本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种以重组人3型腺病毒为载体，嵌合传染性法氏囊病毒（IBDV）中和表位的重组人3型腺病毒表位疫苗候选株及其制备方法和应用。
背景技术：
传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病毒（IBDV）引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病，除直接引起鸡死亡和生产性能下降外，还可导致感染鸡免疫抑制。
反向遗传技术的成功建立，很大程度上推进了IBDV的预防工作。众多学者对于IBDV的A节段做了相关的研究，发现IBDV的VP2蛋白对病毒的毒力、细胞嗜性有重要作用，VP3和VP5蛋白也对病毒的复制有一定的影响，VP1对病毒的复制也有一定的影响。研究表明，IBDV VP2上存在2个线性中和抗原表位，其刺激机体后产生的抗体可以有效的中和IBDV感染鸡胚。
由于IBDV对很多理化条件都有很强的抵抗力，对乙醚，氯仿，吐温，胰蛋白酶都有抵抗力，对大多数消毒药也有抵抗力，病毒很容易被携带和保存。
应用疫苗进行免疫接种是防控IBDV的最主要手段。通常是接种育种鸡，这样可以使刚出壳的雏鸡获得一定水平的母源抗体以抵御早期感染。用于育种鸡免疫的通常采用灭活疫苗，但是该病毒的灭活后仍然存在一定的危害，且免疫效果没有活苗好。使用弱毒活疫苗虽然提高了疫苗的保护力，但是其会收到母源抗体的干扰，而且通常还有一定残存的毒力，存在毒力返强的危险，中等毒力活疫苗可以不受母源抗体干扰而产生较强的免疫应答，但由于其残存的毒力，通常容易引起法氏囊组织损伤。
人3型腺病毒（HAdV3）疫苗可以作为经肠道黏膜免疫的载体使用，其六邻体的高变区可以插入氨基酸的外源片段，这样将具有免疫活性的抗原片段展示的人3型腺病毒粒子表面，随着病毒的复制，含有抗原片段的重组子就会不断复制，并且展示到人3型腺病毒的表面的抗原片段具有更好的免疫原性。
经检索，未见用重组人3型腺病毒表位疫苗候选株用于传染性法氏囊病预防的报导。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒的制备方法和应用，将IBDV的中和抗原表位嵌和到人3型腺病毒（HAdV3）病毒粒子表面，可获得一种预防IBDV的表位疫苗候选株。
实现本发明目的的技术方案是：
一种嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒，所述人3型腺病毒六邻体的HVR1区插入有IBDV的中和抗原表位VP2-1，VP2-1的氨基酸序列为CDSSDRPRVYTIT。
其中，所述IBDV的中和抗原表位VP2-1的替换氨基酸序列为HVR1区的NRDNAVTT。
本发明还提供一种人3型腺病毒-IBDV VP2-1的表位疫苗候选株，所述表位疫苗候选株含有上述的重组人3型腺病毒，该表位疫苗候选株可以诱导产生抗IBDV的免疫反应，利用该表位疫苗候选株可以制备预防IBDV的表位疫苗。
本发明还提供一种载体，所述载体包含上述的重组人3型腺病毒。
本发明还提供了制备上述嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒，包括如下步骤：在人3型腺病毒（HAdV3）的六邻体的HVR1区插入IBDV的中和抗原表位VP2-1， VP2-1氨基酸序列为CDSSDRPRVYTIT，所替换的氨基酸序列为NRDNAVTT。
本发明嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒的应用，用于传染性法氏囊病的预防。
本发明所提供的嵌合IBDV中和表位的重组人3型腺病毒，允许IBDV中和抗原表位个别氨基酸的缺失、替换或添加。但需要保持中和抗原表位的免疫原性；允许被置换的HVR1区个别氨基酸的缺失、替换或添加，但需要保持腺病毒的稳定性，同时保证外源表位的免疫活性。
本发明在人3型腺病毒六邻体衣壳上展示IBDV的中和抗原表位，该重组腺病毒可以产生抗IBDV感染的免疫应答，多次免疫注射能加强免疫。该重组病毒可以预防IBDV感染。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本实施例中的Ad3使用的Hadv3病毒株(全基因Genbank号：DQ099432)。
1：构建重组病毒载体
以HAdv3载体为模板，重叠PCR分别扩增含有IBDV的中和抗原表位的六邻体片段。经过Cla I，Bam H I双酶切后与经过Cla I，Bam H I酶切后的穿梭质粒PBRLOR连接构建穿梭质粒，命名为PBRLOR –Ad3-IBDV VP2-1。将构建好的穿梭质粒经过EcoR I，Sal I双酶切与骨架质粒pBRAd3△E3GFP经过Pac I，AvR II在BJ5183内同源重组，得到重组质粒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP。所使用的引物见表1，IBDVr为PCR筛选鉴定用特异引物。
表1重叠PCR法扩增外源表位嵌入的HAdv3-IBDV VP2-1六邻体基因使用的引物
将上述重组得到的质粒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP经过AsisI酶切后，转染Ad293细胞，拯救包装得到重组病毒。大量培养并CsCl密度梯度离心纯化病毒粒子。经过纯化的病毒粒子达到1×1012 VPs/ml，测定OD260/OD280比值约1.2-1.4，内毒素检测<10EU/ml。重组病毒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP在HEp-2细胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、测序鉴定，表明重组病毒基因组保持稳定，没有基因缺少、重组现象。
：重组病毒的免疫原性实验
制备抗血清，进行血清中和实验，验证重组病毒载体的免疫原性。将纯化的重组病毒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP经肌肉注射免疫小鼠，得到的多抗血清进行鸡胚中和实验，检测重组病毒产生的抗IBDV感染的能力。
免疫3次后，第14天采集小鼠的血清，中和实验见表2，表2为多次免疫小鼠的中和效价，实验结果数据表明多次免疫后抗IBDV的免疫应答得到加强。
表2 多次免疫后血清中和效价
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