与原发性胆汁性胆管炎关联的白细胞介素16及其应用的制作方法

本发明属于免疫学领域，具体涉及与原发性胆汁性胆管炎关联的白细胞介素16(IL-16)及其应用。

背景技术：

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)，旧称原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)，是一种累及肝内胆管系统的慢性进展性自身免疫性疾病，主要表现为肝内小胆管进行性破坏伴门脉炎症性改变，最终导致纤维化及肝硬化。本病主要发生于中年以上女性，男性病例仅占10％。随着对PBC疾病认识的不断提高和诊断方法的建立，PBC的发病率和患病率在全球呈上升趋势。2003年，在上海地区对5011个健康体检者的(26-85岁)PBC特异性抗线粒体抗体(AMA)(PDC-E2)进行筛查，发现AMA阳性率高于0.16％，在中年女性中高于0.3％[5]。2006年，在广东地区对8126个成年人(18-83岁)的普查中发现AMA(PDC-E2)的阳性率高于0.05％，在中年女性中高于0.15％。最近在上海地区对19012个居民的AMA筛查结果发现0.40％的男性和0.94％的女性AMA阳性，其中25人(0.13％)患有PBC。随着我国人口老龄化的加剧，PBC在我国将迅速发展成一种较常见的疾病，在2025年可能达到20-30万患者，到2050年可能高达35-50万患者。

早期诊断和治疗是控制PBC疾病发展的最有效手段。目前对PBC的治疗缺少有效的办法，熊去氧胆酸是唯一对早期PBC患者(尤其是黄疸没有出现的患者)进行有效控制的药物，但无治愈作用，而挽救晚期PBC患者的唯一手段是实施肝脏移植。我国是病毒性肝炎高发的国家，PBC的临床症状与病毒性肝炎相似，PBC患者早期常被误诊为病毒性肝炎或药物性肝炎，严重影响了PBC患者的诊疗。因此，对PBC患者进行早期诊断和治疗，具有重要的社会意义。

PBC具有很强的遗传易感性，患者的第一代亲属的PBC发病率比一般人群高100倍。综合北美、欧洲和日本的报道，PBC的家族发病率为3.8-9％。2005年，一项在北美的大规模调查结果显示，PBC病人直系亲属发病的相对危险度(odds ratio)高达10.7。通过PBC患者的同卵双生子进行分析，发现其共同发病率达63％。我们团队在过去四年对国内PBC患者的调查中发现了3对同卵双生的PBC患者，三对患者的姐妹发病症状和发病时间都非常接近，结合国际已有数据，PBC患者的同卵双生子共同发病率高达72.7％。

自2009年以来，对白人PBC患者全基因组关联分析(GWAS)的一系列结果显示PBC具有很强的遗传易感性。以申请人为核心成员的北美PBC合作组采用GWAS和特定位点高密度基因多态性分析的方法，对北美PBC患者和对照人群进行队列分析，证实了PBC的遗传易感性与HLA-II类抗原、IL12A、IL12RB2、STAT4、IRF5、ch17q12-21、MMEL1和SPIB等位点密切相关，而且揭示了IL12信号传导通路和Toll-like受体(TLR)/TNF信号传导通路的异常可能导致PBC的发生。日本学者的小规模的GWAS研究也发现了TNFSF15位点与PBC密切相关。我国对PBC的遗传学研究已有一定的基础，国内的学者分别就HLA和CTLA4等基因位点与汉族PBC遗传易感性进行了初步研究。

我们启动并完成了对1122例汉族PBC样品的Illumina中华芯片扫描工作，结合4046例对照数据，进行了大规模的队列分析，在国际上首次发现并证实了IL-16的基因位点达到了GWAS显著性，并首次发现IL-16在PBC患者血液中异常高表达。

目前国际上尚无专利文献提及IL-16基因位点以及IL-16与PBC的关系。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了IL-16在制备检测或辅助检测、筛查或预测原发性胆汁性胆管炎的产品中的应用。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一系列与原发性胆汁性胆管炎显著相关的单核苷酸多态位点(SNP)，并找出其中与原发性胆汁性胆管炎易感性关联最显著的代表性位点，从而提供将所述的单核苷酸多态位点(SNP)用于评估原发性胆汁性胆管炎易感性的用途。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供了IL-16在制备PBC动物模型中的应用。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供了IL-16在制备PBC治疗药物方面的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：第一方面，提供了IL-16在制备检测或辅助检测、筛查或预测原发性胆汁性胆管炎的产品中的应用。我们启动并完成了对1122例汉族PBC样品的Illumina中华芯片扫描工作，结合4036例对照数据，进行了大规模的队列分析，在国际上首次发现并证实了IL-16的基因位点达到了GWAS显著性，并首次发现IL-16在PBC患者血液中异常高表达；具体通过全基因组关联分析，发现IL-16的基因多态性与PBC发病有密切关系；通过对PBC患者和正常人的血清学分析，发现IL-16在PBC患者中异常高表达。

第二方面提供了一系列与原发性胆汁性胆管炎易感性显著相关的IL-16的单核苷酸多态位点，通过对1122例中国汉族PBC患者样品和4036例正常人样品为研究对象，使用了HumanOmniZhongHua-8(v1.1)扫描进行全基因组关联数据分析，进行基因多态性(SNP)的分型，利用芯片得到的数据，采用PLINK软件对所有多态位点的对比分析，发现IL-16基因的多个SNP的频数在PBC和正常人群中有显著差异：与原发性胆汁性胆管炎易感性显著相关的IL-16的单核苷酸多态位点为：rs17875509，等位基因为G/C；rs11857713，等位基因为C/T；rs4778636，等位基因为G/A；rs11073001，等位基因为A/G；rs11630277，等位基因为T/C；rs56859031，等位基因为A/AGT；rs57763246，等位基因为C/T；rs17875523，等位基因为C/T；rs3898677，等位基因为T/C；rs139879640，等位基因为TCTCA/T；rs4577037，等位基因为T/G；rs3899547，等位基因为A/G；rs17875532，等位基因为C/T；rs17875533，等位基因为C/A；rs11556218，等位基因为T/G；rs1803275，等位基因为G/A；rs3926277，等位基因为C/A；rs3926278，等位基因为C/G；rs3926279，等位基因为A/G；rs17875542，等位基因为G/C；rs17875543，等位基因为C/T；rs7166271，等位基因为C/T；rs11325，等位基因为G/T；rs4778640，等位基因为A/G。

第三方面，本发明通过对IL16位点的SNP进行连锁不平衡分析，发现多个SNP与rs11556218的连锁关系。采用Sequenom的iPlex方法，针对其中最显著差异的rs11556218多态性位点进行验证试验；并使用Impute2和PLINK软件，逻辑回归原理进行，以性别为共变量，按叠加效应模型分析；同样发现有显著差异；表1中的所有SNP均为在PBC和对照间有显著差别的基因多态位点，可用于对PBC的风险预测。

第四方面，本发明通过对国际上已有基因表达分析数据库的分析发现，PBC关联位点多态性与IL-16在淋巴细胞，单核细胞中的表达有显著关联；使用PLINK软件，逻辑回归原理进行分析评估每个SNP位点与原发性胆汁性胆管炎的关系，计算危险等位基因的相对危险度(Odd ratio，OR)和95％的可信区间，得到这一系列SNP位点的危险等位基因分别是：rs17875509多态性位点为C；rs11857713多态性位点为T；rs4778636多态性位点为A；rs11073001多态性位点为G；rs11630277多态性位点为A；rs56859031多态性位点为AGT；rs57763246多态性位点为T；rs17875523多态性位点为T；rs3898677多态性位点为C；rs139879640多态性位点为T；rs4577037多态性位点为G；rs3899547多态性位点为G；rs17875532多态性位点为T；rs17875533多态性位点为A；rs11556218多态性位点为G；rs1803275多态性位点为A；rs3926277多态性位点为A；rs3926278多态性位点为G；rs3926279多态性位点为G；rs17875542多态性位点为C；rs17875543多态性位点为T；rs7166271多态性位点为T；rs11325多态性位点为T；rs4778640多态性位点为G。

第五方面，本发明通过对IL-16特异的定量酶联免疫检测法(ELISA)对120例PBC患者和120例正常人的血清IL-16的浓度进行测定，发现IL-16在PBC患者中显著升高(P<0.0001)。

第六方面，本发明建立的动物模型中引入慢性IL-16表达制备PBC动物模型，并将此模型用于PBC治疗药物的筛选。

有益效果：本发明具有如下的特色和优点：

1)本发明首次发现IL-16的多个基因多态性位点与PBC的发生显著相关，可用于PBC发病风险预测的指标之一。

2)本发明发现IL-16在PBC患者血液中表达异常升高，是可用于PBC靶向治疗的靶点。

3)发明的发现有可能通过在动物模型中引入慢性IL-16表达制备PBC动物模型，并将此模型用于PBC治疗药物的筛选。

附图说明

图1为实施例1中所确定的IL16基因区域单核苷酸多态性位点与PBC的关联图；图1中：横坐标“Position on chr”为染色体上的位置(单位Mb)；纵坐标为单核苷酸多态性位点与PBC的关联显著性P值(-log10(p-value))，右侧Recombination rate为重组率，单位(CM/Mb)；代表位点rs17875509以◆表示。

图2为实施例3中ELISA检测IL-16在PBC和正常对照人群(HC)血清中的表达差异(****为P<0.0001)；图2中：横坐标显示分为PBC和正常对照人群(HC)两组，纵坐标为检测出的血清IL-16的浓度，单位(pg/ml，皮克/毫升)。

具体实施方式

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。

本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：

主要实验材料和主要试剂：

1、原发性胆汁性胆管炎患者和正常对照人群的DNA样品和血清；

2、全基因组关联分析芯片分析试剂盒：由Illumina公司生产的HumanOmniZhongHua-8(v1.1)分析试剂盒包括芯片和试剂。

3、IL-16定量酶联免疫检测试剂盒：购自R&D Systems公司，Human IL-16Quantikine ELISA Kit，产品号D1600。

主要溶液配制：

1、磷酸缓冲液(PBS，1L)：8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，3.628g Na₂HPO₄·12H₂O，双蒸水定容至1L；

2、饱和氯化钠溶液(5M NaCl，1L)：292.5g NaCl，双蒸水溶解定容至1L；

3、1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)：30.3g Tris base溶于200ml双蒸水中，盐酸调节pH值至8.0，定容至250ml；

4、0.5M EDTA(PH 8.0)：36.5g EDTA溶于NaOH溶液中，调节pH至8.0，定容至250ml；

5、核裂解缓冲液(Nuclei Lysis Buffer，500ml)：40ml 5M NaCl，2ml 0.5M EDTA(PH 8.0)，5ml 1M Tris-HCl(pH 8.0)，453ml双蒸水；

6、蛋白酶K缓冲液(Proteinase K buffer，100ml)：50ml glycerol，100ul 1M Tris-HCl(pH 7.5)，200μl 1M CaCl₂，47ml双蒸水；

7、蛋白酶K(Proteinase K Solution，10mg/ml)：100mg蛋白酶K粉末溶于10ml蛋白酶K缓冲液中；

8、消化液(Nuclei-SDS-Proteinase K-Master Mix Lysis buffer，504ml)：420ml Nuclei Lysis Buffer，3.5ml Proteinase K(10mg/ml)，17.5ml 10％SDS，0.35ml 0.5M EDTA(PH 8.0)，62.65ml双蒸水；

9、TE缓冲液(PH 8.0)：1ml 1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，0.2ml 0.5M EDTA(PH 8.0)，双蒸水定容至100ml；

10、6×DNA点样缓冲液(10ml):88mg EDTA，5mg溴酚蓝，5mg二甲苯青，溶于4ml双蒸水中，再加入3.6ml甘油后使用NaOH调节至PH7.0，定容至10ml；

11、50×TAE缓冲液：242g Tris-base，57.1ml冰乙酸，200ml 0.5M EDTA(PH 8.0)，双蒸水定容至1L。

实施例1全基因组关联分析

本发明通过下述方法和步骤发现IL-16基因位点与原发性胆汁性胆管炎的关联。

一、方法

首先在中国汉族人群中选取了1122例中国汉族PBC患者样品和4036例正常人样品为研究对象，进行HumanOmniZhongHua-8(v1.1)扫描，进行基因多态性(SNP)的分型，采用PLINK软件对所有多态位点的对比分析，发现IL-16基因的多个SNP的频数在PBC和正常人群中有显著差异。

二、病例和对照样本入选标准

所有纳入研究的PBC患者均符合以下标准：1)、所有患者均为汉族；2)、AMA-M2血清学检测呈阳性；3)、生化指标显示胆汁淤积证据，主要表现为ALP，GGT升高；5)、各类肝炎病毒感染以及人类免疫缺陷病毒感染指标阴性(乙肝病毒表面抗原阴性、血清中乙肝病毒DNA小于200拷贝数/毫升、血清中丙肝病毒RNA小于500拷贝数/毫升、戊肝抗原阴性、人类免疫缺陷病毒抗体阴性)；6)、无血吸虫感染史；7)病人主诉饮酒量小于100ml/日。

全基因组扫描对照人群样品来自安徽，江苏，山东的正常体检人群，生化指标正常，无临床疾病表征，自述体健。病例是22～85岁之间筛选，平均年龄为54.7岁；对照为15岁到96岁之间筛选，平均年龄为34.8岁。

三、测试人群的基本特征

测试人群为芯片检测样本其基本特征如下：

表1

四、原发性胆汁性胆管炎(PBC)患者和正常对照人群的基因组DNA样品的制备

1、病人和正常人的非抗凝血由各医院采集在非抗凝血收集管中。将收集管离心，分离血清和血凝块。在超净工作台内将解冻的血样上层的血清用移液器轻轻混匀，均分装入4个1.5ml螺盖保存管，保存于-80℃。

2、用长柄勺取出分离胶，将血块倒入称量舟，用剪刀将血块充分剪碎，再用塑料吸管将碎血块转移至50ml离心管中。

3、用PBS缓冲液冲洗称量舟及采血管，回收清洗液至50ml离心管，用塑料吸管混匀液体，离心，2500rpm，15min，4℃，弃上清。

4、加5ml消化液，混匀，放入水浴恒温振荡器，50℃，200rpm，过夜消化。

5、消化完全后加1.5ml 5M NaCl，混匀；室温静置10min,期间颠倒混匀多次，离心，3800rpm，30min，室温。

6、转移上清于50ml离心管，加2倍体积无水乙醇，充分混匀。

7、用移液器将可见的絮状DNA沉淀转移至含有500μl 70％乙醇的2ml EP管进行清洗。

8、离心，13000rpm，5min，室温，弃上清；再离心，13000rpm，1min，室温，用移液器弃尽残液，晾干，用双蒸水溶解。

五、HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片扫描分型和全基因组关联数据分析

HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片购自ILLUMINA公司，分型按照产品方法要求进行。具体操作严格步骤按Illumina公司HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片的实验步骤进行，相关描述可同样见发表的文献[Adler,A.J.,Wiley,G.B.,Gaffney,P.M.Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications.J.Vis.Exp.(81),e50683,doi:10.3791/50683(2013).]。每个DNA样品采用200纳克(ng)，严格按照Illumina公司HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片的说明实验步骤进行处理。

HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片分型数据由ILLUMINA公司的BeadStudio软件处理并输出，关联数据分析按发表的文献同样进行[Zuo,X.et al.Whole-exome SNP array identifies 15new susceptibility loci for psoriasis.Nat Commun 6,6793，2015]。BeadStudio输出的分型数据采用PLINK分析，根据状态同一配对原理(pairwise identity-by-state)，排除重复样品和亲缘样品。采用smartpca软件，根据主成分分析原理(principal component analysis)，排除群体异质样品，共有1,122PBC病人和4,036正常对照的结果，用于统计分析。排除分型成功率低于98％的SNP，排除在分析样品中频率(minor allele frequency，MAF)低于0.01的SNP，排除在正常对照样品中Hardy–Weinberg equilibrium值P<1×10^-4的SNP。经过排除，共有776,516个常染色体的SNP用于比较。采用PLINK软件，SNP相关分析采用线性回归的原理，以性别为共变量(covariate)，采用加性效应原理(additive allelic effect)，评估每个SNP位点与PBC关联的显著性，计算危险等位基因的相对危险度(Odds ratio,OR)和95％的可信区间，分析中直接获得OR值、可信区间和P值，从而得到所述位点的危险等位基因。通过全基因组关联(GWAS)分析计算获得SNP芯片中每个位点与PBC关联显著性水平(P值)，按照显著性水平(P值小于0.0001)找出与PBC之间存在潜在关联的染色体区域，并得到PBC易感性显著关联的单核苷酸多态性位点及其等位基因。SNP的推算(Imputation)是以千人基因组项目中汉族人结果为参考值(Reference)，采用IMPUTE2软件，结合1,122PBC病人和4,036正常对照的结果进行推算。

分析结果参见表2和图1，结果显示在IL16基因区，有7个单核苷酸多态性位点(rs11857713，rs4778636，rs11073001，rs11556218，rs1803275，rs11325，rs4778640)的疾病相关单倍体频率在PBC中显著高于对照人群，p值为3.33-9.67×10^-6。有7个SNP与rs11857713，rs4778636，rs11073001，rs11556218，rs1803275，rs11325，rs4778640的连锁不平衡(r²＝0.9-1)推算出对应的p值，均在PBC中显著高于对照人群(p＝9.91-3.15×10^-6)。染色体区域单核苷酸多态性位点间的连锁不平衡(Linkage disequilibrium,LD)情况，指的是不同单核苷酸多态性位点间存在着的非随机组合，用r²表示(0-1)。

这一系列单核苷酸多态性位点及其等位基因是：rs17875509，等位基因为G/C；rs11857713，等位基因为C/T；rs4778636，等位基因为G/A；rs11073001，等位基因为A/G；rs11630277，等位基因为C/A；rs56859031，等位基因为A/AGT；rs57763246，等位基因为C/T；rs17875523，等位基因为C/T；rs3898677，等位基因为T/C；rs139879640，等位基因为TCTCA/T；rs4577037，等位基因为T/G；rs3899547，等位基因为A/G；。rs17875532，等位基因为C/T；rs17875533，等位基因为C/A；rs11556218，等位基因为T/G；rs1803275，等位基因为G/A；rs3926277，等位基因为C/A；rs3926278，等位基因为C/G；rs3926279，等位基因为A/G；rs17875542，等位基因为G/C；rs17875543，等位基因为C/T；rs7166271，等位基因为C/T；rs11325，等位基因为G/T；rs4778640，等位基因为A/G。其中危险等位基因分别是：rs17875509多态性位点为C；rs11857713多态性位点为T；rs4778636多态性位点为A；rs11073001多态性位点为G；rs11630277多态性位点为A；rs56859031多态性位点为AGT；rs57763246多态性位点为T；rs17875523多态性位点为T；rs3898677多态性位点为C；rs139879640多态性位点为T；rs4577037多态性位点为G；rs3899547多态性位点为G；rs17875532多态性位点为T；rs17875533多态性位点为A；rs11556218多态性位点为G；rs1803275多态性位点为A；rs3926277多态性位点为A；rs3926278多态性位点为G；rs3926279多态性位点为G；rs17875542多态性位点为C；rs17875543多态性位点为T；rs7166271多态性位点为T；rs11325多态性位点为T；rs4778640多态性位点为G(见表2)。携带这些危险等位基因的个体发生PBC的相对风险是没有携带者的1.27-1.31倍。

IL-16基因区域单核苷酸多态性位点序列：

如序列表中的SEQ ID NO.1所示：

rs17875509CCTTACCCATGCAGATATGATGCTG[C/G]TTCAATGCTGGCTTCTGAGAAAGAC

如序列表中的SEQ ID NO.2所示：

rs11857713GTCAAAGCACAAACAGCTGCCAACT[C/T]ATGACCTTTGTCTTAAAAGTTTAAA

如序列表中的SEQ ID NO.3所示：

rs4778636CTCCTCCTCTTGAATCCTTCTTGCT[A/G]TTCAGCTTGGAAACTAGAATTTAGG

如序列表中的SEQ ID NO.4所示：

rs11073001CTGCTGAAACATCTGCCTTGGACAC[A/G]GGGTTCTCGCTCAAGTGAGTTTCTA

如序列表中的SEQ ID NO.5所示：

rs11630277TCTCATCTTTATTTTTAAAAATAAT[C/T]CTATATATAATTTAAAAAATTCCCA

如序列表中的SEQ ID NO.6所示：

rs56859031TTTCCATGTGTGTGCAGATGTCTGA[AGT/A]GTGTGTGTGTGTCTGTCTGTAGGTA

如序列表中的SEQ ID NO.7所示

rs57763246ATAACAAATCAGTCTGATGTCAGTC[C/T]GATGTTAAATTGTTCATCCTCTTGC

如序列表中的SEQ ID NO.8所示

rs17875523TGTCAGTGGTGACTTCCTTGATTTC[C/T]TGATAAGTTTTCTATCACATAAAAA

如序列表中的SEQ ID NO.9所示

rs3898677

TTTTAAGTGTTTTTTATGTGATAGA[A/G]AACTTATCAGGAAATCAAGGAAGTC

如序列表中的SEQ ID NO.10所示

rs139879640TTAAAACCTGTAAGTCTCTATTTC[T/TCTCA]CTGAGTGCAGCTGAGTATTACAA

如序列表中的SEQ ID NO.11所示

rs4577037AAGATTCCTGACCGTGTAGTTTACT[G/T]TCTACTTGAAGAGGAGGAAAGAGAG

如序列表中的SEQ ID NO.12所示

rs3899547GGTAAAGAGTCAGAATTTCTAGGGG[A/G]GGAGCTATAAAAATGTCTAGACTGC

如序列表中的SEQ ID NO.13所示

rs17875532ATGCTGGCCTCTGTGCCAGCAGCTC[C/T]AATCTAGGACACAATTATCTTTAAT

如序列表中的SEQ ID NO.14所示

rs17875533GGACTGGACTTGTGTGATTTCTGGT[A/C]CTGACTTCCTTTGGTTTGCTCAGGT

如序列表中的SEQ ID NO.15所示

rs11556218

TGGTTTGCTCAGGTTCACAGAGTGTTTCCAAA[G/T]GGGCTGGCCTCCCAGGAAGGGACTATTCAGAAGGGCAATGAGGTTCT

如序列表中的SEQ ID NO.16所示

rs1803275CCAGGCAAGCTGTGATTGTCACAAG[A/G]AAGCTGACTCCAGAGGCCATGCCCG

如序列表中的SEQ ID NO.17所示

rs3926277AAAAAAACATGTTGGACAAAATATC[A/C]AAGTTTAAATCAAGACAGAGTCTGA

如序列表中的SEQ ID NO.18所示

rs3926278CACACTTGGCCTCATTTGCCTTACC[C/G]TAGTCCTGGACACGTCAGCTCCTGC

如序列表中的SEQ ID NO.19所示

rs3926279GGATTGGAGTACAAACCAGTCTGAT[A/G]TGGGGGTCACTTGGATTTCCCTGTG

如序列表中的SEQ ID NO.20所示；

rs17875542CTCCTGCTGCTGACTGGTTTCGTTA[C/G]AGGAAGTTCTGCTGCGGCTGCAGAA

如序列表中的SEQ ID NO.21所示；

rs17875543GGTTTCGTTAGAGGAAGTTCTGCTG[C/T]GGCTGCAGAAACCCAGAAGGTAGAG

如序列表中的SEQ ID NO.22所示

rs7166271ACAAGTCACTTCACCACCATGGGCC[C/T]ATTTGCTTAAATGTTTAGGATGAGA

如序列表中的SEQ ID NO.23所示

rs11325TCCTAAAATAAGGGCAGAGTCACAC[G/T]GGGGCAGCTGATACAAATTGCAGAC

如序列表中的SEQ ID NO.24所示

rs4778640AATGAATGAATTCTAAGTCAATCCA[A/G]GAGTCTGATGATTTCTTGAAAAGGG

表2与原发性胆汁性胆管炎显著关联的IL-16基因区域单核苷酸多态性位点

其中“OR(95％CI)”，表示与携带正常的单倍体的个体相比，携带疾病相关单倍体的个体发生PBC的相对风险。染色体位置为参照Human Genome GRCh37/hg19.。

实施例2rs11556218验证实验

通过针对其中的rs11556218在907个PBC患者和2027个正常对照的验证，同样发现有显著差异。PBC患者验证样品与实施例1中的标准一样；IL-16血清分析正常对照样品来自东南大学教师体检，生化指标正常，B超检查无肝脾异常，无临床疾病表征，自述体健。验证实验实施中的材料和时间如无说明，均由Sequenom公司提供。

实验步骤：

1.rs11556218序列

TGGTTTGCTCAGGTTCACAGAGTGTTTCCAAA[G/T]GGGCTGGCCTCCCAG

GAAGGGACTATTCAGAAGGGCAATGAGGTTCT

2.引物设计

使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由Integrated DNATechnologies合成。

设计使用DNA引物和探针如下：

rs11556218:

引物1序列，ACGTTGGATGAGAACCTCATTGCCCTTCTG；

引物2序列，ACGTTGGATGTGGTTTGCTCAGGTTCACAG；

探针序列，GGTTCACAGAGTGTTTCCAAA

3.PCR扩增

PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。在一个新的1.5ml EP管中配制PCR master mix溶液。

配制PCR master mix液：

PCR Mix对每个反应，μL

10×PCR Buffer 0.5μL

MgCl2(25mM)0.4μL

dNTP mix(25mM)0.1μL

HotStar Taq(5U/μL)0.1μL

Water 1.9μL

PCR primer mix(引物1和2各0.5pmol)1μL

Total Volume 4μL

使用24通道加样器，调节加样体积为4μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCR master mix液。该384孔板即为PCR反应板。取出已经制备好的DNA样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μL，每个5μlPCR反应体系中包含模板DNA 20-50ng，Hotstar Taq 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs。在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。将384孔PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR反应。

4.PCR产物碱性磷酸酶处理

在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。

(1)配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix。

SAP Mix对每个反应，μL

H₂O1.53

SAP Buffer(10x)0.17

SAP Enzyme(1.7U/μL)0.3

Total Volume 2

(2)使用24通道加样器，调节加样体积为2μL，将SAP Mix加入384孔PCR反应板。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAP Mix 2μl。

(3)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。

5.单碱基延伸

(1)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。

(2)配制单碱基延伸反应液，EXTEND Mix。

(3)使用24通道加样器，调节加样体积为2μL，将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTEND Mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)。

(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：

I.94℃for 30seconds；

II.94℃for 5seconds；

III.52℃for 5seconds；

IV.80℃for 5seconds；

V.GOTO III，4more times；

VI.GOTO II，39more times；

VII.72℃for 3minutes；

VIII.4℃forever；

启动PCR仪进行单碱基延伸反应。

6.树脂纯化

(1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；

(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内；

(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；

(4)离心使树脂沉入孔底部。

7.芯片点样

启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上。

8.质谱检测

将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。共907个PBC样品和2127个对照样品得到了有效的结果。

采用PLINK软件，逻辑回归原理进行，以性别为共变量，按叠加效应模型对907个PBC样品和2127个对照样品的结果进行了统计分析。rs11556218的疾病相关单倍体(G)频率在PBC中(0.2326)显著高于对照人群(0.1885)，p值为7.0×10^-4，将rs11556218在1,122PBC病人和4,036正常对照的GWAS结果，与rs11556218在907个PBC样品和2127个对照样品的结果进行叠加分析，采用fixed-effect model(I2<25％)的原理，统计分析共包括2029个PBC样品和6163个对照样品。结果表明rs11556218的疾病相关单倍体(G)频率在PBC中显著高于对照人群，p值为8.99×10^-9，odds ratio值(96％CI)为1.29(1.18-1.41)(见表3)。

表3：IL-16多态位点rs11556218在全基因组关联分析和验证发现中的结果

实施例3原发性胆汁性胆管炎患者和正常对照人群的血清IL-16定量分析

IL-16定量酶联免疫检测是采用成熟的试剂盒，购自R&D Systems公司，Human IL-16Quantikine ELISA Kit，产品号D1600。根据试剂盒的步骤，采用2微升的血清。

按照试剂盒提供的标准品制备标准曲线，对检测样品定量。

1.在ELISA板检测孔中加入100微升稀释液(试剂盒中提供)；

2.在ELISA板检测孔中加入100微升标准样品，阴性对照(试剂盒中提供)，以及1：5稀释的检测样品的血清(采用试剂盒中提供的稀释液稀释)；

3.封板，室温保持2小时；

4.吸出液体，用200微升洗液(试剂盒中提供)洗4遍，清干；

5.加入100微升conjugates(试剂盒中提供)，封板，室温保持2小时；

6.吸出液体，用200微升洗液(试剂盒中提供)洗4遍，清干；

7.加入200微升底物溶液(试剂盒中提供)，室温避光保持30分钟；

8.加入50微升终止液(试剂盒中提供)，在30分钟内，采用ELISA读板机(iMarkMicroplate Absorbance Reader，Bio-Rad公司)，波长设定为450nm，读取结果。

该实验对120例PBC患者和120例正常对照血清进行了定量分析，采用GraphPad Prism6软件作图并进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示，对病人组和对照组两组数据使用Mann-Whiteny U检验，对rs11556218不同基因型中IL-16表达采用Kruskal-Wallis检验，并两两比较，双尾检验P值<0.05认为具有统计学意义。统计发现IL-16血清浓度在PBC病人中对比正常对照显著升高(P〈0.0001)。

上述仅为本发明优选的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出其它不同形式的变化或变动，这些也应属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东南大学

<120> 与原发性胆汁性胆管炎关联的白细胞介素16及其应用

<130> SG20161114001

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> rs17875509

<221> misc_feature

<223> n is c or g

<400> 1

ccttacccat gcagatatga tgctgnttca atgctggctt ctgagaaaga c 51

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> rs11857713

<220>

<221> misc_feature

<223> n is c or t

<400> 2

gtcaaagcac aaacagctgc caactnatga cctttgtctt aaaagtttaa a 51

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> rs4778636

<221> misc_feature

<223> n is a or g

<400> 3

ctcctcctct tgaatccttc ttgctnttca gcttggaaac tagaatttag g 51

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> rs11073001

<221> misc_feature

<223> n is a or g

<400> 4

ctgctgaaac atctgccttg gacacngggt tctcgctcaa gtgagtttct a 51

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> rs11630277

<221> misc_feature

<223> n is c or t

<400> 5

tctcatcttt atttttaaaa ataatnctat atataattta aaaaattccc a 51

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> rs56859031

<221> misc_feature

<223> n is g or t

<400> 6

tttccatgtg tgtgcagatg tctgangtgt gtgtgtgtct gtctgtaggt a 51

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> rs57763246

<221> misc_feature

<223> n is c or t

<400> 7

ataacaaatc agtctgatgt cagtcngatg ttaaattgtt catcctcttg c 51

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> rs17875523

<221> misc_feature

<223> n is c or t

<400> 8

tgtcagtggt gacttccttg atttcntgat aagttttcta tcacataaaa a 51

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> rs3898677

<221> misc_feature

<223> n is a or g

<400> 9

ttttaagtgt tttttatgtg ataganaact tatcaggaaa tcaaggaagt c 51

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> rs139879640

<221> misc_feature

<223> n is t or tctca

<400> 10

taaaacctg taagtctcta tttcnctgag tgcagctgag tattacaaaa 50

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> rs4577037

<221> misc_feature

<223> n is g, or t

<400> 11

aagattcctg accgtgtagt ttactntcta cttgaagagg aggaaagaga g 51

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> rs3899547

<221> misc_feature

<223> n is a or g

<400> 12

ggtaaagagt cagaatttct aggggnggag ctataaaaat gtctagactg c 51

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> rs17875532

<221> misc_feature

<223> n is c or t

<400> 13

atgctggcct ctgtgccagc agctcnaatc taggacacaa ttatctttaa t 51

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> rs17875533

<221> misc_feature

<223> n is a or c

<400> 14

ggactggact tgtgtgattt ctggtnctga cttcctttgg tttgctcagg t 51

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> rs11556218

<221> misc_feature

<223> n is g or t

<400> 15

ctcaggttca cagagtgttt ccaaangggc tggcctccca ggaagggact a 51

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> rs1803275

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a or g

<400> 16

ccaggcaagc tgtgattgtc acaagnaagc tgactccaga ggccatgccc g 51

<210> 17

<211> 51

<212> DNA

<213> rs3926277

<221> misc_feature

<223> n is a or c

<400> 17

aaaaaaacat gttggacaaa atatcnaagt ttaaatcaag acagagtctg a 51

<210> 18

<211> 51

<212> DNA

<213> rs3926278

<221> misc_feature

<223> n is c or g

<400> 18

cacacttggc ctcatttgcc ttaccntagt cctggacacg tcagctcctg c 51

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> rs3926279

<221> misc_feature

<223> n is a or g

<400> 19

ggattggagt acaaaccagt ctgatntggg ggtcacttgg atttccctgt g 51

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> rs17875542

<221> misc_feature

<223> n is c or g

<400> 20

ctcctgctgc tgactggttt cgttanagga agttctgctg cggctgcaga a 51

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> rs17875543

<221> misc_feature

<223> n is c or t

<400> 21

ggtttcgtta gaggaagttc tgctgnggct gcagaaaccc agaaggtaga g 51

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> rs7166271

<221> misc_feature

<223> n is c or t

<400> 22

acaagtcact tcaccaccat gggccnattt gcttaaatgt ttaggatgag a 51

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> rs11325

<221> misc_feature

<223> n is g or t

<400> 23

tcctaaaata agggcagagt cacacngggg cagctgatac aaattgcaga c 51

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> rs4778640

<221> misc_feature

<223> n is a or g

<400> 24

aatgaatgaa ttctaagtca atccangagt ctgatgattt cttgaaaagg g 51

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物1序列

<400> 25

acgttggatg agaacctcat tgcccttctg 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物2序列

<400> 26

acgttggatg tggtttgctc aggttcacag 30

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 探针序列

<400> 27

ggttcacaga gtgtttccaa a 21