本发明涉及一种从海带中活性物质的提取方法，具体涉及一种从海带中提取岩藻聚糖硫酸酯的的方法。
背景技术：
岩藻聚糖硫酸酯，又称褐藻糖胶，是一种水溶性的杂聚多糖，其主要有效成份是α-L-岩藻糖-4-硫酸酯。岩藻聚糖硫酸酯是一种优良的健康食品、药品原料，因天然含有硫酸根，从而具有阴离子高分子化合物的特性，研究表明，岩藻聚糖硫酸酯无毒副作用，具有多种生物活性，包括抗凝血、降血脂、抗慢性肾衰、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化损伤、促进组织再生、抑制胃溃疡、增强机体免疫机能和外科治疗潜力等。
岩藻聚糖硫酸酯是一种高值化产品，是海带海藻高值化发展的出路，目前岩藻聚糖硫酸酯的提取方法有水热提取法、酸提取法、超声波提取法等，水热提法是利用岩藻聚糖硫酸酯易溶于水的性质，该方法避免了岩藻聚糖硫酸酯发生酸水解的可能性，可保持褐藻糖胶的大分子结构，缺点是提取液体积过大，提取物中存在较多的褐藻酸，增加了分离纯化的难度；酸提取法是利用褐藻酸在低pH下难以溶解的性质，用稀盐酸将岩藻聚糖硫酸酯提取出来，该方法存在着提取周期长，耗能多等缺点；超声波法提取多糖是一种很有希望的多糖提取新方法，可以提高提出率并缩短提取时间，由于超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，从而在后处理的过程中的损失增大而影响多糖的提出率。
专利ZL98110253.0公开了一种可变分子量岩藻聚糖硫酸酯(褐藻糖胶)的制备方法，专利ZL 200410023694公开了一种高硫酸根含量岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，但这些方法均是用热水和加酸来提取岩藻聚糖硫酸酯，提取率不高，并且污染环境。专利200510047582.X用酶解法提取岩藻聚糖硫酸酯，但是需要用到价格较贵的纤维素酶和果胶酶，造成生产成本提高。
传统热提取是以热传导、热辐射等方式由外向里进行，而微波提取是通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热，微波提取具有以下特点：选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、低能耗、无污染、有效成分得率高以及不产生噪音 等；连续逆流提取是指在提取的过程中，物料和溶剂同时连续运动，但运动方向相反，通过机械传输，连续定量加料，使物料和溶媒充分接触，设备内溶剂不断更新，最终连续出渣，同时在设备内部不断更新溶剂，溶剂在流动过程中不断获得物料的有效成份，浓度不断提高，在连续进液和连续出液的过程中，溶剂中存在连续的浓度梯度，从而使提取液可以获得比较快的浸出速度，也可以获得比较高的提取液浓度。
技术实现要素：
为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种操作简单、成本低、收率高、纯度高的岩藻聚糖硫酸酯的提取纯化方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案包括以下步骤：
1)选取干海带，清洗干净后将海带切成0.2-0.4mm的海带丝；
所述步骤1)中选择藻体肥厚成熟度适宜的淡干海带，去掉根部、黄白边及腐烂斑疤和有孔洞的部位，切成均匀的海带丝，有助于提取岩藻聚糖硫酸酯，也有益于回收利用。
2)将上述1重量份的海带丝加入10-20重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，搅拌，40-60℃提取0.5-1h，分离得海带丝A和乙醇提取液；
所述步骤2)中乙醇可以去除海带中的色素，乙醇提取液可以回收甘露醇和碘。
3)将1重量份的海带丝A用清水冲洗2-4分钟后，加入3-6重量份的水溶液进行浸泡水煮后提取，离心收集水提取液和海带丝B；
所述步骤3)中加入水溶液先浸泡2-10h，再恒温加热到20-90℃，加热时间为0.5-2h，保温1-2h，自然冷却后再浸泡3-24h，利用岩藻聚糖硫酸酯易溶于水的性质，该方法避免了岩藻聚糖硫酸酯发生酸水解的可能性，可保持岩藻聚糖硫酸酯的大分子结构，经过水溶液的多次的浸泡和加热，可以使更多得岩藻聚糖硫酸酯溶于水中。
4)在海带丝B中加入溶剂，70-90℃恒温下进行微波逆流提取，微波功率为400-800W，提取时间为50-70min，提取完成后，提取液经离心得上清液和海带丝C，离心速度为500-1500r/min，时间为20-40min，水提取液和上清液合并即 岩藻聚糖硫酸酯粗提取液；
所述步骤4)中，原料与溶剂的质量比为1:4-10。
优选的，所述原料与溶剂的质量比为1:6。
所述步骤4)中的溶剂可以为去离子水、低浓度的酸或低浓度的酸与有机酸的混合，步骤4)中所述低浓度的酸为0.08-0.15mol/L的盐酸、0.06-0.12mol/L硝酸或0.10-0.18mol/L硫酸中的一种，所述有机酸为乙酸或羧酸，所述有机酸的浓度为0.05-0.10mol/L。
优选的，溶剂为0.08-0.15mol/L的盐酸和0.05-0.10mol/L乙酸的混合。
5)在岩藻聚糖硫酸酯粗提取液中加入过量氯化钙，至无沉淀出现，静置12-26小时，再进行多级过滤得滤液；
所述步骤5)中的多级过滤包括热过滤、离心和超滤，热过滤温度为70-85℃，离心转速先为1000-2000r/min，持续10-30min后离心速度调为2000-4000r/min，持续10-30min，超滤是经过截留分子量为3000-5000kDa的超滤膜。
6)将滤液采用超滤膜超滤进行浓缩，得浓缩液。
所述步骤6)中超滤膜为截留分子量1000-2000的中空纤维素超滤膜。
7)将1重量份的浓缩液加入到2-5重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，在5℃放置使沉淀完全，沉淀经离心后干燥，即得岩藻多糖硫酸酯纯品；
8)海带丝C经清洗干燥后回收。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明方法简单，有机溶剂使用少，步骤少，成本低，海带可以回收利用，适于工业化生产；
2)采用水提取、酸提取和微波逆流提取方法提高了产品收率。
3)本发明在岩藻聚糖硫酸酯的纯化过程中采用多级过滤超滤浓缩方法，使产品纯度大大提高，岩藻聚糖硫酸酯含量为2.0％-2.8％，其中岩藻糖含量为75.2％-80.8％，硫酸根含量为55.6％-75.4％。
具体实施方式
实施例1
将1重量份的海带丝加入10重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，搅拌，40℃提取0.5h，分离得海带丝A和乙醇提取液；将1重量份的海带丝A用清水 冲洗3分钟后，加入3重量份的水溶液浸泡2h，再恒温加热到20℃，加热时间为0.5h，保温1h，自然冷却后再浸泡3h，离心收集水提取液和海带丝B；在1重量份的海带丝B中加入6重量份的0.08mol/L的盐酸和0.05mol/L乙酸的混合溶剂，70℃恒温下进行微波逆流提取，微波功率为400W，提取时间为50min，提取完成后，提取液经离心得上清液和海带丝C，离心速度为500r/min，时间为20min，水提取液和上清液合并即岩藻聚糖硫酸酯粗提取液，海带丝C经清洗后干燥回收利用；在岩藻聚糖硫酸酯粗提取液中加入过量氯化钙，至无沉淀出现，静置12小时，在依次进行热过滤、离心和超滤，热过滤温度为70℃，离心转速先为1000r/min，持续10min后离心速度调为2000r/min，持续10min，超滤是经过截留分子量为3000的超滤膜，得滤液；将滤液通过截留分子量1000的中空纤维素超滤膜进行浓缩，得浓缩液；将1重量份的浓缩液加入到2重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，在5℃下放置使沉淀完全，沉淀经离心后干燥，即得岩藻多糖硫酸酯纯品，岩藻聚糖硫酸酯含量为2.0％，其中岩藻糖含量为75.5％，硫酸根含量为55.6％。
实施例2
将1重量份的海带丝加入20重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，搅拌，60℃提取1h，分离得海带丝A和乙醇提取液；将1重量份的海带丝A用清水冲洗3分钟后，加入6重量份的水溶液浸泡10h，再恒温加热到90℃，加热时间为02h，保温2h，自然冷却后再浸泡24h，离心收集水提取液和海带丝B；在1重量份的海带丝B中加入6重量份的0.15mol/L的盐酸和0.10mol/L乙酸的混合溶剂，90℃恒温下进行微波逆流提取，微波功率为800W，提取时间为70min，提取完成后，提取液经离心得上清液和海带丝C，离心速度为1500r/min，时间为40min，水提取液和上清液合并即岩藻聚糖硫酸酯粗提取液，海带丝C经清洗后干燥回收利用；在岩藻聚糖硫酸酯粗提取液中加入过量氯化钙，至无沉淀出现，静置26小时，在依次进行热过滤、离心和超滤，热过滤温度为85℃，离心转速先为2000r/min，持续30min后离心速度调为4000r/min，持续30min，超滤是经过截留分子量为3000的超滤膜，得滤液；将滤液通过截留分子量1000的中空纤维素超滤膜进行浓缩，得浓缩液；将1重量份的浓缩液加入到5重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，在5℃下放置使沉淀完全，沉淀经离心后干燥，即得岩藻 多糖硫酸酯纯品，岩藻聚糖硫酸酯得率为2.5％，其中岩藻糖含量为78.2％，硫酸根含量为58.6％。
实施例3
将1重量份的海带丝加入15重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，搅拌，50℃提取1h，分离得海带丝A和乙醇提取液；将1重量份的海带丝A用清水冲洗3分钟后，加入6重量份的水溶液浸泡8h，再恒温加热到80℃，加热时间为1h，保温1.5h，自然冷却后再浸泡12h，离心收集水提取液和海带丝B；在1重量份的海带丝B中加入6重量份的0.10mol/L的盐酸和0.08mol/L乙酸的混合溶剂，80℃恒温下进行微波逆流提取，微波功率为600W，提取时间为60min，提取完成后，提取液经离心得上清液和海带丝C，离心速度为1000r/min，时间为30min，水提取液和上清液合并即岩藻聚糖硫酸酯粗提取液，海带丝C经清洗后干燥回收利用；在岩藻聚糖硫酸酯粗提取液中加入过量氯化钙，至无沉淀出现，静置18小时，在依次进行热过滤、离心和超滤，热过滤温度为78℃，离心转速先为1500r/min，持续20min后离心速度调为3200r/min，持续20min，超滤是经过截留分子量为3000的超滤膜，得滤液；将滤液通过截留分子量1000的中空纤维素超滤膜进行浓缩，得浓缩液；将1重量份的浓缩液加入到3重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，在5℃下放置使沉淀完全，沉淀经离心后干燥，即得岩藻多糖硫酸酯纯品，岩藻聚糖硫酸酯得率为2.8％，其中岩藻糖含量为80.8％，硫酸根含量为75.4％。
实施例4
将1重量份的海带丝加入16重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，搅拌，60℃提取1h，分离得海带丝A和乙醇提取液；将1重量份的海带丝A用清水冲洗3分钟后，加入4重量份的水溶液浸泡7h，再恒温加热到60℃，加热时间为1.2h，保温2h，自然冷却后再浸泡16h，离心收集水提取液和海带丝B；在1重量份的海带丝B中加入6重量份的0.10mol/L的盐酸和0.10mol/L乙酸的混合溶剂，78℃恒温下进行微波逆流提取，微波功率为700W，提取时间为55min，提取完成后，提取液经离心得上清液和海带丝C，离心速度为800r/min，时间为20min，水提取液和上清液合并即岩藻聚糖硫酸酯粗提取液，海带丝C经清洗后干燥回收利用；在岩藻聚糖硫酸酯粗提取液中加入过量氯化钙，至无沉淀出现， 静置14小时，在依次进行热过滤、离心和超滤，热过滤温度为75℃，离心转速先为1200r/min，持续15min后离心速度调为3800r/min，持续15min，超滤是经过截留分子量为3000的超滤膜，得滤液；将滤液通过截留分子量1000的中空纤维素超滤膜进行浓缩，得浓缩液；将1重量份的浓缩液加入到4重量份的质量浓度为95％乙醇溶液中，在5℃下放置使沉淀完全，沉淀经离心后干燥，即得岩藻多糖硫酸酯纯品，岩藻聚糖硫酸酯得率为2.5％，其中岩藻糖含量为80.6％，硫酸根含量为65.4％。
本发明方法简单，有机溶剂使用少，步骤少，成本低，适于工业化生产；采用水提取、酸提取和微波逆流提取方法提高了产品收率，在岩藻聚糖硫酸酯的纯化过程中采用多级过滤超滤浓缩方法，使产品纯度大大提高，岩藻聚糖硫酸酯含量为2.0％-2.8％，其中岩藻糖含量为75.2％-80.8％，硫酸根含量为55.6％-75.4％。
以上将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。