一种人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒，及其检测方法。

背景技术：

遗传性果糖不耐受症(Hereditary Fructose Intolerance，简称HFI)是为果糖代谢病的一种，为常染色体隐性遗传病，是由于醛缩酶B基因(ALDOB基因)突变致B型醛缩酶缺乏或活性降低，从而导致患者出现果糖代谢的异常。

目前检测人果糖二磷酸醛缩酶B基因的主要技术为基因测序，存在低通量、操作复杂、耗时长等缺点。

荧光定量PCR技术是一项发展较为成熟的核酸检测方法。其优势在于：操作简便，因闭管操作可以减少污染，结果分析快捷。其中Taqman探针技术是一种通过检测聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，以下简称PCR)过程中产生的荧光信号来区分等位基因类型的基因检测技术。针对待检测的基因位点，设计一对Taqman探针及其对应上下游引物，所述探针对分别检测目标位点的两种等位基因。每条探针的5'端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。在PCR扩增过程中，利用Taq酶5’端核酸酶活性降解因与目标序列完全互补而结合在单链上的探针，令荧光基团与淬灭基团分离从而产生荧光。若探针与目标序列存在错配，则不能与单链结合，亦不会产生荧光。因此通过荧光定量PCR仪收集PCR扩增期间荧光信号的变化，可以判别检测样本的基因型。Taqman探针技术最突出的优点是不需要分离或洗脱等PCR后处理过程，简化操作流程并提高了检测速度。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种高准确性、低成本、高通量、快速的检测试剂盒，可用于检测人果糖二磷酸醛缩酶B基因是否存在突变。

本发明所采取的技术方案是：

一种人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒，所述检测试剂盒包括特异识别人果糖二磷酸醛缩酶B基因上多态性位点A150P、A175D和N335K的野生型探针和突变型探针，对应3个多态性位点的野生型探针和突变型探针如下表所示：

表1、各个多态性位点的探针序列

W代表野生型特异探针，M代表突变型特异探针。

优选地，每条探针的5’和3’端都分别标记有荧光报告基团和淬灭基团。所述荧光报告基团可以是FAM、TET、HEX、NED、TAMRA或ROX中的一种，所述淬灭基团可以是BHQ-1或BHQ-2。

进一步，所述试剂盒还包括用于扩增人果糖二磷酸醛缩酶B基因上3个多态性位点所对应的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，对应3个多态性位点的上游引物和下游引物如下表所示：

表2、各个多态性位点的引物序列

F代表上游引物，R代表下游引物。

本发明所述人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒还包括纯合子标准品和杂合子标准品。单个多态性位点具有3种分型，两种纯合子型以及一种杂合子型。针对一组体系，应用到两种纯合子标准品及一种杂合子标准品。所述纯合子标准品同时对应于3个多态性位点的纯合子型，杂合子标准品对应于3个多态性位点的杂合子型。标准品均由含多态性位点扩增片段的质粒组成。

一组体系的纯合子标准品由1种质粒构成，杂合子标准品由2种质粒构成。体系的野生型纯合子标准品1由含有A150P-G型、A175D-C型和N335K-C型的质粒组成，其对应的检测荧光报告基团分别为FAM、HEX及TAMRA，突变型纯合子标准品2由含有A150P-C型、A175D-A型和N335K-G型的质粒组成，其对应的检测荧光报告基团分别为NED、ROX及TET，杂合子标准品3由野生型纯合子标准品1和突变型纯合子标准品2的质粒混合组成，其检测荧光报告基团分别为FAM、NED、HEX、ROX、TAMRA及TET。所述野生型纯合子标准品1的质粒包含如下序列：

TCAGTGTTGTGATTAATGCTGATATGCTTGGCTGTTTTCAATCCTCAAGCACAGTGGATTGAAAGCTAAGCAAAGGGAGAACTCCTTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGCAGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGTGCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTCGCTACGCCAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTCTTCAGAGCTTTTCTTTTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTTTTCCCTCACCAGTATATCCTAGTGGCATTTTTCACAACTTTTGCTATAGCCAACTGTGGTAGGGAAAGATTTGGTAGAAGGGGATGGTATCCCCAGCAATATTCAGCAACATTGCTGTAAAAAGAAGAAAATCTGAGTGAAGGTTTGACTGGTTTCCCATGAGAGGCAGACAGGGTCAAGGTGGGGTCACATTTACTCTAACCAGTCTCCTCTCTCATATTTGTCTTCTAGGCTAACTGCCAGGCGGCCAAAGGACAGTATGTTCACACGGGTTCTTCTGGGGCTGCTTCCACCCAGTCGCTCTTCACAGCCTGCTATACCTACTAGGGTCCAATGCCCGCCAGCCTAGCTCCAGTGCTTCTAGTAGGAGGGCTGAAAGGGAGCAACTTTTCCTCCAATCCTGGAAATTCGACACAATTAGATTT(SEQ ID NO.13)。

所述突变型纯合子标准品序列：

TCAGTGTTGTGATTAATGCTGATATGCTTGGCTGTTTTCAATCCTCAAGCACAGTGGATTGAAAGCTAAGCAAAGGGAGAACTCCTTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGCAGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGTCCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTCGCTACGACAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTCTTCAGAGCTTTTCTTTTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTTTTCCCTCACCAGTATATCCTAGTGGCATTTTTCACAACTTTTGCTATAGCCAACTGTGGTAGGGAAAGATTTGGTAGAAGGGGATGGTATCCCCAGCAATATTCAGCAACATTGCTGTAAAAAGAAGAAAATCTGAGTGAAGGTTTGACTGGTTTCCCATGAGAGGCAGACAGGGTCAAGGTGGGGTCACATTTACTCTAACCAGTCTCCTCTCTCATATTTGTCTTCTAGGCTAAGTGCCAGGCGGCCAAAGGACAGTATGTTCACACGGGTTCTTCTGGGGCTGCTTCCACCCAGTCGCTCTTCACAGCCTGCTATACCTACTAGGGTCCAATGCCCGCCAGCCTAGCTCCAGTGCTTCTAGTAGGAGGGCTGAAAGGGAGCAACTTTTCCTCCAATCCTGGAAATTCGACACAATTAGATTT(SEQ ID NO.14)。

标准品中同种质粒的拷贝数一致。标准品的制备可以根据NCBI上公开的人果糖二磷酸醛缩酶B基因序列采用常规的T-A克隆方法制备得到。

进一步，样品的检测通过六重荧光定量PCR实现，同一组中的6个探针用不同荧光色进行标记。所述探针的荧光基团选自FAM、TET、HEX、NED、TAMRA及ROX。FAM、NED探针用于检测多态性位点A150P，HEX、ROX探针用于检测多态性位点A175D,TAMRA、TET探针用于检测多态性位点N335K。

所述的人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒还包括PCR缓冲液、热启动HS-Taq酶、超纯水，纯合子标准品和杂合子标准品。

本发明还提供了使用上述人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒的检测方法，包括对样本中人果糖二磷酸醛缩酶B基因的3个多态性位点的扩增采用六重荧光定量PCR反应，采用荧光定量PCR仪对反应过程中的荧光信号进行收集，使用SDS软件对实验数据进行分析，与标准品对比获得基因分型结果。

其中，六重荧光定量PCR反应的扩增程序为：初始变性，95℃保持10分钟；热循环40次，每次先95℃保持15秒，随后60℃保持1分钟；循环完毕后16℃保温。

本发明的有益效果是：

(1)基于聚合酶链式反应，提高了多态性位点检测的模板量，大大降低假阳性；

(2)Taqman探针通过配备不同的荧光报告基团，在一次六重荧光定量PCR下最多可以检测3个位点的基因分型，具有高效节约的特点；

(3)六重荧光定量PCR反应在2个小时内完成，Taqman探针特异性高，此检测方法具有用时少，快速和准确度高的特点；

(4)闭管检测，减少人为及环境污染，提高准确性。

(5)操作及结果判定简单：整个PCR扩增过程可以通过电脑软件进行实时检测,能够随时掌握PCR扩增情况；PCR扩增结果在电脑上直接显示,无需电泳、染色等步骤,避免了使用有毒试剂和肉眼判断结果的主观性。

附图说明

图1是试剂盒中纯合子标准品1的检测图谱，十字(FAM)代表A150P野生型、正方形(HEX)代表A175D野生型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型；

图2是试剂盒中纯合子标准品2的检测图谱，菱形(NED)代表A150P突变型、叉号(ROX)代表A175D突变型、圆形(TET)代表N335K突变型；

图3是试剂盒中杂合子标准品3的检测图谱,十字(FAM)代表A150P野生型、菱形(NED)代表A150P突变型、正方形(HEX)代表A175D野生型、叉号(ROX)代表A175D突变型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型、圆形(TET)代表N335K突变型；

图4是实施例1的检测图谱，十字(FAM)代表A150P野生型、正方形(HEX)代表A175D野生型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型，说明检测样本为野生型纯合子；

图5是实施例2的检测图谱，十字(FAM)代表A150P野生型、菱形(NED)代表A150P突变型、正方形(HEX)代表A175D野生型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型；

图6是实施例3的检测图谱，十字(FAM)代表A150P野生型、正方形(HEX)代表A175D野生型、叉号(ROX)代表A175D突变型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型；

图7是实施例4的检测图谱，不同形状标记的曲线代表不同荧光基团及对应基因位点的多态性：菱形(NED)代表A150P突变型、正方形(HEX)代表A175D野生型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒的组成和使用方法

所述检测试剂盒包括的用于特异性识别人果糖二磷酸醛缩酶B基因检上3个多态性位点的Taqman探针及用于扩增多态性位点所在基因片段所对应的引物对，具体为如下表所示：

表3、检测试剂盒的组成

所述人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒的使用方法：

1、样本DNA的提取

根据样本的实际情况，选择合适的方法提取样本DNA，常见的方法有磁珠法、阴离子交换树脂法和碱裂解法等等；

2、荧光定量PCR反应

荧光定量PCR反应的扩增体系如下：

表4、荧光定量PCR反应体系

荧光定量PCR反应的扩增程序如下：

表5、荧光定量PCR扩增程序

3、软件分析获得结果

使用软件SDS2.4对结果数据进行分析。

实施例2：标准图谱的建立：

按实施例1的使用方法，对人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒内的纯合子标准品和杂合子标准品进行检测，获得如图1和2所示的纯合子标准品的检测图谱以及如图3所示的杂合子标准品的检测图谱。

实施例3：一号样品检测

按实施例1的使用方法，对一号样本进行检测，获得如图4所示的图谱，可知一号样本为纯合野生型。

实施例4：二号样品检测

按实施例1的使用方法，对二号样本的检测结果如图5所示，可知二号样本在目的基因位点A150P存在突变。

实施例5：三号样本检测

按实施例1的使用方法，对三号样本的检测结果如图6所示，可知三号样本在目的基因位点A175D存在突变。

实施例6：四号样本检测

按实施例1的使用方法，对四号样本的检测结果如图7所示，可知四号样本在目的基因位点A150P存在突变。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东华美众源生物科技有限公司

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