的示意图。a：标靶基因的野生型序列可结合上游探针，但不结合对突变型基因具特异性的探针，并且因此不会引起纳米粒子凝聚(即，其保持单分散)。b：标靶基因的突变型序列可结合对突变型基因具特异性的探针和上游探针两者。所述标靶序列充当分子桥，结合独立纳米粒子上的两种探针，由此引起纳米粒子凝聚。c：标靶基因的野生型序列与对突变型基因具特异性的探针之间的错配会防止“夹心样”结合。
图7示出关于给定浓度的纳米粒子结合探针(1.5nm)，分析物(标靶dna)浓度对纳米粒子凝聚的影响，如通过uv-vis光谱法所确定。a-c：示出了关于变化浓度(分别为50、25、和5nm)的(匹配)突变型dna，uv-vis光谱随时间的移位。d-f：示出了关于变化浓度(分别为50、25、和5nm)的(错配)野生型dna，uv-vis光谱随时间的移位。标靶dna中的单一碱基对错配导致纳米粒子的不太显著的凝聚，指示用dna探针官能化的纳米粒子可以可区别标靶序列中的单碱基差异的方式凝聚。g-i：示出了关于不同浓度的匹配(即，突变型)和错配(即，野生型)标靶dna的比较性动力学数据。
图8示出根据turkevich方法合成的金信号纳米粒子的表征。a：示出了使信号纳米粒子官能化以使其针对凝聚稳定化的硫醇封端的聚氧乙烯壬基苯基醚(igesh)的化学结构。b：示出了igesh官能化的信号纳米粒子的可逆干燥/水合过程的示意图。c：示出了干燥前和干燥后在水中的igesh官能化的信号纳米粒子的uv-vis光谱。
图9a-d：示出呈多种角度和放大率的用于形成信号贮器的大孔硅衬底的扫描电子显微术(sem)图像。微柱腔的近似尺寸已连同5μm比例尺一起指示。
图10a-d：示出呈多种放大率的装载有信号纳米粒子的信号贮器衬底的sem图像。指示了500、20、和5μm比例尺。金信号纳米粒子作为白色区域观察到。
图11示出温敏性聚合物膜逐层转移至所述大孔硅衬底的表面上的过程。a：示出了这一过程的示意图：首先，所述硅衬底用膜1(pei(pss/pah)10pss)涂布，而膜2(pei(pss/pdadmac)12)形成于聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)的牺牲衬底上；两种膜接着通过静电相互作用和压力附接；最终，所述牺牲衬底通过溶解或通过以机械方式使其脱落而去除，以获得最终膜。b：示出在这一过程的各步骤期间拍摄的sem图像，其中最终膜的厚度经过测量大约为60-100nm。
图12示出在用980nm激光(0.3w/cm2)照射之前(a)和之后(b)用金纳米棒掺杂的温敏性膜的sem图像。在激光照射之后清楚可见所述膜的破裂。
图13a-e：示出在微柱腔中装载有信号纳米粒子并且表面上存在有温敏性膜2的信号贮器衬底的sem图像。指示了2、5、和10μm比例尺。在激光照明之后可见所述膜的破裂(d和e)。
图14示出关于70-碱基匹配探针(正方形)；70-碱基错配探针(圆形)；140-碱基匹配探针(正三角形)；和140-碱基错配探针(倒三角形)的吸光度比值对时间曲线。关于两种匹配探针观察到abs620/abs538比率的明显时间依赖性增加，其显著超过接近基线(关于所述错配探针可见的最小吸光度改变)。结果指示标靶特异性纳米粒子凝聚，其中已辨别单核苷酸差异。
图15示出(左侧图)在加热之前(下部曲线)和在加热之后(上部曲线)关于匹配探针的abs620/abs538比率针对时间(以分钟计)的曲线；和(右侧图)在加热之前(下部曲线)和在加热之后(上部曲线)关于错配探针的abs620/abs538比率针对时间(以分钟计)的曲线。
图16示出信号放大区(保持腔)的示意图，其中示出凝聚的检测器纳米粒子从左侧进入并且遇到多个装载有信号手段的微球(下文示出由灯泡表示的激光光源“hν”)。凝聚的纳米粒子与所述微球紧密缔合。在所述微球的右边示出多个呈紧密包装形态的硅石或玻璃珠粒，其具有大于所述微球的直径。所述珠粒用于保持完整微球。由凝聚的纳米粒子吸收激光会引起所述纳米粒子的等离子体共振和加热，其又引起温敏性微球壳的破坏，从而允许信号手段逃逸。所述信号手段沿箭头的方向传递通过所述珠粒至右边，所述流动通过微泵(未示出)促进。
图17示出凝聚的纳米粒子触发的信号手段从微球释放的示意图。左侧图描绘了具有温敏性聚合物壳和含有信号手段(例如，可容易检测的分子)的核心的微球。中间图描绘了正由凝聚的纳米粒子围绕的微球，其中多个凝聚的纳米粒子与微球壳的表面紧密接触。右侧图描绘了正由光源(例如，具有对应于凝聚的纳米粒子的共振频率的波长的激光二极管)照明的微球和凝聚的纳米粒子。凝聚的纳米粒子由所述光源加热并且热量转移至微球的壳，从而使其崩溃，由此导致信号手段从微球的核心释放。
图18示出a)包装于环烯烃聚合物(cop)通道内的粒子，其中具有直径75μm的玻璃珠粒堵塞所述通道，由此保持装载葡聚糖-fitc的微球；和b)葡聚糖-fitc从微球释放(比较左侧在激光之前与右侧在激光之后。
图19示出本发明的集成器件的示意图，说明了在不同模块之间的关系。上部图示出了所述集成器件的顶视图。下部图示出了呈透视图的所述器件。样品入口在左侧示出。向右移动，示出了simbas过滤器、加热器(“δt”)、阻断探针存储区、电池、检测器纳米粒子(“aunp”)探针贮器、发光二极管(led)、微胶囊阵列、侧向流分析(lfa)垫和泵。
发明详述
在描述本发明时，将使用以下术语，并且所述术语意图如下文所指示加以定义。
纳米粒子
如本文所用，“纳米粒子”是指具有纳米规模的粒子，并且不意图涵盖任何特定形状限制。具体说来，“纳米粒子”涵盖纳米球、纳米管、纳米盒、纳米簇、纳米棒等。在某些实施方案中，本文中所涵盖的纳米粒子和/或纳米粒子核心具有一般多面体或球形几何形状。对纳米粒子或纳米粒子核心的“直径”的提及一般分别意指纳米粒子或纳米粒子核心的最长尺寸。关于具有大体上多面体或球形几何形状的纳米粒子，横贯所述粒子的最短尺寸将典型地在横贯所述粒子的最长尺寸的50％内并且可例如在25％或10％内。
如本文所用，“晕边(corona)”是指层或涂层，其可部分地或完全地覆盖纳米粒子核心的暴露表面。所述晕边包括多个共价附接至纳米粒子的核心的配体。因此，所述晕边可被视为围绕或部分地围绕金属核心的有机层。在某些实施方案中，所述晕边提供和/或参与纳米粒子的核心的钝化。因此，在某些情况下，所述晕边可包括充分完整的涂层，其大体上使核心稳定化。在某些情况下，所述晕边促进纳米粒子的溶解度，如水溶解度。
纳米粒子为可用作用于固定配体的衬底的小粒子，例如金属或半导体原子的簇。
如本文所用，术语“检测器纳米粒子”是指用一种或多种对所关注的标靶分析物具特异性的探针官能化的纳米粒子。优选地，所述纳米粒子具有平均直径在10与100nm之间、更优选地在20与60nm之间的核心。当除了所述核心之外还考虑配体时，优选地所述粒子的总体平均直径在22与70nm之间，更优选地在30与60nm之间并且最优选地在40与50nm之间。所述平均直径可使用本领域中众所周知的技术，如透射电子显微术来测量。
如本文所用，术语“信号纳米粒子”是指意图充当信号分子的纳米粒子。这种信号可由于所述纳米粒子的固有特性，例如贵金属纳米粒子的距离依赖性光学特性，或经由并入可检测标记而产生。优选地，所述纳米粒子具有平均直径在5与30nm之间、更优选地大约15nm的核心。当除了所述核心之外还考虑配体时，优选地所述粒子的总体平均直径在7与40nm之间，更优选地在10与30nm之间并且最优选地在15与20nm之间。所述平均直径可使用本领域中众所周知的技术，如透射电子显微术来测量。
核心材料可为金属或半导体并且可由超过一种类型的原子形成。纳米粒子核心也可由合金形成。优选地，核心材料为选自au或ag的金属。所述纳米粒子的核心优选地包含至少500个原子(例如，金原子)以提供在纳米范围内的核心直径。
在一些实施方案中，所述纳米粒子或其配体可包含可检测标记。所述标记可为所述纳米粒子的核心或所述配体的元素。所述标记可由于所述纳米粒子的那种元素的固有特性或通过与另一可检测的部分连接、结合或缔合而可检测。标记的优选实例包括作为荧光基团或染料的标记。荧光基团包括荧光素、若丹明或四甲基若丹明、德克萨斯红、cy3、cy5等，并且可通过所述荧光标记的激发和使用拉曼散射光谱法检测发射的光来检测(y.c.cao,r.jin,c.a.mirkin,science2002,297:1536-1539)。
凝聚
如本文所用，“凝聚”是指形成检测器纳米粒子的凝聚物。“凝聚物”为通过纳米粒子探针与所关注的标靶分析物之间的物理相互作用接合的检测器纳米粒子的组合件。由于所述标靶分析物为个别检测器纳米粒子之间的物理“桥”，凝聚可仅当存在所述标靶分析物时发生。凝聚物并非固定单元，并且大小和形状可改变；例如，大的凝聚物可分解成较小的凝聚物，或小的凝聚物可聚结以形成较大的凝聚物。
温敏性聚合物
如本文所用，“温敏性聚合物”或“温度反应性聚合物”是指随温度展现其物理特性的剧烈并且不连续改变的聚合物或聚合物的组合。具体说来，所述温敏性聚合物可为随温度展现在水或水溶液中的溶解度的改变的聚合物。具体实例包括：聚(苯乙烯磺酸盐)(pss)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)、聚(烯丙胺)(pah)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚[2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯](pdmaema)、羟基丙基纤维素、聚(乙烯基己内酰胺)和聚乙烯基甲醚。
下文举例提供并且不应解释为对权利要求书的范围的限制。
实施例
实施例1-开发用于braf突变检测的阻断和检测探针。
braf基因的突变在超过45％的黑素瘤中发现，其中多达80％为单碱基突变t1799a(v600e)。相信这种braf突变的状态的检测是用于肿瘤测试的可靠代替者。
为了检测braf突变状态，开发两种探针：
1)阻断探针，与所关注的突变型dna序列的反义链互补；在双链dna(dsdna)的热变性后，这种探针优先结合于突变型dna序列的反义链。
所述阻断探针短小并且过量提供，以致结合动力学极大地有利于阻断探针:反义链的形成而非使突变型序列dsdna再退火。这导致突变型dna序列的有义链的富集以由所述器件进行后续检测。
2)检测探针，与突变型dna序列的有义链互补并且形成凝聚事件的基础。这种探针选择性地结合于突变型dna序列而不结合于野生型dna序列。
合成突变型和野生型braf序列，并且通过表面等离子体共振(spr)在pbs缓冲液中分析其与针对野生型和突变型braf的检测探针的结合。发现所述突变型braf序列优先结合于突变型braf探针(图1a)而非野生型探针。突变型braf探针：5'-tggtctagctacagagaaatctcg-3'(seqidno:1)；wtbraf探针：5'-tggatccagacaactgttcaaact-3'(seqidno:2)(对应于合成序列的最初24个核苷酸)。同样，所述突变型braf探针与突变型braf序列的结合比野生型braf序列强烈得多(图1b)。这些数据证明了，所设计的探针可特异性结合于所关注的突变型序列。
还测试了多种不同的探针化学(dna、2’-o-me、和lna)(图1c)，以便确定突变型探针结合于针对各探针的突变型braf基因的相对强度。dnaexiqon探针：5'-atcgagatttctctgtagctag-3'(seqidno:3)；2’-o-甲基探针：5'-atcgagatttctctgtagctag-3(seqidno:4)(均结合dna突变型70聚体的反义链)；lna突变型探针：5'-tggtctagctacagagaaatctcg-3'(seqidno:5)(结合dna突变型70聚体的有义链)。结合曲线的比较确定了关于所述不同的探针化学的解离常数(kd)为：dna＝2.41nm；2′-o-me＝1.81nm；lna＝7.55nm。从这些数据，确定2’-o-甲基探针化学为最优选的。
实施例2-indicate器件特征的计算机建模。
为了优化所述器件的功能特征，使用计算建模来计算机模拟所述indicate器件。
首先，定义负责各个别组分的个别数学等式，并且接着使用遗传算法(ga)(goldberg和deb,1991,foundationsofgeneticalgorithmsinfoundationsofgeneticalgorithms,g.j.e.rawlins编morgankaufmann,sanmateo,ca)进行组合。所述技术在优化等离子体器件的设计时已经充分确立(sukharev和seideman,nanolett,2006,第6卷,第4期,第715-719页)。
模拟用于关于以下方面优化所述器件：1)高灵敏性(即，低假阴性率)；2)高信噪比；和3)输入信号的高放大率。使用matlab数值计算(mathworks)和comsolmultiphysics(comsolab)软件内的多重物理量方法执行分析。
使用用于过滤过程的概率方法(roussel等人,physrevlett,2007,第98卷,第114502页)对从样品模块中的红血球分离血浆进行建模。使用双态热力学模型(owczarzy等人,biopolymers,1997,第44卷,第3期,第217-239页)模拟溶解模块中dna的退火和再退火的电热融解。使用bergvonhippel方法(berg和vonhippel,jmolbiol,1987,第193卷第723-750页)对信号放大区中与突变型dna结合于探针相关的结合能进行建模，而在激光与凝聚至温敏性聚合物的检测器纳米粒子之间的能量转移通过经典热转移理论(baffou和quidant,laserphotonicsrev,2013第7卷,第171–187页；hohenester和trügler,computphyscommun,2012,第183卷,第370–381页)进行建模。
为了提供针对所述器件的初始性能范围，如下对突变型有义链dna结合于检测器纳米粒子时所形成的凝聚物的大小进行建模：
其中s表示由含有多个dna结合探针纳米粒子(npnp)的凝聚物覆盖的表面，φagnp表示银纳米粒子的直径，并且p为粒子间距离。
基于先前的理论和实验工作(baffou等人,applphyslett,2009,第94卷第153109-153103页)，这与均匀照明的模型组合：
其中σabs、i、κ、s、和p分别为探针np的吸收系数、由led光源提供的功率强度、凝聚物的热导率、凝聚物的侧向大小和粒子间距离。
图2a示出随检测器纳米粒子之间的距离(以碱基对的数目计)针对当用100mwled激光(1×107w/m2的强度)均匀地照明时凝聚的探针粒子的数目(npnp)而变的δt。从这一分析确定了其中dpnp-pnp>50nm(即，>15个碱基对)的50np凝聚物将引起室温以上超过40℃的温度增加。
通过对具有固定尺寸(10μm直径×500μm)的圆柱体微孔进行建模，针对10-5-5×10-5mol/l的信号纳米粒子的浓度范围，我们可概述针对凝聚物中所含的探针纳米粒子的数目需要打开的微孔的最小数目。图2b示出需要打开的微孔的数目，其随微孔中信号纳米粒子的浓度和凝聚的检测器纳米粒子的数目两者而变。应注意，在大孔硅衬底的微井的情况下，所述腔具有大约1μm的直径和大约10μm的深度。在这种情况下，将上述方法应用于计算针对正信号打开的孔的数目会产生图7(纳米粒子浓度0.1mol/l，每个孔的纳米粒子数目4×109)。因此，以上各图虽然说明了某些实施方案，但不会如本文进一步定义限制本发明。
基于各微孔可含有0.2-1×109之间个信号纳米粒子，确定了将需要至少8个微孔被触发以产生可见信号(8×109个信号纳米粒子)。可见信号的这一阈值有助于在单一孔打开的情况下防止所述器件上的假阳性。然而，如上文可见，关于尺寸1μm×10μm的腔，相应阈值可计算为7个孔打开。
为了发生这种情况，需要每个微孔每种凝聚物至少50个探针纳米粒子。这对应于就可见信号来说突变型有义链dna的总计400个拷贝。假定25％的器件效率会产生每ml血液1,600个突变型dna拷贝或16,000个拷贝的理论检测极限(lod)。这充分在癌症患者的血液中突变型krasdna拷贝或突变型braf拷贝的报告水平(据报告在50-180,000之间；spindler等人,clincancerres,2012,第18卷,第1177-1185页)内。
这种类型的建模也可用于配合所述器件的制造以便满足具体检测或市场需求。例如，虽然用于诊断目的的器件需要高灵敏度，但促进作出临床决定来施用昂贵的靶向疗法的器件可受益于高特异性(即，低假阳性率)。
实施例3-验证微流体血液分离。
过滤全血样品以生成血浆是通过自供电的集成微流体血液分析系统(simbas)(dimov等人,labchip,2011,第11卷,第845-850页)，其比基于其它膜的血液分离技术更有效并且具成本有效性。
所述simbas系统经过调适以通过修改所述设计来接受较高体积(100μl)。对初始设计(即，描述于上文dimov等人,2011参考文献中)的主要改变如下。
使用不同制造技术来制造芯片。在这种情况下，使用快速并且简单的多重塑料薄膜层合(pmma、psa、cop)技术。
池的尺寸定标为60微升体积以便从100微升全血样品获得40微升血浆。
通道纵横比针对制造过程限制进行调试。
设计最终通道尺寸以降低所述芯片的流体阻力。
提供在侧壁上不存在尖锐边缘的形式的特定改进，所述尖锐边缘改变为混合边缘。所提出的路径中的所有边缘均已混合以便避免血小板聚集和形成可能容易堵塞流动的凝块。
最后，通道中位于池的入口和出口处的区段已分别用扩散器和喷嘴形状进行修改。一方面，当扩散器接近池的边缘以获得平滑填充过程(填充所述池的均一性)时，所述扩散器减慢流动。另一方面，喷嘴加速在池的出口处的血浆，从而改进分离的血浆的流动并且实际上改进分离效率。
图3示出随时间增加从全血样品分离清血浆，证明了血液的器件内置分离能力。
实施例4-检测器纳米粒子合成和官能化。
根据turkevich方法(turkevich等人,discussfaradaysoc,1951,第11卷,第55–75页)合成金纳米粒子(aunp)，以产生具有13.3±1.2nm(通过分析超过100个纳米粒子而估算)的平均直径的粒子。uv‐vis表征示出了位于519nm处的局部表面等离子体带(图4)。金检测器纳米粒子由于其稳定表面化学而在所述器件的原型开发期间使用。在最终器件中，将使用银检测器纳米粒子。
柠檬酸盐稳定化的aunp根据最近方案(mirkin等人,analchem,2006,第7卷,第8313‐8318页)用单链dna(ssdna)官能化。用dna稳定化的aunp在含有0.01wt％的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(sds)的水溶液中展现胶体稳定性，如通过uv‐vis光谱法确认。在dna结合后，所有样品中等离子体带均红移约3nm，表明围绕纳米粒子表面形成分子壳。tem分析确认了形成约1.4nm厚度的分子壳(图5)。
实施例5-在突变型标靶dna存在下验证检测器纳米粒子凝聚。
图6示出两种间隔开15-50bp的探针的“夹心”结合的示意图，用于询问变化浓度的标靶dna分析物。当两种探针结合于检测器纳米粒子时，其将与突变型有义链dna的其各自互补区杂交以形成在个别纳米粒子之间的桥，由此诱导自由浮动的检测器纳米粒子的凝聚。
通过随时间的色移和abs(620/520)比率来测量凝聚(图7)。如与完全互补序列(图7a-7c)相比，使用单碱基错配的dna的杂交(图7d-7f)产生不太显著的聚集和较长的杂交时间，证明了用寡核苷酸探针官能化的纳米粒子可以具体方式凝聚以区别单碱基突变。图7g-7i示出关于不同浓度的匹配(即，突变型)和错配(即，野生型)标靶dna的比较性动力学，其中在匹配与错配序列的动力学概况之间存在明显差异。
制备两种类型的与称作“1triplex”(hs-3’-t10-cttgttttc-5’)(seqidno:6)和“2triplex”(hs-5’-t10-gattttcttc-3’)(seqidno:7)的探针结合的aunp并且用作储备溶液。所述两种互补粒子在含有10mmpbs(ph7.4)、0.137mnacl和2.7mmkcl的缓冲液中与额外nacl(0.2m)混合。我们使用三种不同浓度的匹配和错配dna(即，5、25和50nm)，产生总计6项实验。与分析物浓度无关，如与匹配序列相比，具有单碱基错配的dna示出不太显著的聚集和较长杂交时间。
使dna分析物浓度减半(从50至25nm)会使杂交时间从9增加至12分钟。关于两种浓度的匹配序列，在th下abs620/520比率的相对较大的值(0.4)表明传感器的良好性能。分析物浓度进一步降低至5nm对th具有极少影响，但在th下abs620/520＝0.18的较小值表明在这一实施例的特定条件下性能不佳。因此，所述等离子体传感器能够在不足15分钟内在25nm的分析物浓度下区别单碱基多态性。
为了进一步改进匹配序列的检测极限，我们评估了改变盐浓度的性能。制备两种类型的与1triplex和2triplex结合的aunp并且用作储备溶液。所述两种互补粒子在含有10mmpbs(ph7.4)的缓冲液中与50nm的匹配和错配序列混合。我们使用三种不同浓度的nacl(即0.2、0.3和0.4m)产生总计6项实验。随着nacl浓度的增加，杂交时间减少。高浓度的nacl(0.4m)确实使th(6分钟)缩短，但所述传感器的特异性受到影响，因为错配序列的杂交变得显著。注意，我们想在最短可能杂交时间下保持匹配与错配之间的最大可能差异。因此，发现在这一特定实施例的条件下盐浓度的上限为0.3m。
结论和前景：
所述等离子体传感器能够在不足15分钟内在25nm或更高浓度下区别单碱基突变。
发现检测实验中的最佳盐浓度为大约0.2m。
发现检测试验中的最佳粒子浓度[np]为1.5nm。
预期使用所述夹心系统进一步评估较长ssdna分子(100和250聚体)的检测。
预期使用具有较大吸收系数的粒子(纳米棒)，其允许就传感时间(杂交时间)和灵敏性(检测极限)来说改进性能。
实施例6-信号纳米粒子合成和官能化。
根据turkevich方法(turkevich等人,discussfaradaysoc,1951,第11卷,第55–75页)合成金信号纳米粒子，并且用硫醇封端的聚氧乙烯壬基苯基醚(igesh)官能化。这种分子为两性分子并且使纳米粒子针对凝聚稳定。
这些信号np可干燥并且在水中再溶解而无显著凝聚。图8示出硫醇封端的聚氧乙烯壬基苯基醚(igesh)的化学结构、igesh官能化的信号纳米粒子的可逆干燥/水合过程的示意图、和在干燥之前和在干燥之后igesh官能化的信号纳米粒子在水中的uv-vis光谱(参见mao等人,anal.chem.,2009,第81卷,第1660-1668页)。
所述金纳米粒子可用在一个末端处用硫醇基团修饰并且在另一末端处用生物素分子修饰的直链聚(乙二醇)构成的第二配体官能化(参见li等人,jphyschemb.,2006,第110(32)卷,第15755-15762页)。因此，所述硫醇基团将强烈地结合于金表面，使得能够发生双重配体官能化。所述生物素分子将用于固定于保持条上，所述保持条将用抗生蛋白链菌素官能化。为了稳定化所述纳米粒子并且避免非特异性相互作用，需要两种配体igesh和生物素的适当比率。
实施例7-将信号纳米粒子装载于信号贮器中并且合成温敏性聚合物膜。
选择大孔硅衬底用作信号贮器；这些衬底通过电化学蚀刻p型硅晶片而制造。图9示出具有所指示的微柱的近似尺寸的大孔硅衬底的扫描电子显微术(sem)图像。这些空心微柱具有大约8μm3的体积(r＝0.5μm，h＝10μm)。
将信号纳米粒子装载于来自上文的衬底微柱中，以形成信号贮器。图10示出呈多种放大率的装载有信号纳米粒子的贮器衬底的sem图像；金信号纳米粒子作为白色区域观察到。
所述硅衬底经过氧化在表面上具有sio2。因此有可能用带正电的聚合物包裹表面。使用逐层方法由聚(苯乙烯磺酸盐)(pss)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pdadmac)的交替层开发温敏性膜。这些聚合电解质由于静电相互作用自组装并且已知如果所述膜中层的数目是奇数，那么归因于层间的排斥导致无补偿电荷，在高于60℃下膨胀并且破裂。
图11a示出通过去除牺牲衬底将膜逐层转移至大孔硅衬底上的示意图。首先，用膜1(pei(pss/pah)10pss)涂布所述硅衬底，而膜2(pei(pss/pdadmac)12)形成于聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)的牺牲衬底上。两个膜接着通过静电相互作用和压力进行附接。最后，通过用有机溶剂(ch2cl2)溶解或通过以机械方式使牺牲衬底脱落来去除所述牺牲衬底。
图11b示出在三个步骤膜1的沉积、膜2的粘着、和pmma衬底的去除期间拍摄的sem图像。以这种方式产生的膜可简单地通过控制层的数目和聚合电解质溶液的离子强度等而以不同厚度形成。由这些图像测量的膜的厚度为大约60-100nm。
实施例8-验证通过照射使聚合物崩溃。
为了测试所述膜对热/光的反应性，使信号纳米粒子沉积于大孔si衬底的腔中并且用掺杂有金纳米棒的(pss/pdadmac)12膜覆盖所述腔。
其接着用980nm激光(0.3w/cm2)照明，导致在所述膜中形成孔。图12示出在激光照明之前和在激光照明之后掺杂有金纳米棒的(pss/pdadmac)12膜，其中清楚可见照射诱导的膜破裂。同样，图13示出孔内积聚有信号纳米粒子并且表面上有温敏性膜2的si衬底的sem图像。在激光照明之后可见所述膜的破裂(d和e)。
实施例9-检测探针和snp辨别
用egfr序列使aunp官能化
在这一研究中，我们集中于与nsclc有关的egfr突变。为了检测突变型分析物标靶，用相应硫醇封端的ssdna(捕捉探针)使具有63nm直径的aunp官能化。制备两个批次的aunp；用包含以下序列的mut和wt捕捉探针稳定化：
egfr捕捉探针5’(wt)：5’-aaaatctgtg10t-sh-3’(seqidno:8)
egfr捕捉探针3’(mut)：5’-sh-10tgtttggcccgccc-3’(seqidno:9)
为了增加所述捕捉探针对标靶的亲和力，我们在mut捕捉探针的3个碱基中引入2’-ome修饰。用wt和mut捕捉探针稳定化的aunp在延长时期内在缓冲溶液中胶体稳定(结果未示)。
灵敏性和选择性研究-23碱基分析物
具有23个碱基的长度的分析物序列用于所述分析：
匹配23碱基：5’-cacagattttgggcgggccaaac-3’(seqidno:10)
错配23碱基：5’-cacagattttgggctggccaaac-3’(seqidno:11)
所述分析的灵敏性和选择性使用匹配和错配针对单碱基突变执行。在uv微量比色槽中，两种类型的np在pbs中与额外0.2mnacl混合。[au0]的浓度在所有实验中均为0.1mm。接着，分析物的等分试样添加至溶液中。在粒子的聚集之后进行uv-vis光谱法。聚集程度是计算为在620和538nm下的吸光度比率。针对分析物序列的浓度范围在50与0.05nm之间。
尽管我们可能检测所述匹配和错配直至50pm，在所述匹配与错配之间未观察到选择性。
为了确认uv-vis结果，还进行动态光散射测量以了解聚集物的大小。
关于mutaunp和wtaunp，初始np的大小分别为86.3和72.9nm。在30分钟聚集之后，关于所述匹配和错配序列，凝聚物的大小大约为250nm。
灵敏性和选择性研究-70碱基和140碱基分析物
与上述研究平行，我们检查针对70碱基dna长序列的检测的分析性能。
匹配70碱基：5’-ggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaagagaaa-3’(seqidno:12)
错配70碱基：5’-ggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaa-3’(seqidno:13)
标准方法
wtaunp和mutaunp在uv微量比色槽中与pbs和nacl混合。最后，2.5μl[分析物]＝1μm溶液添加至所述混合物中，以达到5nm的浓度。所述杂交过程之后为uv-vis光谱法。
所述分析不能检测长序列。我们推测所述杂交过程由于匹配和错配序列的二级结构受到抑制。
预孵育方法
为了检查匹配和错配的二级结构是否抑制粒子聚集，我们接着以促进所述长序列与dna-aunp探针在添加第二批次的纳米粒子之前杂交的方式再设计所述分析。此时，所述70碱基分析物在艾本德(eppendorf)中滚动时用一种类型的aunp探针预孵育(5nm)。在一小时孵育后，添加另一类型的aunp并且再次留在所述辊混合器中。通过uv-vis光谱法研究所述杂交过程。为了确认在混合条件下的粒子稳定性，进行无分析物的对照实验。在3小时孵育后，肉眼清楚可见在匹配、错配与对照实验之间的颜色差异。
为了通过uv-vis进一步确认我们的观察结果，执行dls测量以评估在所述杂交过程期间聚集物的大小。
测定在不同实验步骤中所述聚集物的平均直径。发现仅在匹配序列存在下，聚集物的大小随时间增加。然而，关于所述错配，在3h时观察到略微增加；并且在对照实验中，观察到粒子在整个实验时间内保持稳定。
我们进一步检查是否有可能使用预孵育方法检测较低浓度(0.1nm)的70碱基分析物。实际上，所述检测是可能的并且在匹配与错配之间的选择性是明显的。然而，随着分析物的浓度降低，检测时间增加。
下一步骤是检测甚至更长的dna序列。使用所述预孵育方法进行使用140个碱基的分析物序列的实验。分析物的浓度为5nm。
我们观察到在2小时预孵育后，在匹配与错配序列之间存在明显差异。虽然在匹配存在下，所述np完全聚集，但在错配存在下，所述np保持稳定。
dsdna23碱基检测-热变性
研究dsdna的热变性和ssdna的检测。在热处理之前，使用dsdna作为分析物执行动力学研究。观察到聚集程度的略微增加。接着，在恒温浴(thermobath)中，溶液加热持续5min至70℃。其后，通过uv-vis记录杂交过程并且计算聚集程度。
聚集程度在热变性之后增加，但其并未与ssdna检测的情况下同样高。发现dna再杂交过程与使用捕捉探针的杂交竞争。
dsdna23碱基检测-阻断探针
进行进一步工作以检测其中ssdna序列之一携带突变的dsdna中的单碱基突变。因此，通过遵循pcr概念，有必要使dsdna解杂交并且接着通过使用与无突变ssdna(反义分析物)互补的短ssdna序列(阻断探针)抑制再天然化。注意在这种情景中，阻断探针序列也与锚定于纳米粒子的表面的捕捉探针(wt和mut)互补。选择以下阻断探针序列，指定为bp1和bp2：
bp1：5’gcgggccaaac-3’(seqidno:14)
bp2：5’cacagattttgg-3’(seqidno:15)
首先，我们确认aunp在dsdna(分析物＝＝抗分析物)存在下保持稳定并且在ssdna(分析物-匹配或错配)存在下聚集。接着，我们测试阻断探针序列抑制dsdna(分析物＝＝抗分析物)形成的能力。所述抗分析物序列用bp1或bp2，以及用两者的混合物孵育。接着，添加与抗分析物互补的分析物序列。在15min孵育时期后，添加wtaunp和mutaunp并且在杂交动力学之后为uv-vis。阻断探针、抗分析物和分析物的浓度为5nm。
我们预期观察到分析物使阻断探针位移并且形成dsdna，其又将抑制粒子聚集。然而，结果显示事实并非如此。bp1和bp2的混合物可有效地阻断抗分析物，从而允许分析物聚集物wtaunp和mutaunp。有趣的是，关于匹配和错配两者，bp2比bp1更有效地阻断抗分析物。
结果显示阻断探针强烈地结合于抗分析物并且分析物的后续添加不会使阻断探针位移。为了调查添加至含有阻断探针和分析物(非互补)的混合物中的抗分析物将更快结合于短阻断探针抑或长分析物，关于匹配和错配序列执行实验，其中阻断探针、抗分析物和分析物的浓度为5nm。
以这种竞争性方式进行所述实验，在匹配与错配之间观察到聚集程度的略微差异。发现最佳阻断策略是使用短寡核苷酸。发现bp2的阻断能力优于bp1。
接着，调查在热处理下添加阻断探针至dsdna中以了解一旦温度降低，阻断探针是否可抑制dsdna形成。首先，我们通过使分析物(匹配和错配)与所述抗分析物混合而形成dsdna。接着，我们添加pbs/nacl中的阻断探针。溶液在恒温浴中加热至65℃。在10min加热后，这一溶液与aunp混合，随后为uv-vis记录。我们观察到在bp存在和不存在下粒子的聚集关于匹配和错配序列极其相似。
阻断探针滴定
如上文所观察，阻断探针可阻断dsdna的形成，从而促进突变的检测。根据这一观察结果，可推论出阻断探针可在较高浓度下甚至更佳地表现。然而，我们观察到阻断探针在分析物序列不存在下诱导金纳米粒子的聚集。不希望受任何特定理论束缚，本发明人相信当结合于纳米粒子的表面上的捕捉探针时，所述阻断探针可降低纳米粒子之间的静电/空间排斥，由此促进非特异性聚集。据估计，纳米粒子(wr或mut)的表面上的寡核苷酸的浓度为20nm，其对应于每个纳米粒子1500个ssdna。因此选择阻断探针的浓度范围，其跨越1至100nm，以便调查低于、等于和高于捕捉探针的浓度的bp浓度。
我们观察到随着阻断探针的浓度增加，纳米粒子的胶体稳定性降低。有趣的是，在20nm的阻断探针下，我们观察到对应于粒子表面上捕捉探针的总浓度的拐点。在甚至更高浓度的阻断探针下，非特异性聚集占优势。因此，在这些条件下选择高达5nm的阻断探针浓度作为最佳。
由阻断探针诱导的选择性
最后，我们研究了阻断探针的浓度对所述分析针对单碱基突变的选择性的影响。用捕捉探针涂布的aunp与在0.5与5nm之间浓度范围内的阻断探针序列杂交。
阻断探针的存在改进了所述分析针对单碱基突变检测的选择性。我们观察到随着bp浓度增加直至3nm，所述选择性改进，但bp的进一步增加导致较弱特异性。3nm的最佳浓度对应于每个捕捉探针约6个阻断探针。根据其中使用阻断探针的本发明，阻断探针与捕捉探针的比率在一些情况下可在范围2-10内，例如大约5-7，具体说来大约6。
实施例10-其它标靶和探针序列
用于突变型braf的检测的示例性探针描述于实施例1中。可根据本发明用作标靶分析物的基因序列的其它实例包括癌症相关基因egfr(ncbi基因id：1956)和brca1(ncbi基因id：672)。具体说来，探针可用于egfr突变体l858r或t790m的检测。下文显示egfrl858r检测探针的实例(seqidno：16-22)：
egfrl858r140聚体wt(mm)
5′-ggt-gaa-aac-acc-gca-gca-tgt-caa-gat-cac-aga-ttt-tgg-gct-ggc-caa-act-gct-ggg-tgc-gga-aga-gaa-aga-ata-cca-tgc-aga-agg-agg-caa-agt-gcc-tat-caa-gtg-gat-ggc-att-gga-atc-aat-ttt-aca-cag-aat-ct-3′
egfrl858r140聚体mut(m)
5′-ggt-gaa-aac-acc-gca-gca-tgt-caa-gat-cac-aga-ttt-tgg-gcg-ggc-caa-act-gct-ggg-tgc-gga-aga-gaa-aga-ata-cca-tgc-aga-agg-agg-caa-agt-gcc-tat-caa-gtg-gat-ggc-att-gga-atc-aat-ttt-aca-cag-aat-ct-3′
egfrl858r70聚体wt(mm)
5＇-ggt-gaa-aac-acc-gca-gca-tgt-caa-gat-cac-aga-ttt-tgg-gct-ggc-caa-act-gct-ggg-tgc-gga-aga-gaa-a-3＇
egfrl858r70聚体mut(m)
5＇-ggt-gaa-aac-acc-gca-gca-tgt-caa-gat-cac-aga-ttt-tgg-gcg-ggc-caa-act-gct-ggg-tgc-gga-aga-gaa-a-3＇
egfrl858r23聚体wt(mm)
5＇-cac-aga-ttt-tgg-gct-ggc-caa-ac-3′
egfrl858r23聚体mut(m)egfrl858r23聚体抗mut(抗m)
5′-cac-aga-ttt-tgg-gcg-ggc-caa-ac-3′5′-gtt-tgg-ccc-gcc-caa-aat-ctg-tg-3′
如图14所示，70碱基和140碱基egfr探针均能够在1小时内实现突变体-分析物特异性纳米粒子凝聚(如通过abs620/abs538比率所分析)。这提供了实际优势的进一步证明，因为dna序列长度反映了血浆dna(例如，循环肿瘤dna)的150-165个核苷酸的平均长度—参见underhill等人,plosgenet.,2016,12(7):e1006162(其内容以引用的方式明确并入本文中)。此外，所观察到的分析物特异性凝聚证明了通过热诱导的变性检测双链dna样品的可行性(参见图15)。
在某些情况下，所述检测探针可如sanromán-iglesias等人,acssens.,2016,第1卷,第1110-1116页(其内容以引用的方式整体并入本文中)中所公开。这些检测探针检测brca1基因中的snp，其为发展乳癌和卵巢癌的风险增加的重要指示剂(seqidno:23-26)：
实施例11-样品制备单元(spu)
在所述spu中装载全血，接着通过微沟槽系统分离成血浆。血浆与纳米粒子-探针(np-探针)混合，接着以热学方式分离成单链(ss)dna以便有效结合于探针序列。所述spu包括以下组件：样品装载器件、simbas血浆纯化系统、加热元件和纳米粒子-探针贮器。
样品装载器件
为了启动所述器件，患者用拇指或手指按压在凸起的泡壳隆起样品区域上。所述样品区域含有从主器件甲板突出1.6mm的空心针并且按压它会以类似于由糖尿病患者针对葡萄糖测试通常所用的穿孔器件的方式刺破手指。通过遮掩所述器件内的样品针，我们可最小化带给患者的痛苦，降低意外针刺损伤并且降低保健工人的污染担心。
所述器件在负压下进行包装，所得部分真空帮助促进血液抽取至所述器件中，引起200-300μl的样品体积，而不会使患者经历显著不适或看见血样本身。
simbas血浆纯化系统
血样进入微沟槽系统，其中使用自供电的集成微流体血液分析系统(simbas)系统去除红血球以形成血浆(参见上文实施例3)。这一系统比目前基于膜的血液分离技术更有效并且具成本有效性(参见图3)。
加热元件
加热血浆，因为dna为双链(dsdna)并且因此在结合探针处并非太有效。热量使所述dsdna变性以形成单链(ss)dna，过程与pcr中所发生相同。也类似于pcr，含有所关注的突变型序列的ssdna优先结合于过量的附接至np的短互补序列特异性探针。
使用包埋于所述微通道内的简单薄膜加热元件进行加热。薄膜加热元件比整体加热快速并且有效得多(8℃s-1比较1-3℃s-1)并且可通过纽扣电池在所述器件上容易地供电。
尽管使用急骤加热来最小化蛋白变性(其具有比dna变性慢的动力学)的可能性，一些蛋白变性有可能发生，导致增加的血浆粘度。我们已示出，这一现象可主要通过在cibacron蓝存在下稀释血浆达50％来克服，所述cibacron蓝为可在simbas模块后吸收至微流体通道上的蛋白吸收染料。我们已示出，cibacron蓝处理不会抑制或去除血浆中的dna。
np-探针贮器
所得血浆(100-150μl)进入微流体通道，其中它与预装载的金探针纳米粒子混合。我们已针对核酸探针区别单核苷酸突变型和野生型序列的能力优化了所述核酸探针的序列设计，如通过表面等离子体共振研究(spr)使用biacore3000机器所证明(参见图1)。
dna探针经由硫醇键联附接至金np并且包括c18间隔基分子以避免所述探针非特异性结合于金表面。各np-探针含有200-300个探针。
存在两种不同类型的探针序列(和np-探针)，一种与正常(或野生型)序列互补，并且另一种与含有欲检测的突变的下游(或上游)序列互补(图6c)。患者ssdna(分析物)在使np桥接在一起的两种探针之间形成桥以形成凝聚物。np之间的距离可通过修改所述探针的设计来控制。
尽管wt序列dna也可结合于上游探针，其无法结合突变型探针并且因此不会形成凝聚物(比较图6a和6b)。我们已证明了这一系统区别wt和单核苷酸突变的能力直至10.8fmol的浓度(参见sanromán-iglesias等人,acssens.,2016,第1卷,第1110-1116页)。
为了进一步优化分析物诱导的纳米粒子-探针凝聚，可使用防垢溶液来减轻血浆蛋白诱导的对凝聚的阻断。来自全血和/或血浆的蛋白可涂布检测纳米粒子，从而倾向于抑制分析物结合于纳米粒子-探针和后续凝聚。防垢溶液的一个实例为
实施例12-信号放大区
作为基于信号纳米粒子从微孔释放的信号放大(其描述于以上实施例7和8中)的替代，本发明人尝试通过使用基于温敏性微球的信号贮器实现信号释放的更大效率。具体说来，使用微球解决了在涂布微孔开口的温敏性膜崩溃后信号纳米粒子从微孔释放的问题。本发明人已发现在某些条件下，信号纳米粒子从微孔释放是已装载至微孔中的总体的<5％。相比之下，据估计在热诱导的微球壳的破坏后信号手段从温敏性微球释放是已装载至微球中的总体的>80％：
发现用信号纳米粒子包装的海藻酸盐/琼脂糖珠粒与基于聚合电解质的微球、具体说来phh/pss双层相比显著更易漏。因此，选择后者作为信号贮器针对信号手段的最佳选择。
所述信号放大区的示意图描绘于图16中。检测纳米粒子凝聚物沿所述器件内的微通道流动直至其遇到所述放大区中的温敏性微球(在图16中左侧示出)。
所述温敏性微球(约10μm直径)邻近大得多的硅石珠粒(约100μm直径)包装于微流体通道的保持腔内(硅石珠粒在图16中右侧示出)。这种类似于色谱法中发现的布置的布置确保了流动继续通过所述器件而无妨碍，同时使检测纳米粒子凝聚物与所保持的完整的温敏性微球紧密接近。
所述凝聚物由在共振波长(即，633nm)下递送光的器件内置红色激光二极管供给能量。所述激光二极管(1mw市面上有售)由与薄膜加热器相同的纽扣电池供电。
由凝聚的金纳米粒子吸收在633nm下的激光会导致呈等离子体共振的局部能量发射。这些纳米加热器可使温度充分升高超过40-50℃，引起温敏性微球的崩解。
尽管自由浮动的探针纳米粒子也可吸收光，这一能量低于由凝聚的纳米粒子吸收的能量的1％。其它组分具有极少吸收，如微流体器件的塑料或血浆本身或污染血液，其关于hb和hbo2分别在434nm和414nm下具有最大吸收。
所述温敏性微球由5个双层pss/pah使用封装约109个信号分子(例如，抗生蛋白链菌素)的分子的胶束共沉淀caco3构成。这一布置导致信号的大量放大。
由受到破坏的微球(和非凝聚的探针-np)释放的信号分子行进通过所述硅石珠粒朝向测试信号区。
已测试的装载信号的微球的实例包括：装载有酶辣根过氧化物酶(hrp)的pss/pah双层微胶囊和装载有葡聚糖-fitc的pss/pah双层微胶囊。激光诱导的信号负载的释放已得到证明(结果未示)。此外，已通过电子显微术目测了在微胶囊的表面处存在凝聚的纳米粒子。
微胶囊产生和包装于微通道中
温敏性微球基本上如ambrosone等人,acsnano,2016,第10(4)卷,第4828-4834页(参见补充材料s2)(其完整内容以引用的方式明确并入本文中)中所述而产生。
聚(4-苯乙烯磺酸钠)(pss，mw≈70kda，#243051)、聚(盐酸烯丙胺)(pah，mw≈56kda，#283223)、二水合氯化钙(cacl2，#223506)、碳酸钠(na2co3，#s7795)、和聚(苯乙烯)-嵌段-聚(丙烯酸)(pss-b-paa，mn≈8700，#735892)购自sigma-aldrich。
pss/pahcaco3微球(直径5–10μm)装载作为信号手段的hrp、葡聚糖-fitc或抗生蛋白链菌素。多层聚合电解质壳(例如，5-8个pss和pah的交替层)可在最外层上提供正电荷或负电荷。
保持腔设计
微流体保持腔解决了如何使所有组分集合(即，凝聚物和微球)同时保持流动通过器件的问题。所述保持腔包括用较大的硅石/玻璃珠粒(约50-100μm)包装的微通道，这些珠粒又保持完整微球(约5-10μm)并且流动使所述凝聚物到达微球，同时允许自由浮动的np连同从受到破坏的微球释放的信号分子一起继续通过器件。
调查包装于环烯烃聚合物(cop)通道中的微球。使用直径75μm的玻璃珠粒来阻断所述微通道，由此使所述微球(5-10μm)保持在适当位置(参见图18a)。使用以负性最外层终止的8层微球，所述微球在至少3个月内稳定(不泄露装载葡聚糖-fitc的信号)并且保持在适当位置。还测试用于堵塞cop通道的替代溶液：直径150μm的琼脂糖珠粒。
激光诱导的葡聚糖-fitc信号从微球释放描绘于图18b中。
实施例13-测试信号区
在信号手段从信号贮器(例如，微球)释放后，信号手段流动至测试信号区(例如，硝基纤维素条)，其中信号手段借助于具体结合相互作用被捕捉于保持条上，由此产生可见的线。所述测试信号区可使用如市面上有售的侧向流测试试剂盒(例如，怀孕测试试剂盒)中所用的标准组分。在一个实施例中，所述信号手段可包含抗生蛋白链菌素并且所述保持条可包含生物素。
实施例14-集成器件和诊断应用
在一些实施方案中，本发明提供一种集成器件，其包括独立、但在功能上连接的模块：
1.样品制备单元(spu)。将全血装载至所述spu上，其中它通过微沟槽系统分离成血浆。血浆与纳米粒子-探针(np-探针)混合，接着以热学方式分离成单链(ss)dna以便有效结合于探针序列。
2.放大区。突变型ssdna序列特异性结合于两种互补桥接dna探针导致其特异性凝聚。凝聚使所述np彼此紧密接近，并且当通过激光二极管供给能量时导致等离子体共振，从而将光能转化为局部热能。这种热能破坏了封装几千万个信号分子的温敏性微球，所述几千万个信号分子对应于信号的大量放大。
3.测试信号。所释放的信号分子沿硝基纤维素条行进直至由测试条捕捉，导致可见的线。
所述集成器件的示意图描绘于图19中。所述器件为杂合微流体-侧向流器件，所述微流体区段由所述spu组成并且由于所述器件被封装于负压下，所述放大区由脱气流经由具体设计的微泵供电。侧向流测试信号区通过经由贮器布置离开所述微流体区段的液体的毛细管力供电。纽扣电池对器件内置激光二极管和加热元件供电。所述spu含有可互换的np-探针模块，其允许在标准化测试外壳内测试不同的生物标记物序列以最小化制造成本。
例如nsclc患者中egfr突变的检测指示了其对如吉非替尼、埃罗替尼、布加替尼和拉帕替尼的酪氨酸激酶抑制剂(tki)的反应。主要突变是存在于高达90％的egfr突变型nsclc病例中的l858r突变，和存在于约40％的病例中的外显子19缺失。两种突变均可由本发明的器件检测。目前得到许可用于egfr突变测试的伴随诊断技术是基于pcr并且依赖于侵入性获得的生检，其对于患者和临床医师便利性来说是次最佳的。
在nsclc的情况下，最新esmo指导方针推荐了监测t790m突变的出现作为对基于tki的疗法出现抗性并且随之转换为第二线疗法(奥斯替尼)的指示剂。目前关于nsclc患者的随访程序需要医院就诊和使用如ct扫描的成像技术。本发明的器件提供了可在局部保健中心设置中实现的较简单替代。
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本文中所引用的所有参考文献均以引用的方式并且出于所有目的整体并入，其并入程度就如同各个别公布或专利或专利申请具体地并且个别地被指示以引用的方式整体并入一般。
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