东方巴贝斯虫1‑脱氧‑D‑木桐糖‑5‑磷酸还原异构酶基因及其编码的蛋白的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一个新基因及其重组蛋白，具体是指东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶(bodxr)基因及其编码的重组蛋白，本发明还涉及重组蛋白的应用。

背景技术：

巴贝斯虫病又称梨形虫病、蜱热或德克萨斯热等，是由巴贝斯属的多种蜱传性，红细胞内寄生的原虫引起的。临床上主要引起多种脊椎动物的发热、血红蛋白尿、溶血性贫血和死亡。该病原属于顶复门，梨形虫纲，巴贝斯科，巴贝斯属的巴贝斯虫，最早于1888年，victorbabes在患有血红蛋白尿和红色水热症状的牛红细胞内发现的该类微生物。

目前，全世界大约有一半的养牛产业受到巴贝斯虫的威胁，给热带和亚热带国家的畜牧业造成了严重的经济损失。根据目前研究报告在我国南方的湖北、福建、江西、安徽、浙江、湖南、广西、云南、贵州等省份，引起水牛发病的主要是东方巴贝斯虫。该寄生虫具有严格地宿主特异性，仅感染水牛。它的传播媒介(镰形扇头蜱)是一种三宿主蜱，一年发生一代，可经卵传播东方巴贝斯虫。东方巴贝斯虫病主要在夏秋季节爆发，给畜牧业造成重大地经济损失。

综合以上可看出，一旦某区域成为疫区，东方巴贝斯虫病便难以根治和清除，因此要控制该病的传播和流行，诊断和疫苗尤为重要。到目前为止，东方巴贝斯虫病的检测没有诊断试剂盒。因而筛选、鉴定具有良好免疫原性和反应原性的东方巴贝斯虫抗原便是解决途径之一。

已知哺乳动物合成生命所需的类异戊二烯化合物采用的是甲羟戊酸途径，而东方巴贝斯虫合成类异戊二烯生物采用的是非甲羟戊酸途径，与哺乳动物的合成途径不一样，因而在东方巴贝斯虫体内克隆出1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶基因，构建原核表达载体，制备出多克隆抗体，筛选、鉴定出具有良好免疫原性和反应原性的东方巴贝斯虫抗原，对运用于临床检测东方巴贝斯虫病的感染情况具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是从东方巴贝斯虫中获得1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因。

本发明的第二个目的是将所述东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因在大肠杆菌表达系统中高效表达获得重组蛋白。

本发明的第三个目的是提供上述重组蛋白在制备东方巴贝斯虫病检测试剂盒中的用途。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

(1)东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因的获得：利用聚合酶链式反应(pcr)的方法，分别以东方巴贝斯虫全基因组和总rna反转录成的cdna为模板，经pcr得到1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶目的片段，其全基因核苷酸序列的开放阅读框(orf)如序列表seqidno：1所示。

(2)编码了所述1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因的重组蛋白，其氨基酸序列如序列表seqidno：2所示。

(3)所述重组蛋白的制备方法为：将序列表seqidno：1所示的东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶开放阅读框(orf)与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pe32a-bodxr，电转化至bl21(de3)中，抗生素氨苄青霉素筛选高抗性的转化子，并用0.2mmol/liptg于37℃诱导4h。收集上述iptg诱导表达的菌液，对其进行分离纯化的蛋白即为编码了1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因的重组蛋白。

(4)重组蛋白纯化处理：按上述方法诱导表达1000ml菌液，将表达的菌液转移到离心管于4℃条件下8000r/min离心10min集菌。取30mlbuffera(ph7.8)(tris.base50mmedta0.5mmnacl50mm甘油5％dtt5mm)重悬菌体沉淀后，使用压力破碎仪破碎3次；4℃，10000r/min离心5min，弃上清，收集沉淀，用pbs洗涤三次后，用包涵体纯化的方法提取蛋白。

(5)多克隆抗体的制备：为制备bodxr重组蛋白的抗血清，以纯化好的重组蛋白免疫5只4周龄的健康spf昆明小鼠，免疫之前断尾采取血液0.5ml作为阴性对照，首次免疫将纯化好的100ug重组蛋白与完全弗氏佐剂乳化后，皮下注射，每只小鼠注剂量为200ul，在首次免疫后第14，21，28天分别以50ug纯化蛋白与不完全弗氏佐剂乳化后皮下多点注射加强免疫，在最后一次免疫后第7天采集抗血清。

(6)本发明获得的重组蛋白具有生物活性，具有良好的反应原性。以制备的多克隆抗体为一抗，然后分别以东方巴贝斯的全虫抗原虫和健康的水牛红细胞反应为抗原，hrp标记的羊抗鼠igg为二抗进行westernblot分析，检测重组表达蛋白的反应原性，结果显示仅东方巴贝斯虫全虫抗原有特异性的反应带，健康水牛红细胞无反应，所以制备的重组蛋白可用来有效地检测东方巴贝斯虫病。

本发明的有益效果：

本发明涉及的编码的东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶的重组蛋白可有效检测感染水牛血液中的东方巴贝斯虫病抗原的存在，具有良好的反应原性，有助于控制水牛的巴贝斯虫病在我国的流行和传播。

附图说明

图1为东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶基因扩增电泳图。1：从东方巴贝斯虫gdna中扩增到目的基因；2：从东方巴贝斯虫cdna中扩增到目的基因；3：阴性对照m：dna分子量标准。

图2为发明重组质粒的pcr扩增电泳图。所用引物是载体上的通用上游引物t7和目的基因的下游引物bodxr-r2，1、2为挑取的两个阳性克隆子扩增后的目的片段；m：dna分子量标准。

图3为本发明重组质粒双酶切产物电泳图。1、2均为使用bsaixhoi(购自neb生物公司)表达引物扩增产物酶切后的目的片段；m：dna分子量标准。

图4为东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶的重组表达产物定性分析的sds-page电泳结果。1、3：未iptg诱导的pet32a-bodxr表达产物；2、4：诱导的pet32a-bodxr；m：蛋白质分子质量标准。

图5为东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶的重组表达产物的sds-page电泳结果，图5a为可溶性分析sds-page电泳结果，图5b为纯化产物的sds-page电泳结果。1：未经iptg诱导的pet32a-bodxr表达产物；2：经iptg诱导的pet32a-bodxr表达产物；3：表达菌裂解液的上清；4：表达菌裂解液的包涵体；5：纯化后的重组表达产物；m：蛋白质分子质量标准。

图6为东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶重组蛋白的westernblot鉴定。6a鉴定bodxr的正确表达；6b鉴定制备的多克隆抗体的质量；6c和6d鉴定体内和体外的bodxr蛋白表达形式是一样的；1：bodxr未经iptg诱导；2：纯化后的rbodxr蛋白；3：b.orientalis裂解物；4：水牛健康红细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因的克隆

1：东方巴贝斯虫的纯化及全虫抗原的提取

东方巴贝斯虫的纯化：将新鲜收集的染虫红细胞(染虫率约5～10％)装入一灭菌的含edtak抗凝剂的无rnase的离心管中，细胞间转移到15ml离心管中，3000rpm离心6min，去除上清与表面的白色絮状物(白细胞)；加入血细胞3倍体积的1xpbs，混匀，3000rpm离心6min，去除上清，重复此操作2次直至上清为无色透明；然后加入5倍体积的红细胞裂解液，混匀，室温静置5min，12000rpm离心5min，去上清，收集沉淀。向沉淀中加入3倍体积的1xpbs，混匀后，用5ml注射器反复吹打10次，然后用灭过菌的2um的滤器过滤溶液，过滤后，12000rpm离心5min，收集沉淀，重复此步骤直至上清无色透明；沉淀用灭菌的无rnase的pbs洗一次，加入1/10体积的灭菌无rnase的pbs溶液，此即为纯化的无白细胞的东方巴贝斯虫体。

全虫抗原的提取：向上步获得了虫体中加入1/10体积的rapi细胞裂解液，然后超声破碎30min后，12000rpm离心20min,上清即为得到的全虫抗原。

2：东方巴贝斯虫全基因组的提取

取200μl加了新鲜采集的含抗凝剂的东方巴贝斯血液置于1.5ml聚丙烯离心管中，按照天根血液基因组dna提取试剂盒说明书进行提取，提取的全基因组保存于-20度。3：东方巴贝斯虫总rna的提取

所有提取rna用的器皿均用0.1％depc水处理，150℃烘烤3h；塑料器皿经0.1％depc水浸泡过夜，121℃高温高压灭菌30min；金属用具经1mol/l的naoh浸泡2h，经0.01％的depc水彻底冲洗后，37℃烘干；各试剂用无核糖核酸酶(ribonuclease,rnase)的0.01％depc水配置。取400μl东方巴贝斯虫全血提取rna。总rna抽提按trizol试剂的说明书进行。提取的总rna样品冻存于-80℃，备用。

4：东方巴贝斯虫总cdna的合成

使用北京全式金公司的反转录试剂盒，以提取的东方巴贝斯虫总rna为模板进行反转录，具体操作步骤为：

①第一条链cdna合成和gdna去除

anchoredoligo(dt)18引物0.5ug/ul)1ul

总rna4ul

无rna酶的水dh2o3ul

混匀后，在pcr仪上进行下列条件的变性、退火反应：

65℃5min冰上冰浴2min

②在上述microtube管中配制下列反转录反应液。

2xesreactionmix10ul

easyscriptrt/rienzymemix1ul

gdnaremover1ul

③混匀后，在pcr仪上按下列条件进行反转录反应：

42℃30min

↓

85℃5min

↓

处理后，冰上放置。

反转录所得的cdna放-20保存备用。

5：东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶的克隆及序列分析

1)引物设计

据ncbi/genbank上已提交的已知顶复门寄生虫的1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶(dxr)序列信息，根据1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶序列的保守性，运用blastp的方法，在东方巴贝虫基因组数据库中用得到同源性最高的一段序列，然后用clonemanager软件分别在cdna序列开放阅读框(orf)的上下游区域，设计对引物(bodxr-f1，bodxr-r1)；

bodxr-f1:5’-atgaatgcagcagtgagtttttatg-3’

bodxr-r1：5’-ttagtatgtgaagcattaatatatgtgatag-3’。

2)pcr扩增：分别以东方巴贝斯虫gdna和cdna为模板进行pcr扩增，反应体系为25μl，pcr反应体系如下：

pcr反应条件：反应条件为94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，68℃1min50sec；68℃10min；34个循环周期。

3)pcr产物鉴定：扩增完成后，取pcr产物8μ加上2ul的6×核酸上样缓冲液点样，0.8％琼脂糖凝胶，1×tae缓冲液，120v，电泳20分钟观察结果，结果显示用gdna扩增得到的目的带和用cdna扩增得到的目的带不一样，说明该基因含有内含子(见图1)。

4)按照北京全式金dna琼脂糖凝胶回收试剂盒的说明书，分别对扩增到的gdna和cdna进行切胶回收。

5)目的基因的克隆、筛选与测序

取peasy-blunt载体1μl(50ng/ul)与胶回收的目的片段4μl混合于pcr管中，于pcr仪器中25度反应20min，取5μl连接产物，无菌条件下加入到50ul大肠杆菌trans1-t1感受态细胞中，用移液器温和吹打混匀，冰浴放置30min，42℃水浴，热激90s，之后立即冰浴2min使之冷却，注意不要晃动。然后向感受态中加入500μl预热至37℃的lb培养液，180rpm37℃温和振荡45min，使细菌恢复抗药性。恢复抗药性后，5000rpm离心3min，超净台弃部分上清，留100ul上清重悬沉淀，取80ul重悬液向含氨苄青霉素(amp)(100μg/ml)的lb琼脂平板上均匀涂布，37℃正置半小时后，倒置平皿继续于37度培养10h，待肉眼看到单个白色菌落可挑菌。挑取两个菌落接种于含100μg/mlamp的lb培养液中，剧烈振摇(180rpm)10～12h后，用载体上的通用引物扩增目的基因，pcr鉴定为阳性的克隆，取菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序分析，结果显示用gdna扩增得到的片段长度为1554bp用cdna扩增得到片段长度为1371bp，cdna扩增到的目的基因经分析，有完整的开放阅读框(orf)，其开放阅读框的序列如序列表seqidno：1所示的序列。

序列号：seqidno：1

序列长度：1371bp

序列类型：cdna

来源：东方巴贝斯虫

序列特征：有正确的开放阅读框(orf)：1371bp；决定位置：起始、终止密码子存在位置：atg，1位；tga，1371位。

6)上述步骤5所得序列orf全长1371bp，编码蛋白质具有如序列表seqidno：2所示的氨基酸序列。该蛋白质含有456个氨基酸，分子量为50kd。利用美国国家生物技术信息中心(ncbi，nationalcenterforbiotechnologyinformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的blast(basiclocalalignmentsearchtool)软件对所测氨基酸序列进行分析。用dnastar软件包里的megalign软件，通过clustalw方法比较的不同物种之间核苷酸序列相似度。结果表明获得了东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶的全长orf编码区序列。

实施例2：重组原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的诱导表达

1)用同源重组的方法设计1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶的表达引物：

根据1-脱氧-d-木桐糖-5-磷酸还原异构酶基因的orf序列设计表达引物(bodxr-f2，bodxr-r2)，上游引物前面加入用于扩增pet32a目的基因的下游引物的反向互补序列作为同源臂，下游引物加入加入用于扩增pet32a目的基因的上游引物的反向互补序列作为同源臂。具体如下：

bodxr-f2:5’gccatggctgatatcggatccatggttggaaaccaccgc3’

bodxr-r2:5’gtggtggtggtggtgctcgagtcactttcgaccactgatgc3’

pet32af:ctcgagcaccaccaccaccac

pet32ar:ggatccgatatcagccatggc

2)重组表达质粒的构建

用表达引物(bodxr-f2，bodxr--r2)对重组质粒peasy-blunt-bodxr进行pcr扩增，获得目的片段，同时用(pet32afpet32ar)引物扩增表达载体pet32a，pcr反应，跑dna胶获得目的基因.使用北京全式金dna琼脂糖凝胶回收试剂盒进行目的片段的回收。分别用分光光度计测回收产物的浓度。结果显示：pet32a的回收浓度为50ng/ml，cdnabodxr目的基因的回收产物浓度为45ng/ml，根据vazyme公司onestepcloningkit说明书，对目的片段与载体片段进行连接。

(1)连接程序

37℃作用30min

(2)连接体系

3)转化

连接结束后，连接产物放置冰上5min，然后取10ul连接产物加入到100ul大肠杆菌dh5a感受态中，用移液器温和吹打混匀，冰浴放置30min。42℃水浴，热激90s，之后立即冰浴2min使之冷却，注意不要晃动。转移菌液至装有500μl预热至37℃的lb培养液中，180rpm37℃温和振荡45min，使细菌恢复抗药性，取150μl菌液涂布于含有氨苄青霉素(amp)(100μg/ml)的lb琼脂平板上。倒置平皿于37℃恒温培养箱培养12～16h，挑单个菌落接种于含180μg/mlamp的lb培养液中，剧烈振摇(230rpm)10～12h后鉴定。同时转化未加入任何外源基因的pet32a空质粒载体作为对照。

4)阳性克隆子鉴定

使用载体上游的通用引物和目的基因的下游引物鉴定阳性克隆子是否正确插入。

取1ul菌液做pcr，反应体系为25ul，如下：

pcr反应条件：反应条件为95℃5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min40sec；72℃10min；35个循环周期。

pcr结束后，跑琼脂糖凝胶电泳，结果显示(如图2)，对pcr鉴定为阳性的菌液，复苏摇菌5ml，37度继续摇菌8h,然后按照北京全式金生物有限公司提取质粒的试剂盒说明书的操作来提取质粒，用分光光度计测质粒的浓度，结果为170ng/ml然后用bsaixhoi(neb公司)酶再进行双酶切鉴定。

酶切体系为：bsai1ul

37℃作用1h后跑dna胶进行鉴定。结果显示酶切除两条预期大小的带，分别是5755bp和1482bp(如图3)。

扩增为阳性的克隆子，取菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司，进行测序分析，得到1371bp的cdna序列进行序列比对，说明已成功构建原核重组表达质粒pet32a-bodxr。

5)pet32a-bodxr表达载体的构建和小量诱导

将pet32a-bodxr-dh5a质粒(1μl)无菌条件下转化到大肠杆菌bl21感受态细胞(100μl)中，具体操作方法如上步奏3)。挑取两个pet32a-bodxr/bl21(de3)单克隆菌落加入含有amp的5mllb培养基中，37℃，180rpm培养至8h左右，然后1:100转接到含有amp的4mllb中，继续37℃，180rpm培养3h左右，至od600为0.5左右，从每个瓶子取2ml置一个新的摇菌瓶不加诱导剂，另2ml加入0.8mmol/liptg都继续于37℃诱导3h，然后12000rpm离心2min收集菌体，每管加入40ulddh2o10ul1m的dtt.50ul2xsds上样缓冲液，于沸水煮约10min左右，当蛋白由粘稠变为流体状即为完全变性，然后迅速放到冰上冰浴5min，随其跑sds-page胶鉴定是是否表达，结果显示重组bodxr在大肠杆菌中成功表达(如图4)。

6)重组蛋白的表达产物的可溶性分析

复苏步骤4)成功表达的菌液，按上述方法诱导表达菌液，取1.5ml于8000r/min离心2min收集菌体，用500μlpbs溶液重悬菌体，再次离心集菌，反复洗涤菌体2-3次，以去除培养基残液。

将每管500μl菌体溶液置于冰水混合物上用超声破碎仪进行破碎，15s/次，间隔30s，每管破碎8-10次，直至液体澄清具有透光性。

将已破碎好的样品于4℃条件下12000r/min离心10min。取40μl上清溶液至1.5mlep管中，加入50μl2×sds上样缓冲液，以及10μldtt溶液，涡旋混匀；将沉淀中加入40μl灭菌ddh2o，50μl2×sds上样缓冲液，以及10μldtt溶液，充分涡旋混匀。将所有样品在沸水中煮10min，之后立即转入冰上静置5min。处理之后的样品经sds-page电泳检测观察结果。经分析，蛋白在沉淀中表达.如图5a。

7)表达产物的大量纯化和提取

bodxr重组蛋白的纯化提取：将大量诱导表达的细菌培养物(500ml)用500ml离心管于4℃条件下8000r/min离心10min。细菌沉淀用50mlpbs重悬后，用超声破碎仪破碎至液体澄清；4℃，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用30mlpbs重悬，12000r/min心10min，反复洗涤三次，最后一次向沉淀中加入19.7ml的buffera,300ul20％skl(十二烷基肌氨酸钠)，100ul1mdtt，振荡器剧烈搅动，使其溶解。室温静置2h，4℃，12000r/min离心20min，上清转移至一个干净的离心管，向上清中加入20％peg4000210ul，50mm氧化型谷胱甘肽420ul和100mm还原型谷胱甘肽420ul，室温复苏2h，然后把上清放入透析袋中放到pbs中透析2天，透析后得到的蛋白，用蔗糖浓缩。浓缩后跑胶鉴定结果如图5b数字5显示的结果。

实施例3：多克隆抗体的制备

(1)bca法测定蛋白浓度：取5mg/ml蛋白标准品10μl加入到90ulpbs标准稀释液中，稀释至终浓度为0.5mg/ml的标准蛋白；将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl；分别把样品用pbs20倍、10倍5倍，1倍稀释到96孔板的样品孔中至终体积为20μl；各孔加入200μlbca工作液，37℃放置30min；测定a562。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

(2)购买5只健康的spf级别的昆明小鼠，在初次免疫之前断尾采血作为阴性血清。

(3)制备鼠源的多克隆抗体：初次免疫剂量为每只昆明小鼠注射100ug弗氏完全佐剂乳化的蛋白,接种量为200ul，注射部位在背部和腹部皮下多点注射；再次免疫：初次免疫后14d左右，剂量为200ul/只(重组蛋白含量50ug)，加弗氏不完全佐剂。注射部位在背部和腹部皮下多点注射；第三次免疫，在第二次免疫后14d进行，注射剂量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d断尾采些许血，用于检测抗体效价，第四次免疫在第三次免疫后7d进行，第四次免疫后7天收集血液，分离血清，保存负20度。

实施例4：重组蛋白反应原性的鉴定

将纯化后的重组蛋白先进行sds-page电泳，根据目的蛋白带的大小，对照蛋白marker的相应位置，将电泳完成的sds-page凝胶切割成所需大小，清水稍作漂洗；按照凝胶的尺寸裁剪6张相同大小的滤纸和1张pvdf膜，将滤纸浸泡于电转缓冲液中5min，将pvdf膜先与甲醇溶液中浸泡15s，用清水漂洗后，浸泡于电转缓冲液中5min；在电转仪负极板上依次放置3张滤纸，sds-page凝胶，pvdf膜和剩余3张滤纸，完全对齐，在制作电转三明治的每一步都需用玻璃棒轻轻将气泡移除；小心盖上电转仪正极板，计算电转面积，电转仪调至稳流，按1ma/cm2进行电转，电转的时间取决于目的蛋白的分子大小；电转后的pvdf膜用tbst溶液快速漂洗两次，用5％脱脂奶粉室温封闭1-2h或4℃封闭过夜；吸干pvdf膜上的封闭液，用tbst漂洗5次，每次3min，然后将一抗进行适当稀释，室温作用1-2h或4℃过夜孵育；将pvdf膜置于一个新的无菌平皿中，用pbst漂洗5次，每次5min；将二抗适当稀释(一般为1：1000)，室温作用1h，用pbst漂洗5次，每次5min；将pvdf膜进行dab显色或者ecl化学发光显色，观察目的蛋白大小处的显色情况，如图6a/6b/6c/6d。

数字1代表的是上的样品是未经ipig诱导的重组pet32a-bodxr菌液裂解物；数字2代表的是经iptg诱导的重组pet32a-bodxr菌液蛋白提取物；数字3代表的是经处理的东方巴贝斯全虫抗原；数字4代表的是水牛健康红细胞。

图6a一抗为鼠源的his-tag，二抗为羊抗鼠igg多克隆抗体。

图6b/6c/6d一抗为用重组蛋白pet32a-bodxr制备的鼠源多克隆抗体,二抗为羊抗鼠igg多克隆抗体。

westernblot结果表明，纯化后的重组蛋白bodxr在68kda与东方巴贝斯虫全虫抗原有特异性反应，但与健康红细胞无反应(见图6c和6d)。说明体外表达的蛋白于东方巴贝斯虫体内天然表达蛋白一致。

<110>华中农业大学

<120>东方巴贝斯虫1-脱氧-d-木桐糖-5磷酸还原异构酶基因及其编码的蛋白

<160>3

<210>1

<211>1371

<212>cdna

<213>东方巴贝斯虫（babesiaorientalis）

<400>1

atggttggaaaccaccacaggggctccattttatatatgtggtgtgcagtgtcgctggtg60

gcactgccgcaaaccaccggatttcgatactctcccaatactagtccatcgttgagaagc120

agacctttattggcgaatcctataaaggtggctgttattgggagcactggaagcattggg180

actcagaccctggatattatacgccgcatcaataatacagctgatgaacctaaattcaag240

gttgtcgctttaacagccaatcgtgacatttctggtttagcgaagctagcagcagaattt300

acgccccacattttgaatattaattatggtggtgaggaactccggcaaactgtgccaaat360

agctgcgacattaccactgggaaagagggcgtcttaaacatttgtaaatccttcgacttt420

gacttgttggtaatggggatatcgggctgtgctggcatagaaccaaccatcgcagcagca480

caatccggtaaaaggatggcgttagctaacaaagaatctgtggtatctgcagggagcctg540

ttgcgaaaggccatcaacaaaagtaaatgcgagcttattcctattgactccgagcacaat600

gcaatataccaatgtcttacgtcatctgcacgtgatttgttagagcaaacaaaattgaga660

gatacgaggcccttgtgtggtatttctaaaaacgttttagattcagtaaaacgccttatc720

atcaccagcagtggtggtccgtttagagatacaaacccgtcgttgatgaagacattgcgc780

ctaaaggatgctcttaagcatcctgtttggagtatgggtgctaaaataaccattgactcg840

tccaccatgatgaacaagggattagaggtaatagaggctcacgaactgttcgggatccca900

tatgatagtataaaagtactcattcacaaggaatgtatcgtacattcaatggtgcaattt960

gttgataactcggttctggcacaattatacaaccctgatatgaggctcccaatagcatat1020

gcactcaactggccggacaggcttgctaataccttacaagaattgaacctcgttgaacag1080

acgcttactttcgctgatcctgacttacagaagtttccttgccttaaattggcttatgaa1140

gttgggaagatgggaggactctaccccacagttttaaatgctgcaaatgagcaggcaaat1200

gaactactaaggcgcgatgcaattgcacattgtgaaatatacgatcttgtaaagcgtgca1260

attgatgctttccaacatccaagtattagccaacctggcattaaggatataatggaagcc1320

gatagctggggaaagaaacatgtgatggactgcatcagtggtcgaaagtga1371

<210>2

<211>456

<212>rna

<213>东方巴贝斯虫（babesiaorientalis）

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