本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种车前子多糖提取物的制备方法。
背景技术：
天然药物中广泛存在具有抗补体作用的活性成分，国内外已完成部分天然药物如麻黄、人参、杜仲等的筛选，发现自然界中广泛存在的某些多糖、蛋白质、多肽、甾类、萜类和生物碱等化学物具有显著的抗补体活性，其中以糖基化蛋白和多聚糖化合物为多，肝素是有糖醛酸和氨基葡萄糖聚合而成的一个硫酸化多糖，是研究较早、较成熟的补体抑制剂，但由于肝素具有抗凝血作用，在生物体内需较高浓度才能发挥药效，且副作用大，限制了其临床用途。
车前子是我国广泛使用的正品药材之一，车前子的化学成分中主要含有黄酮类和多糖等成份，车前子临床应用广泛，在国内多用于治疗泌尿系统感染、高血压等疾病，环烯醚萜类和黄酮类被认为车前子的主要活性成分。
现有技术如，中国发明授权专利文献，授权公告号CN 102138981 B该发明涉及一种免疫抑制活性车前子提取物的制备方法和医药用途，制备方法包括原料脱脂后，再经过水提取、醇沉淀得到粗提取物，粗提取物经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的车前子提取物，该发明中的免疫抑制活性车前子提取物，其中总多糖的含量占提取物重量百分比的 72％以上，该发明通过大量的药理学实验发现，车前子提取物具有免疫抑制活性，可以用作制备各种剂型的免疫抑制剂或作为制备其他免疫抑制药物的原料药，用于治疗与免疫炎性损伤相关的疾病 ：肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水肿、以及眼葡萄膜炎、角膜基质炎、角膜移植排异反应等眼部疾病的医药用途，但是该发明在药材前期处理有所欠缺，例如未进行破壳处理可能会影响提取率，在提取车前子多糖方面还具有提升空间。
技术实现要素：
本发明针对上述技术问题提供一种提取率高，纯度高的一种车前子多糖提取物的制备方法，通过对药材前期预处理，再配合助溶剂、超声波助溶提高多糖在蒸馏水中的熔解率进而提高多糖的提取率及在提取物中的含量，改进并完善了现有技术中车前子多糖的提取工艺，本发明提取方法简单，可操作性强。
本发明针对上述技术问题所采取的方案为：车前子多糖提取物的制备方法，制备方法包括以下步骤：
1）原料处理：将车前子烘干，除杂、粉碎破壳，加入石油醚回流脱脂，得残渣；
2）粗提取：加入残渣重量6~12倍的蒸馏水和0.1~0.2倍助溶剂，超声波助溶，浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤，用蒸馏水溶解沉淀物，透析，浓缩，冷冻干燥得沉淀物A；
3）提取：沉淀物A依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤，用蒸馏水加热溶解，离心，取上清液，脱色素和蛋白质，减压浓缩，得车前子提取物；本发明对车前子进行破壳预处理后脱脂，再配合助溶剂、超声波助溶，进行二次提取，制得的提取物中的多糖含量高，提取工艺简单。
作为优选，步骤1中将车前子在40~55℃下烘干3~5h，除杂质后粉碎2~6min，利于多糖提取，加入车前子体积1/3~1/2的石油醚回流脱脂，去除脂类对提取的影响。
作为优选，步骤2中超声波助溶功率为100~350w，时间为10~40min，使多糖在助溶剂的配合下充分在蒸馏水中溶解，利于多糖提取，浓缩至车前子原体积的0.1~1倍，去除水分提升乙醇醇沉的效果。
作为优选，步骤2中加入85~90%乙醇醇沉，离心得沉淀物，将多糖沉淀，依次用沉淀物重量1~5倍的无水乙醇，丙酮分别洗涤，脱水。
作为优选，步骤2中所述助溶剂由复合表面活性剂2~3重量份、混合溶液2~3重量份与蒸馏水0.8~1.2重量份组成，复合表面活性剂是由二己基琥珀酸磺酸钠、聚氧乙烯壬烷基酚醚、乙基乙基一甲氧基肉桂酸盐、阿魏酸，按物质的量比mol 5∶3：0.2：0.1 配比制成，混合溶液是由分析纯AR 的正丁醇、分析纯AR 的95%乙醇和乙酸乙酯，按体积比ml为3∶4：0.25配比制成，将复合表面活性剂与混合溶液混合后，与蒸馏水按体积比ml为4~6∶1 配比制成助溶剂，乙基乙基一甲氧基肉桂酸盐、阿魏酸与上述复合表面活性剂其他成份组合，可能是叠加产生了意想不到的有益成分或协同交互作用，具有促进车前子多糖溶解的作用，使车前子多糖充分溶解到蒸馏水中，再配合超声波助溶，充分溶解多糖进而提高提取率。
作为优选，步骤2中用分子截留量4000~11000Da的透析袋透析20~23h，获得不同分子量的多糖，不同分子量的多糖的效果也有所不同，扩大提取到的多糖作用。
作为优选，步骤3中依次用沉淀物A重量1~6倍的无水乙醇，丙酮分别洗涤，将沉淀物中的水分去除，获得较高含量多糖的沉淀物。
作为优选，步骤3中在沉淀物A加热溶解后静置2~4min，3000~3800r/min离心3~5min后再以3900~5500r/min离心5~8min，取上清液，更利于分离出多糖沉淀物且离心效率提高，离心时间减少，减少了提取时间。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明对车前子进行破壳预处理后脱脂，再配合助溶剂、超声波助溶，进行二次提取，与现有技术相比，本发明使用助溶剂和超声波助溶使多糖充分在蒸馏水中溶解，利于多糖的提取，制得的提取物中的多糖含量高，多糖含量在98.5%以上，杂质含量低，提取工艺简单。
具体实施例
以下结合实施例作进一步详细描述：
实施例1
车前子多糖提取物的制备方法，制备方法包括以下步骤：
1）原料处理：将车前子烘干，除杂、粉碎破壳，加入石油醚回流脱脂，得残渣；
2）粗提取：加入残渣重量6~12倍的蒸馏水和0.1~0.2倍助溶剂，超声波助溶，浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤，用蒸馏水溶解沉淀物，透析，浓缩，冷冻干燥得沉淀物A；
3）提取：沉淀物A依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤，用蒸馏水加热溶解，离心，取上清液，脱色素和蛋白质，减压浓缩，得车前子提取物；本发明对车前子进行破壳预处理后脱脂，再配合助溶剂、超声波助溶，进行二次提取，制得的提取物中的多糖含量高，提取工艺简单。
步骤1中将车前子在40~55℃下烘干3~5h，除杂质后粉碎2~6min，利于多糖提取，加入车前子体积1/3~1/2的石油醚回流脱脂，去除脂类对提取的影响。
步骤2中超声波助溶功率为100~350w，时间为10~40min，使多糖在助溶剂的配合下充分在蒸馏水中溶解，利于多糖提取，浓缩至车前子原体积的0.1~1倍，去除水分提升乙醇醇沉的效果。
步骤2中加入85~90%乙醇醇沉，离心得沉淀物，将多糖沉淀，依次用沉淀物重量1~5倍的无水乙醇，丙酮分别洗涤，脱水。
步骤2中所述助溶剂由复合表面活性剂2~3重量份、混合溶液2~3重量份与蒸馏水0.8~1.2重量份组成，复合表面活性剂是由二己基琥珀酸磺酸钠、聚氧乙烯壬烷基酚醚、乙基乙基一甲氧基肉桂酸盐、阿魏酸，按物质的量比mol 5∶3：0.2：0.1 配比制成，混合溶液是由分析纯AR 的正丁醇、分析纯AR 的95%乙醇和乙酸乙酯，按体积比ml为3∶4：0.25配比制成，将复合表面活性剂与混合溶液混合后，与蒸馏水按体积比ml为4~6∶1 配比制成助溶剂，利于车前子多糖溶解到蒸馏水中，再配合超声波助溶，充分溶解多糖进而提高提取率。
步骤2中用分子截留量4000~11000Da的透析袋透析20~23h，获得不同分子量的多糖，不同分子量的多糖的效果也有所不同，扩大提取到的多糖作用。
步骤3中依次用沉淀物A重量1~6倍的无水乙醇，丙酮分别洗涤，将沉淀物中的水分去除，获得较高含量多糖的沉淀物。
步骤3中在沉淀物A加热溶解后静置2~4min，3000~3800r/min离心3~5min后再以3900~5500r/min离心5~8min，取上清液，更利于分离出多糖沉淀物且离心效率提高，离心时间减少，减少了提取时间。
实施例2
车前子多糖提取物的制备方法，制备方法包括以下优选的步骤：
1）原料处理：将车前子在优选的45℃下烘干4h，除杂质后粉碎5min，优选加入车前子体积1/5的石油醚回流脱脂，得残渣；
2）粗提取：优选加入残渣重量8倍的蒸馏水和0.15倍助溶剂，超声波助溶，超声波助溶功率优选为230w，时间优选为30min，浓缩，优选加入88%乙醇醇沉，离心得沉淀物，依次用优选的沉淀物重量5倍的无水乙醇，丙酮分别洗涤，用蒸馏水溶解沉淀物，用分子截留量4000~11000Da的透析袋透析20~23h，根据所需多糖功效选择分子截留量的透析袋和透析时间，浓缩，冷冻干燥得沉淀物A；
3）提取：依次用优选的沉淀物A重量4倍的无水乙醇，丙酮分别洗涤，用蒸馏水加热溶解，优选静置3min，3500r/min离心4min后再以4500r/min离心6min，取上清液，脱色素和蛋白质，减压浓缩，得车前子提取物；
上述步骤1~3中的透析、冷冻干燥、脱色素和蛋白质等常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细描述，本发明对车前子进行破壳预处理后脱脂，再配合助溶剂、超声波助溶，进行二次提取，制得的提取物中的多糖含量高，提取工艺简单。
步骤2中所述助溶剂由优选的复合表面活性剂2.4重量份、混合溶液2.3重量份与蒸馏水1.1重量份组成，复合表面活性剂是由二己基琥珀酸磺酸钠、聚氧乙烯壬烷基酚醚、乙基乙基一甲氧基肉桂酸盐、阿魏酸，按物质的量比mol 5∶3：0.2：0.1 配比制成，混合溶液是由分析纯AR 的正丁醇、分析纯AR 的95%乙醇和乙酸乙酯，按体积比ml为3∶4：0.25配比制成，将复合表面活性剂与混合溶液混合后，与蒸馏水按体积比ml优选为5∶1 配比制成助溶剂，利于车前子多糖溶解到蒸馏水中，再配合超声波助溶，充分溶解多糖进而提高提取率。
复合表面活性剂与混合溶液混合后，与蒸馏水按体积比ml不仅限于4~6∶1，还应包括4：1、4.1：1、4.2：1、4.3：1、4.4：1……5.9：1、6：1。
步骤1中不仅限于加入车前子体积1/3~1/2的石油醚回流脱脂，还应包括20/60、21/60、22/60、23/60……29/60、30/60的石油醚。
本发明所制备的多糖提取物在制备治疗免疫炎性损伤相关疾病的药物中使用，免疫炎性损伤相关疾病是肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水肿、眼葡萄膜炎、角膜基质炎及角膜移植排异反应。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。