表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG及其构建方法与流程

本发明涉及基因工程及疫苗制备技术领域，具体地说，涉及一种表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG及其构建方法。

背景技术：

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布氏菌感染引起的一种人畜共患传染病。布氏菌是一种兼性胞内寄生菌，对人和哺乳动物具有高度感染性和致病性。该菌属主要包括羊种、牛种、猪种和犬种等6个生物种，中国流行的主要是前3种，其中以羊种布氏菌感染最常见。布病的传播方式为动物—动物和动物—人群。羊、牛、猪等家畜最易感染，动物感染后可导致生殖器官和胎膜发炎、流产、不育和各种组织病变，极大地增加了向人群传播的几率。人群对布氏菌普遍易感，一般羊种布氏菌对人危害最大。人与病畜及受污染的畜产品接触后，布氏菌可通过消化道、呼吸道、泌尿生殖道、皮肤及眼结膜等途径感染。

近20年来，我国布病疫情日趋严重并由迅速蔓延的趋势。国内外现行的布病疫苗均为减毒活疫苗，这些疫苗普遍存在毒性较大、保护周期较短、无法区分自然感染和疫苗接种等诸多不足，无法满足布病防控的现实需求。因此，新型布病疫苗的研究与开发对于控制布病疫情的蔓延具有重要意义，也是国内外布病研究的热点。现已证实的布氏菌T细胞抗原包括PBP39、L7/L12和Cu-Zn SOD等，这些蛋白及其编码基因已用于布病亚单位疫苗和DNA疫苗的实验研究。

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是目前唯一用于预防结核病的疫苗，在世界卫生组织全球性扩展免疫计划中广泛使用。BCG具有数十年大量安全使用记录、热稳定性好、生产成本低、显著的佐剂效应以及经口服可诱导有效粘膜免疫等特点，同时BCG也是一种极具吸引力的活疫苗载体，利用BCG作为新型疫苗的表达宿主前景诱人。近年来，以BCG为载体的重组BCG疫苗研发日益受到国内外研究学者的关注和重视，针对的病原体涉及细菌、病毒、寄生虫及肿瘤等，具有广阔的发展前景。

目前国内外尚未见有关构建携带羊种布氏菌M5株39kDa胞质结合蛋白PBP39编码基因(P39基因)与核糖体蛋白L7/L12编码基因(L7/L12基因)的融合基因(P39-L7/L12基因)重组BCG的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG及其构建方法。

本发明的另一目的是提供所述rBCG在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种基因表达盒，包含由经过密码子优化的羊种布氏菌P39基因和经过密码子优化的L7/L12基因组成的融合基因。

本发明中，用于组成羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的P39、L7/L12基因均来自于羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)M5菌株(CMCC55009)，且经过密码子优化，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种表达载体，所述表达载体携带有羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的表达盒。

优选地，所述表达载体的出发载体为大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体pMV361。

更优选地，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG，其是将携带有羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因表达盒的表达载体转入BCG中，筛选获得可分泌表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG。

本发明表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG，由以下方法构建获得：

1)根据已公开的羊种布氏菌M5株基因P39和L7/L12的序列，采用Jcat软件进行密码子优化后，人工合成全序列优化后的P39和L7/L12基因，将构建得到的融合基因P39-L7/L12作为目的基因；

2)携带有优化后的羊种布氏菌P39-L7/L12融合基因的重组表达载体的构建：将上述目的基因通过PvuⅡ和BstBⅠ两个酶切位点插入穿梭表达载体pMV361；

3)宿主菌转化：将步骤2)构建得到的重组表达载体转化至BCG中，筛选阳性克隆，即得可分泌表达羊种布氏菌P39-L7/L12融合基因的rBCG。

本发明还提供所述rBCG在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。

本发明还提供由所述rBCG制备的布鲁氏菌病疫苗。

可将本发明所述的rBCG直接作为布鲁氏菌病疫苗使用，或者辅以免疫佐剂，制成布鲁氏菌病疫苗。

本发明具有以下优点：

(一)由布氏菌产生约39kDa大小的胞质结合蛋白PBP39(编码基因为P39)以及布氏菌核糖体蛋白L7/L12(相对分子量大小约为15kDa，其编码基因为L7/L12基因)均为T细胞抗原，能刺激机体产生有效的免疫应答。

(二)BCG(卡介苗)是迄今唯一商品化的预防结核的疫苗，作为外源基因的表达宿主制备的疫苗具有安全性高、热稳定性好、制备简单、价格低廉等优点。

(三)BCG本身具有显著的免疫佐剂效应，因此rBCG疫苗无需添加疫苗佐剂，进一步节约了成本。

(四)BCG也是一种兼性胞内寄生菌，rBCG可以模拟布氏菌感染和胞内寄生的特征，更有效地诱导机体产生免疫应答。

(五)P39-L7/L12融合基因经过密码子优化后，能够提高外源基因在BCG的表达量(经60℃诱导4小时后，表达量可提高50％以上)，解决了因外源基因表达量不高所致的重组BCG免疫效果不佳的难题。

(六)动物实验结果表明，构建的rBCG能够诱导小鼠产生明显的免疫应答。

(七)利用羊种布氏菌P39-L7/L12融合基因制备重组BCG疫苗具有重要的研究意义和潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例2中经优化和未经优化的P39-L7/L12融合基因构建的重组BCG中目的蛋白的SDS-PAGE电泳结果；其中，1：携带未经优化的P39-L7/L12融合基因重组BCG；2：携带经优化后的P39-L7/L12融合基因重组BCG；3：携带经优化后的P39-L7/L12融合基因重组BCG(温度诱导)；4：未转染的BCG；M：蛋白Marker。

图2为本发明实施例3中构建的不同重组BCG对Balb/c小鼠的免疫效果比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1携带有羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的重组表达载体的构建

包括以下步骤：

1、根据已公开的羊种布鲁氏菌M5株基因P39和L7/L12的序列(GenBank:EF189139.1；GenBank:EF173477.1)，采用Jcat软件进行密码子优化后，人工合成全序列优化后的P39-L7/L12融合基因作为目的基因。(融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)。

2、携带有优化后的M5菌株P39-L7/L12融合基因的重组表达载体的构建：将上述目的基因通过PvuⅡ和BstBⅠ两个酶切位点插入穿梭表达载体pMV361。

3、插入正确的重组表达载体的验证。

通过核酸序列测定，证实携带有优化后的羊种布氏菌P39-L7/L12融合基因的重组表达载体构建成功。

实施例2表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG的构建

1、以BCG作为宿主菌，将实施例1中构建的重组表达载体(全序列如SEQ ID NO:2所示)转化至BCG中。

采用电转化方法进行转化，实验条件为：2500V、25μF、1000Ω，电转时间5ms，0.1cm电击杯。电转化反应体系为：质粒3μl(浓度为0.68μg/μl)，感受态BCG菌液100μl(浓度约为1×10¹⁰CFU/ml)。

2、阳性克隆的筛选

电转后，接种到含有50μg/ml卡那霉素的培养基(斜面)上进行阳性克隆筛选。

3、目的基因表达量的检测

将筛选得到的阳性克隆(即重组BCG)接种到液体培养基中进行扩增培养，收集培养上清，SDS-PAGE电泳检测目的基因的表达量。优化后的P39-L7/L12融合基因在温度诱导(60℃诱导4小时)下，表达量明显升高。结果见图1。

实施例3布鲁氏菌病疫苗的效果实验

将重组BCG免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，皮下注射，注射剂量为4×10⁸CFU/只，免疫4周后，检测各组小鼠血清中Th1/Th2型细胞因子的表达情况。实验结果表明，与携带未经优化P39-L7/L12融合基因的重组BCG(rBCG-P39-L7/L12(wild))和未经转化的BCG相比，携带经过密码子优化P39-L7/L12融合基因的重组BCG(rBCG-P39-L7/L12)能够有效地诱导IL-2、IL-12和IFN-γ等Th1型细胞因子的产生。(图2)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 内蒙古医科大学

<120> 表达羊种布氏菌P39和L7/L12融合基因的rBCG及其构建方法

<130> KHP161118993.5

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggccccgg tggccaacgc ccaggagaag cagaacgtgg aggtgctgca ctggtggacc 60

tcgggcggcg aggcctcggc cctggaggtg ctgaagaagg acctggagtc gaagggcatc 120

tcgtggaccg acatgccggt ggccggcggc ggcggcaccg aggccatgac cgtgctgcgc 180

gcccgcgtga ccgccggcaa cgccccgacc gccgtgcaga tgctgggctt cgacatccgc 240

gactgggccg agcagggcgc cctgggcaac ctggacaccg tggcctcgaa ggagggctgg 300

gagaaggtga tcccggcccc gctgcaggag ttcgccaagt acgacggcca ctggatcgcc 360

gccccggtga acatccactc gaccaactgg atgtggatca acaaggccgc cctggacaag 420

gccggcggca aggagccgac caactgggac gagctgatcg ccctgctgga caacttcaag 480

gcccagggca tcaccccgat cgcccacggc ggccagccgt ggcaggacgc caccatcttc 540

gacgccgtgg tgctgtcgtt cggcccggac ttctacaaga aggccttcat cgacctggac 600

ccggaggccc tgggctcgga caccatgaag caggccttcg accgcatgtc gaagctgcgc 660

acctacgtgg acgacaactt ctcgggccgc gactggaacc tggcctcggc catggtgatc 720

gagggcaagg ccggcgtgca gttcatgggc gactgggcca agggcgagtt cctgaaggcc 780

ggcaagaagc cgggcgagga cttcgtgtgc atgcgctacc cgggcaccca gggcgccgtg 840

accttcaact cgggcatgtt cgccatgttc aaggtgtcgg aggacaaggt gccggcccag 900

ctggagatgg cctcggccat cgagtcgccg gccttccagt cggccttcaa cgtggagaag 960

ggctcggccc cggcccgcac cgacgtgccg gacaccgcct tcgacgcctg cggcaagaag 1020

accatcgccg acgtgaagga ggccaactcg aagggcaccc tgctgggctc gatggcccac 1080

ggctacgcca acccggccgc cgtgaagaac gccatctacg acgtggtgac ccgccagttc 1140

aacggccagc tgtcgtcgga ggacgccgtg aaggagctgg tggtggccgt ggaggccgcc 1200

aagatggccg acctggccaa gatcgtggag gacctgtcgg ccctgaccgt gctggaggcc 1260

gccgagctgt cgaagctgct ggaggagaag tggggcgtgt cggccgccgc cccggtggcc 1320

gtggccgccg ccggcggcgc cgccccggcc gccgccgccg aggagaagac cgagttcgac 1380

gtggtgctgg ccgacggcgg cgccaacaag atcaacgtga tcaaggaggt gcgcgccctg 1440

accggcctgg gcctgaagga ggccaaggac ctggtggagg gcgccccgaa ggccgtgaag 1500

gagggcgcct cgaaggacga ggccgagaag atcaaggccc agctggaggc cgccggcgcc 1560

aaggtggagc tgaagtaa 1578

<210> 2

<211> 6023

<212> DNA

<213> 重组表达载体

<400> 2

gctagcaaca aagcgacgtt gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca caagataaaa 60

atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca aggggtgtta 120

tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg 180

ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct 240

atcgcttgta tgggaagccc catgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg 300

ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc 360

ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga 420

tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg 480

ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt 540

ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg 600

ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag 660

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ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg 780

gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc 840

cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat 900

tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaatcaga attggttaat tggttgtaac 960

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tgctgagttg aaggatcaga tcacgcatct tcccgacaac gcagaccgtt ccgtggcaaa 1080

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tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 1980

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ctgcaactcc cggtgcaacc ttgtcccggt ctattctctt cactgcacca gctccaatct 2220

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cgcgacgtag aggcgctgac gcctgaggag ctggacatcg tcgccgctga gatcttcgag 3180

cactaccgga tcgcggcata catcctggcg tggacgagcc tccggttcgg agagctgatc 3240

gagcttcgcc gcaaggacat cgtggacgac ggcatgacga tgaagctccg ggtgcgccgt 3300

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cgtcctgtga cggttccgcc tcacgtcgcg gagatgatcc gagcgcacat gaaggaccgt 3420

acgaagatga acaagggccc cgaggcattc ctggtgacca cgacgcaggg caaccggctg 3480

tcgaagtccg cgttcaccaa gtcgctgaag cgtggctacg ccaagatcgg tcggccggaa 3540

ctccgcatcc acgacctccg cgctgtcggc gctacgttcg ccgctcaggc aggtgcgacg 3600

accaaggagc tgatggcccg tctcggtcac acgactccta ggatggcgat gaagtaccag 3660

atggcgtctg aggcccgcga cgaggctatc gctgaggcga tgtccaagct ggccaagacc 3720

tcctgaaacg caaaaagccc ccctcccaag gacactgagt cctaaagagg ggggtttctt 3780

gtcagtacgc gaagaaccac gcctggccgc gagcgccagc accgccgctc tgtgcggaga 3840

cctgggcacc agccccgccg ccgccaggag cattgccgtt cccgccagaa atctagacgg 3900

tgaccacaac gacgcgcccg ctttgatcgg ggacgtctgc ggccgaccat ttacgggtct 3960

tgttgtcgtt ggcggtcatg ggccgaacat actcacccgg atcggagggc cgaggacaag 4020

gtcgaacgag gggcatgacc cggtgcgggg cttcttgcac tcggcatagg cgagtgctaa 4080

gaataacgtt ggcactcgcg accggtgagt cgtaggtcgg gacggtgagg ccaggcccgt 4140

cgtcgcagcg agtggcagcg aggacaactt gagccgtccg tcgcgggcac tgcgcccggc 4200

cagcgtaagt agcggggttg ccgtcacccg gtgacccccg gtttcatccc cgatccggag 4260

gaatcacttc gcaatggcca agacaattgc ggatccagct ggccacatgg ccccggtggc 4320

caacgcccag gagaagcaga acgtggaggt gctgcactgg tggacctcgg gcggcgaggc 4380

ctcggccctg gaggtgctga agaaggacct ggagtcgaag ggcatctcgt ggaccgacat 4440

gccggtggcc ggcggcggcg gcaccgaggc catgaccgtg ctgcgcgccc gcgtgaccgc 4500

cggcaacgcc ccgaccgccg tgcagatgct gggcttcgac atccgcgact gggccgagca 4560

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ccactcgacc aactggatgt ggatcaacaa ggccgccctg gacaaggccg gcggcaagga 4740

gccgaccaac tgggacgagc tgatcgccct gctggacaac ttcaaggccc agggcatcac 4800

cccgatcgcc cacggcggcc agccgtggca ggacgccacc atcttcgacg ccgtggtgct 4860

gtcgttcggc ccggacttct acaagaaggc cttcatcgac ctggacccgg aggccctggg 4920

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ggccatcgag tcgccggcct tccagtcggc cttcaacgtg gagaagggct cggccccggc 5280

ccgcaccgac gtgccggaca ccgccttcga cgcctgcggc aagaagacca tcgccgacgt 5340

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gtaattcgaa gcttatcgat gtcgacgtag ttaactagcg tacgatcgac tgccaggcat 5940

caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcc 6000

ggccatcatg gccgcggtga tca 6023