本发明涉及多糖提取技术领域，具体是一种从海藻中提取活性多糖的方法。
背景技术：
近年来，数量庞大，种类繁多的海洋生物在食品、药物、化妆品和生物材料等领域得到广泛应用，从海洋生物中提取分离生物活性物质己成为天然产物研究的热点。海洋生物最引人注目的是其丰富的药用资源，科学家已从海洋生物中分离和鉴定出多种海洋天然活性物质，其中许多具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗凝血等生物活性作用，为研制开发海洋新药奠定基础。与蛋白质、脂肪、核酸等其他生物大分子相比，糖类具有更强的亲水性。海洋生物通过合成多糖类物质，以保持体内生命活动所需要的自由水分，来适应海洋这个特殊的环境。多糖广泛参与细胞识别、细胞生长、分化、代谢、胚胎发育、细胞癌变、病毒感染和免疫应答等各项生命活动，具有抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、抗突变、抗溃疡、抗氧化、降血糖和降血脂等生物活性，成为现代医学和功能食品工作者共同关注的焦点。海藻多糖是海藻所含的各种高分子碳水化合物，占干重的20 ~ 70%，是海藻的主要成分。20世纪60年代以来，人们逐渐发现海藻多糖具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、活血化癖、抗衰老和保护肌体细胞等，且多数无毒，在开发成为海洋药物方面有较大的潜力。
现在已有很多关于多糖提取的报导，现有技术如授权公告号为CN103497258B的中国发明专利，公开了一种小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其步骤包括 ：预处理、脱脂、多糖提取和粗多糖精制，最后对提取的粗品和纯化后组分的得率、化学组成以及免疫调节活性进行了分析。该小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，是利用水提醇沉法制得小麦麸皮多糖粗品，再利用琼脂糖凝胶柱纯化得到具有免疫调节活性的多糖，其提取方法简单，运行成本低，所得的小麦麸皮粗多糖其得率为 5.0%，经过纯化小麦麸皮活性多糖其得率为5.6%，且具有较强的免疫调节活性。
现有技术如授权公告号为CN103265644B的中国发明专利，公开了一种白僵蚕抗癌活性多糖BBPW-2的制备方法。白僵蚕粉经丙酮 - 石油醚回流脱脂和 80% 乙醇回流除去苷类和生物碱后，用蒸馏水于 80~100℃下提取出粗多糖。粗多糖经 Sevag法去除蛋白质后，用 DEAE 琼脂糖凝胶离子交换层析分离出中性多糖组分，再经丙烯葡聚糖凝胶S-300 层析，取第 2 个洗脱峰，减压浓缩后经丙烯葡聚糖凝胶 S-200 层析进一步纯化，冷冻干燥得到白僵蚕抗癌活性多糖 BBPW-2。该方法制备的产物，纯度均一，分子量为 2.0×10 3 Da，对人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞HepG2的生长均有抑制作用，对正常细胞人胚胎肾细胞 HEK293 和小鼠巨噬细胞 RAW264.7 生长均无不良影响，可用于抗癌产品开发。这两种方法多糖的提取率低，有机溶剂用量大，对环境的污染大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种多糖提取率高，纯度高，活性强，有机溶剂用量较少的从海藻中提取活性多糖的方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
从海藻中提取活性多糖的方法，具体步骤为：
1）脱脂、脱苷：将海藻洗净，粉碎，过筛得到海藻粉末，加入丙酮-石油醚混合液回流脱脂，海藻粉末：丙酮-石油醚混合液体积比为1:10~15，丙酮：石油醚体积比为1：1.2~1:1.6。海藻中油脂在丙酮-石油醚混合液中溶解度大，海藻脱脂率高。抽滤，滤渣中加入乙醇回流，乙醇浓度为85~90%，滤渣：乙醇体积比为1:12~16，抽滤，滤渣烘干。海藻中的苷类和生物碱在乙醇中溶解度高，多糖不溶于乙醇，在除杂的过程中多糖损失率少；
2）酶解：在步骤1最后得到的滤渣中加入蒸馏水，滤渣：蒸馏水体积比:1：25~28。复合酶制剂酶解，复合酶加入量为3~5%，酶解温度为52~56℃，pH为2.7~3.4，酶解时间为2.2~2.7h。复合酶制剂成份及其重量份为：10~20份纤维素酶、10~15份果胶酶、1~3份NaCl、0.001~0.002份焦磷酸钾、0.5~1份硫酸镁、0.004~0.006份聚磷酸铵和0.2~0.8份磷酸二氢钙。上述复合酶制剂酶解纤维素和果胶的效率高，并且酶解充分，对细胞壁的破坏率高。超声波助溶，超声频率为260~320W，超声时间为20~30min。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤，取滤液。酶解将纤维素与果胶水解，破坏细胞壁结构，并且辅以超声波提取，活性多糖从海藻细胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；
3）去蛋白：在滤液中加入Sevage 试剂，Sevage 试剂：滤液体积比为1:3~5，蛋白质在Sevage 试剂中会变性，在水中溶解度下降，搅拌，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇，乙醇浓度为90~98%，上层液体：乙醇体积比为1:3.7~4.5。搅拌，抽滤取滤渣，先用滤渣体积35~40倍的无水乙醇洗涤，再用30~32倍的无水丙酮洗涤，旋蒸干燥得到粗制海藻活性多糖粉末；
4）超滤：粗制海藻活性多糖粉末中加入蒸馏水，超滤，滤膜规格为3500~4000Da，活性多糖分子量大于3500~4000Da，超滤可除去溶于水的小分子杂质。取未滤过液，干燥得到粉末；
5）凝胶层析：粉末中加入蒸馏水，粉末：蒸馏水体积比为1:0.02~0.05，注入 DEAE- 琼脂糖凝胶柱中色谱分离，先用蒸馏水1.2~1.4mL/min冲洗4.2~4.6h，再用0.5MNaCl 以同样流速继续冲洗2.2~2.5h。不同成分分子量大小不同，凝胶层析根据分子量的大小将海藻多糖水溶液中各成分分离开来，采用苯酚 - 硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，对海藻活性多糖进一步分离纯化；
6）去盐、干燥：将洗脱液置于透析袋中透析，滤膜规格为3500~4000Da取未滤过液，将凝胶层析时引入的NaCl除去。减压浓缩，减压浓缩至未滤过液体积的1/100~1/200，冷冻干燥得到活性多糖粉末。得到的活性多糖粉末的纯度很高，活性强，无有机溶剂残留，绿色健康，适合应用到化妆品、医药、食品领域。制备过程中用到的有机溶剂可回收再利用，对环境的污染小。
与现有技术相比，本发明的优点在于：用丙酮-石油醚混合液回流脱脂，用乙醇回流脱苷类和生物碱，进行除杂；复合酶制剂酶解纤维素和果胶的效率高，并且酶解充分，对细胞壁的破坏率高；酶解将纤维素与果胶水解，破坏细胞壁结构，并且辅以超声波提取，焦磷酸钾和聚磷酸铵通过硫酸镁醋精产生意想不到的效果，促进活性多糖从海藻细胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；用Sevage 试剂使蛋白质变性，去除蛋白；采用超滤、凝胶层析和透析对粗制海藻活性多糖粉末进行分离纯化，最后得到的海藻活性多糖纯度很高，活性强，无有机溶剂残留，绿色健康，适合应用到化妆品、医药、食品领域；制备过程中用到的有机溶剂可回收再利用，对环境的污染小；成本低廉，活性多糖经济价值高，适合工厂化生产。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从海藻中提取活性多糖的方法，具体步骤为：
1）脱脂、脱苷：将海藻洗净，粉碎，过筛得到海藻粉末，加入丙酮-石油醚混合液回流脱脂，海藻粉末：丙酮-石油醚混合液体积比为1:10~15，丙酮：石油醚体积比为1：1.2~1:1.6。海藻中油脂在丙酮-石油醚混合液中溶解度大，海藻脱脂率高。抽滤，滤渣中加入乙醇回流，乙醇浓度为85~90%，滤渣：乙醇体积比为1:12~16，抽滤，滤渣烘干。海藻中的苷类和生物碱在乙醇中溶解度高，多糖不溶于乙醇，在除杂的过程中多糖损失率少；
2）酶解：在步骤1最后得到的滤渣中加入蒸馏水，滤渣：蒸馏水体积比:1：25~28。复合酶制剂酶解，复合酶加入量为3~5%，酶解温度为52~56℃，pH为2.7~3.4，酶解时间为2.2~2.7h。复合酶制剂成份及其重量份为：10~20份纤维素酶、10~15份果胶酶、1~3份NaCl、0.001~0.002份焦磷酸钾、0.5~1份硫酸镁、0.004~0.006份聚磷酸铵和0.2~0.8份磷酸二氢钙。上述复合酶制剂酶解纤维素和果胶的效率高，并且酶解充分，对细胞壁的破坏率高。超声波助溶，超声频率为260~320W，超声时间为20~30min。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤，取滤液。酶解将纤维素与果胶水解，破坏细胞壁结构，并且辅以超声波提取，活性多糖从海藻细胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；
3）去蛋白：在滤液中加入Sevage 试剂，Sevage 试剂：滤液体积比为1:3~5，蛋白质在Sevage 试剂中会变性，在水中溶解度下降，搅拌，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇，乙醇浓度为90~98%，上层液体：乙醇体积比为1:3.7~4.5。搅拌，抽滤取滤渣，先用滤渣体积35~40倍的无水乙醇洗涤，再用30~32倍的无水丙酮洗涤，旋蒸干燥得到粗制海藻活性多糖粉末；
4）超滤：粗制海藻活性多糖粉末中加入蒸馏水，超滤，滤膜规格为3500~4000Da，活性多糖分子量大于3500~4000Da，超滤可除去溶于水的小分子杂质。取未滤过液，干燥得到粉末；
5）凝胶层析：粉末中加入蒸馏水，粉末：蒸馏水体积比为1:0.02~0.05，注入 DEAE- 琼脂糖凝胶柱中色谱分离，先用蒸馏水1.2~1.4mL/min冲洗4.2~4.6h，再用0.5MNaCl 以同样流速继续冲洗2.2~2.5h。不同成分分子量大小不同，凝胶层析根据分子量的大小将海藻多糖水溶液中各成分分离开来，采用苯酚 - 硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，对海藻活性多糖进一步分离纯化；
6）去盐、干燥：将洗脱液置于透析袋中透析，滤膜规格为3500~4000Da取未滤过液，将凝胶层析时引入的NaCl除去。减压浓缩，减压浓缩至未滤过液体积的1/100~1/200，冷冻干燥得到活性多糖粉末。得到的活性多糖粉末的纯度很高，活性强，无有机溶剂残留，绿色健康，适合应用到化妆品、医药、食品领域。制备过程中用到的有机溶剂可回收再利用，对环境的污染小。
实施例2：
从海藻中提取活性多糖的方法，最优选步骤为：
1）脱脂、脱苷：将海藻洗净，粉碎，过筛得到海藻粉末，加入丙酮-石油醚混合液回流脱脂，海藻粉末：丙酮-石油醚混合液体积比为1:12，丙酮：石油醚体积比为1：1.4。海藻中油脂在丙酮-石油醚混合液中溶解度大，海藻脱脂率高。抽滤，滤渣中加入乙醇回流，乙醇浓度为88%，滤渣：乙醇体积比为1:15，抽滤，滤渣烘干。海藻中的苷类和生物碱在乙醇中溶解度高，多糖不溶于乙醇，在除杂的过程中多糖损失率少；
2）酶解：在步骤1最后得到的滤渣中加入蒸馏水，滤渣：蒸馏水体积比为1：27。复合酶制剂酶解，复合酶加入量为4%，酶解温度为54℃，pH为3.1，酶解时间为2.5h。复合酶制剂成份及其最优选重量份为：17份纤维素酶、12份果胶酶、2份NaCl、0.002份焦磷酸钾、0.7份硫酸镁、0.005份聚磷酸铵和0.5份磷酸二氢钙。上述复合酶制剂酶解纤维素和果胶的效率高，并且酶解充分，对细胞壁的破坏率高。超声波助溶，超声频率为290W，超声时间为24min。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤，取滤液。酶解将纤维素与果胶水解，破坏细胞壁结构，并且辅以超声波提取，活性多糖从海藻细胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；
3）去蛋白：在滤液中加入Sevage 试剂，Sevage 试剂：滤液体积比为1:4，蛋白质在Sevage 试剂中会变性，在水中溶解度下降，搅拌，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇，乙醇浓度为95%，上层液体：乙醇体积比为1:4.2。搅拌，抽滤取滤渣，先用滤渣体积37倍的无水乙醇洗涤，再用31倍的无水丙酮洗涤，旋蒸干燥得到粗制海藻活性多糖粉末；
4）超滤：粗制海藻活性多糖粉末中加入蒸馏水，超滤，滤膜规格为3500Da，活性多糖分子量大于3500Da，超滤可除去溶于水的小分子杂质。取未滤过液，干燥得到粉末；
5）凝胶层析：粉末中加入蒸馏水，粉末：蒸馏水体积比为1:0.03，注入 DEAE- 琼脂糖凝胶柱中色谱分离，先用蒸馏水1.3mL/min冲洗4.4h，再用0.5MNaCl 以同样流速继续冲洗2.4h。不同成分分子量大小不同，凝胶层析根据分子量的大小将海藻多糖水溶液中各成分分离开来，采用苯酚 - 硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，对海藻活性多糖进一步分离纯化；
6）去盐、干燥：将洗脱液置于透析袋中透析，滤膜规格为3500Da取未滤过液，将凝胶层析时引入的NaCl除去。减压浓缩，减压浓缩至未滤过液体积的1/140，冷冻干燥得到活性多糖粉末。得到的活性多糖粉末的纯度很高，活性强，无有机溶剂残留，绿色健康，适合应用到化妆品、医药、食品领域。制备过程中用到的有机溶剂可回收再利用，对环境的污染小。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。