一种糖尿病分型试剂盒的制作方法

本发明涉及疾病辅助诊断，特别涉及一种糖尿病分型试剂盒。

背景技术：

随着近年来生活条件的提高，糖尿病的发病率越来越高，占总人口的比重大。根据国际糖尿病联盟(idf)统计指出，2011年全球糖尿病患者已达到3.7亿人，其中80％的糖尿病患者分布在发展中国家；预计到2030年，全球的糖尿病患者将会有近5.5亿人。作为人口大国的国家，我国患有糖尿病的人数在过去的20年里升髙了3倍。如果按照这种趋势发展，中国将有可能成为世界上患有糖尿病人数最多的国家。而糖尿病带来的并发症的致残、致死率，会产生巨大的医药开支，不仅增加了对人们经济的负担，更是给社会带来极大的挑战。1999年who把糖尿病分为ⅰ型糖尿病，ⅱ型糖尿病，妊娠糖尿病和特殊糖尿病。其中ⅱ型糖尿病是最常见的糖尿病类型，在国内占糖尿病患者人群的90％以上。对于ⅱ型糖尿病，发病机理还不是很透彻，传统上主要是认为有胰岛素阻抗和胰岛素分泌相对不足的病因，所以ⅱ型糖尿病又划分为胰岛素阻抗型和胰岛素相对分泌不足型。

随着分子病理医学的发展，现在新观点认为ⅱ型糖尿病根据其表现的病理症状可以分为5大类病因，分别为：胰岛素原合成障碍，胰岛素转化障碍，胰岛素分泌出胰岛β细胞功能障碍，胰岛素与靶细胞效应阻抗以及全身性的多器官功能退化障碍。

同样是“糖尿病”，分型不同，接受的治疗及康复方案可能完全不同。比如，同时出现α细胞和β细胞缺陷的患者，对低血糖非常敏感，需要严格的血糖药物控制；后天形成的胰岛素高阻抗(胰岛素正常)患者则有条件尝试非药物控制血糖。了解糖尿病人患病机制，就能根据病情个性化治疗、量身定制康复方案，因此，对患者进行糖尿病分型对其治疗方案及药物选择具有举足轻重的作用。

在过去相当长的一段时间里，通常采用传统的分型方法，然而传统的ⅱ型糖尿病分型方法无法区分这些病理病因，无法很全面用一个技术检测ⅱ型糖尿病的多个方面的分子病理病因，由于缺乏精准分型的认知和工具，很多糖尿病人治疗只能通过“试错法”来不断尝试可能的有效途径。治疗过程出现效果差、并发症严重、病程周期长的情况，甚至由于误用药物，透支机体整体健康，导致病情恶化，出现“越治越差”的现象。给糖尿病人身心带来无尽的痛苦。另外传统的分型方法主要通过口服葡萄糖耐量试验(ogtt)、葡萄糖钳夹技术、血清血糖相关和胰岛素相关的标志物的生化测量，通常这些检测需要耗费很长时间(一般需要1-2个月)，而且还要复查。除此之外，现有的分型技术步骤繁琐，对操作人员技术要求高，而且耗时耗人力，成本非常高，无法在普通医院或社区医院进行推广。

因此，研发一种能对ⅱ型糖尿病精准分型、快速分型的糖尿病分型产品是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供的一种糖尿病分型试剂盒能有效解决当前对ⅱ型糖尿病分型费时费力，分型不全面的技术缺陷。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

人类全基因组中hnf1b基因、pdx1基因、pax6基因、madd基因、nkx2-2基因、insr基因、srr基因、nd1基因和srit1基因中一种或多种在制备糖尿病分型产品中的应用。

其中，hnf1b基因编码的肝细胞核因子-1β是对胰腺细胞形成有重要作用的转录因子；pdx1基因能够编码与胰腺发育相关的关键转录因子，参与胰岛β细胞的分化成熟；pax6基因能够编码一种蛋白，此类蛋白与胰岛素原剪切加工有关；madd基因缺陷会不同程度的影响β细胞中的胰岛素正常分泌；nkx2-2基因在胰岛素正常分泌时表达高；insr基因编码胰岛素受体，该基因发生缺陷会产生不同程度的胰岛素抵抗；srr基因使胰岛素受体底物表达不足或者磷酸化异常可导致胰岛素抵抗；nd1基因与线粒体脱氢酶有关，该基因发生缺陷会影响机体的能量代谢，进而影响血糖的调节导致ii型糖尿病；srit1基因rs2236139，与代谢调控有关，该基因缺陷会使血脂、血糖代谢紊乱增加ⅱ型糖尿病的患病危险。

作为优选，所述hnf1b基因为其上snp位点rs1800575，所述pdx1基因为其上snp位点rs137852783，所述pax6基因为其上snp位点rs121907921，所述madd基因为其上snp位点rs10501320，所述nkx2-2基因为其上snp位点rs558588132，所述insr基因为其上snp位点rs121913135，所述srr基因为其上snp位点rs4523957，所述nd1基因为其上snp位点rs28358585，所述srit1基因为其上snp位点rs2236139。

本发明还提供了人类全基因组中hnf1b基因snp位点rs1800575或/和pdx1基因snp位点rs137852783在制备胰岛素原合成障碍基因型糖尿病产品中的应用。

其中，胰岛素原合成障碍基因型糖尿病是指在胰岛素原的合成方面存在基因突变的ⅱ型糖尿病基因分型。胰岛素本身并不是胰岛素基因控制合成的直接产物，而是由胰岛素原经过体内细胞切割加工而成。胰岛β细胞首先合成前胰岛素原，然后经过信号肽酶的切割和移去信号肽形成胰岛素原。胰岛素原在胰岛β细胞中发生折叠，在转换酶、内切蛋白酶和羧肽酶等的作用下转变成为胰岛素和c肽，具有双重免疫活性，既可与胰岛素抗体结合，又可与c肽抗体结合。胰岛素原主要在肾脏通过肾小球过滤和肾小管吸收代谢。此分型患者最显著的临床表型特征是血液中胰岛素原和c肽低和空腹胰岛素低。

本发明还提供了胰岛素原合成障碍基因型糖尿病分型试剂盒，包括：扩增hnf1b基因snp位点rs1800575的引物对或/和扩增pdx1基因snp位点rs137852783的引物对。

作为优选，所述胰岛素原合成障碍基因型糖尿病分型试剂盒中所述扩增hnf1b基因snp位点rs1800575的引物对的核苷酸序列如seqidno.1～2所示。

作为优选，所述胰岛素原合成障碍基因型糖尿病分型试剂盒中所述扩增pdx1基因snp位点rs137852783的引物对的核苷酸序列如seqidno.3～4所示。

作为优选，所述胰岛素原合成障碍基因型糖尿病分型产品的snp位点还包括arap1基因snp位点rs1552224，以进一步提高分型的检出率和准确率。

作为优选，所述的胰岛素原合成障碍基因型糖尿病分型试剂盒，所述扩增arap1基因snp位点rs1552224的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.19～20所示。

本发明还提供了人类全基因组中pax6基因snp位点rs121907921在制备胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型糖尿病产品中的应用。

其中，胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型代表了胰岛素原在加工转化成成熟胰岛素过程中存在障碍的一种ⅱ型糖尿病分型。胰岛素原是由前胰岛素原经过内质网切割信号肽加工而成。然后胰岛素原转运到细胞高尔基体内继续加工成熟，分泌颗粒包裹胰岛素原，并在胰岛素原转化酶、内肽酶ii和羧基酶h的作用下转化成胰岛素和c肽，并最终分泌入门静脉血。正常情况下胰岛素原的转变在其分泌前已大部分完成,外周血中胰岛素原的浓度极低。胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型患者携带胰岛素原加工转变通路相关基因缺陷，由胰岛素原向胰岛素的转化过程中出现障碍，胰岛素原无法完全转变成胰岛素，被直接分泌入血液，外周血中会出现“不成比例”的胰岛素原增高，无法起到调节血糖的作用。此分型患者最显著的临床表型特征是血液中胰岛素原高和c肽低，但是胰岛素敏感度基本不变。

作为优选，所述的胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型糖尿病分型试剂盒，包括：扩增pax6基因snp位点rs121907921的引物对。

作为优选，所述的胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型糖尿病分型试剂盒的扩增pax6基因snp位点rs121907921的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.5～6所示。

作为优选，所述胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型糖尿病分型试剂盒的snp位点还包括扩增thada基因snp位点rs11899863的引物对、扩增dgkb/tmem195基因snp位点rs2191349的引物对和扩增slc30a8基因snp位点rs3802177的引物对中一种或多种snp位点，以进一步提高分型的检出率和准确率。

作为优选，所述胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型糖尿病分型试剂盒的扩增thada基因snp位点rs11899863的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.21～22所示。

作为优选，所述胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型糖尿病分型试剂盒的扩增dgkb/tmem195基因snp位点rs2191349的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.23～24所示。

作为优选，所述胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型糖尿病分型试剂盒的扩增slc30a8基因snp位点rs3802177的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.25～26所示。

本发明还提供了人类全基因组中madd基因snp位点rs10501320或/和nkx2-2基因snp位点rs558588132在制备胰岛素分泌障碍基因型糖尿病产品中的应用。

其中，胰岛素分泌障碍基因型是指患者的成熟胰岛素分泌到外周血过程中相关过程辅助基因存在突变的ⅱ型糖尿病基因分型。胰岛β细胞在合成胰岛素后，需要在特定的生理信号的作用下，才会通过胞吐作用释放胰岛素，同时释放的还有等量的c肽。成熟的胰岛素会在高尔基体内被包裹在小囊泡内，与锌离子zn⁺结合成活性蛋白晶体，然后沿微小管移动，与细胞膜融合后经过胞吐作用释放。此基因分型患者携带分泌过程相关基因缺陷，会在以上胰岛素分泌生理过程出现障碍，导致无法分泌足量成熟的胰岛素。此分型患者最显著的临床表型特征是血液中胰岛素原含量正常，c肽和胰岛素含量低，但是胰岛素敏感度基本不变。

作为优选，所述的胰岛素分泌障碍基因型糖尿病分型试剂盒，包括：扩增madd基因snp位点rs10501320的引物对或/和扩增nkx2-2基因snp位点rs558588132的引物对。

作为优选，所述的胰岛素分泌障碍基因型糖尿病分型试剂盒的扩增madd基因snp位点rs10501320的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.7～8所示。

作为优选，所述的胰岛素分泌障碍基因型糖尿病分型试剂盒的扩增nkx2-2基因snp位点rs558588132的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.9～10所示。

作为优选，所述的胰岛素分泌障碍基因型糖尿病分型试剂盒的snp位点还包括：扩增gck基因snp位点rs4607517的引物对或/和扩增mtnr1b基因snp位点rs10830963的引物对，以进一步提高分型的检出率和准确率。

作为优选，所述的胰岛素分泌障碍基因型糖尿病分型试剂盒的扩增gck基因snp位点rs4607517的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.27～28所示。

作为优选，所述的胰岛素分泌障碍基因型糖尿病分型试剂盒的扩增mtnr1b基因snp位点rs10830963的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.29～30所示。

本发明还提供了人类全基因组中insr基因snp位点rs121913135或/和srr基因snp位点rs4523957中在制备胰岛素阻抗基因型糖尿病产品中的应用。

其中，胰岛素阻抗基因型是指存在胰岛素阻抗相关基因的ⅱ型糖尿病。胰岛素被分泌到血液中后，是通过被细胞膜上的酪氨酸酶家族受体识别来发挥其促进葡萄糖摄取的生物学作用。胰岛素受体只能与胰岛素结合，才可发挥生理功能。如果这个过程出现障碍，机体靶细胞或组织对胰岛素会缺乏正常作用反应，血糖调节失衡，我们把这个过程称为胰岛素阻抗(ir)。胰岛素抵抗最主要是由于胰岛素受体底物(irs)出现变异或者胰岛素信号转导相关通量出现异常，主要包括胰岛素受体的络氨酸激酶活性下降、氧化应激通量激活阻断胰岛素作用通路和相关细胞因子对胰岛素信号转导的抑制效应。此基因型患者携带胰岛素受体和信号转导通路相关基因突变，存在靶细胞对胰岛素敏感度低从而造成胰岛素低效或失效的状况。此分型患者最显著的临床表型特征是血液中胰岛素原和c肽含量正常，胰岛素含量高，胰岛素敏感度显著变低。

作为优选，所述的胰岛素阻抗基因型糖尿病分型试剂盒，包括：扩增insr基因snp位点rs121913135的引物对或/和扩增srr基因snp位点rs4523957的引物对。

作为优选，所述的胰岛素阻抗基因型糖尿病分型试剂盒的扩增insr基因snp位点rs121913135的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.11～12所示。

作为优选，所述的胰岛素阻抗基因型糖尿病分型试剂盒的扩增srr基因snp位点rs4523957的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.13～14所示。

作为优选，所述胰岛素阻抗基因型糖尿病分型试剂盒的snp位点还包括扩增irs1基因snp位点rs7578326的引物对或/和扩增pparg基因snp位点rs13081389的引物对。

作为优选，所述的胰岛素阻抗基因型糖尿病分型试剂盒的扩增irs1基因snp位点rs7578326的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.31～32所示。

作为优选，所述的胰岛素阻抗基因型糖尿病分型试剂盒的扩增pparg基因snp位点rs13081389的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.33～34所示。

本发明还提供了人类全基因组中nd1基因snp位点rs28358585或/和srit1基因snp位点rs2236139在制备多器官功能退化基因型糖尿病产品中的应用。

其中，多器官功能退化基因型是指具有机体整体代谢相关基因缺陷(细胞代谢、肝、肾、胰腺、肌肉组织，糖原异生)的ⅱ型糖尿病患者。多器官功能退化基因型主要涉及一些离子通道蛋白和细胞表面受体蛋白的基因缺陷。对于这两类基因，它们在生命调节过程中具有十分重要的功能，例如腺体激素的分泌，蛋白翻译后的准确折叠、组装和运输，神经元和心肌细胞动作电位的形成，以及免疫细胞的免疫反应等生理活动都具有重要的调节作用。离子通道基因上的一些突变的累积会改变了上述生理过程，造成离子通道蛋白聚集在内质网上生成量不足或者离子通道蛋白合成质量不高，降低离子通道功能，削弱了细胞离子和能量物质运输能力，从而导致疾病的产生。对于细胞受体表面受体蛋白的累积突变，也可能会影响到机体靶细胞对葡萄糖的吸收。多器官机能退化缺陷基因型个体携带影响整体代谢的相关基因突变，会造成个体多器官整体代谢能力的减弱，机体对胰岛素敏感度降低不敏感，对血糖浓度缓冲，调节作用减弱，代谢功能紊乱。此分型患者的临床表型特征是血液中胰岛素原，c肽和胰岛素含量稍微上升，胰岛素敏感度稍微下降，空腹血糖上升。

作为优选，所述的多器官功能退化基因型糖尿病分型试剂盒，包括：扩增nd1基因snp位点或/和扩增srit1基因snp位点。

作为优选，所述的多器官功能退化基因型糖尿病，包括：扩增nd1基因snp位点rs28358585的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.15～16所示。

作为优选，所述的多器官功能退化基因型糖尿病，包括：扩增srit1基因snp位点rs2236139的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.17～18所示。

作为优选，所述多器官功能退化基因型糖尿病分型试剂盒的snp位点还包括扩增wfs1基因snp位点rs1801214的引物对或/和扩增kcnq1基因snp位点rs163184的引物对，以进一步提高分型的检出率和准确率。

作为优选，所述的多器官功能退化基因型糖尿病的扩增wfs1基因snp位点rs1801214的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.35～36所示。

作为优选，所述的多器官功能退化基因型糖尿病的扩增kcnq1基因snp位点rs163184的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.37～38所示。

本发明还提供了人类全基因组中hnf1b基因snp位点rs1800575，pdx1基因snp位点rs137852783，pax6基因snp位点rs121907921，madd基因snp位点rs10501320，nkx2-2基因snp位点rs558588132，insr基因snp位点rs121913135，srr基因snp位点rs4523957，nd1基因snp位点rs28358585和srit1基因snp位点rs2236139中的至少两种在制备综合缺陷基因型产品糖尿病中的应用。

综合缺陷基因型是指ⅱ型糖尿病的发病机理非常复杂，大部分糖尿病人可能携带不止一种基因分型突变，例如有些患者身上即出现明显的胰岛素抵抗上升(胰岛素阻抗相关基因型)同时也有胰岛素无法有效分泌到血液中(胰岛素分泌相关缺陷基因型)，另外患者身上也出现了多器官机能退化缺陷基因型代谢相关基因的突变，对机体整体的代谢能力有微弱不良影响(轻度多器官机能退化基因型缺陷)，这样的情况称为综合基因突变型。根据每一位患者基因分型结果制定康复方案时，必须综合考虑多方面基因分型因素，并结合临床医护人员的诊断和治理意见。部分健康人群也可能携带一种或多种缺陷，这类人群较易成为糖尿病易感群体，在平时生活中需要密切注意糖尿病的预防措施。

更为优选，综合缺陷基因型为胰岛素原合成障碍基因型、胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型、胰岛素分泌障碍基因型、胰岛素阻抗基因型和多器官功能退化基因型的基因snp位点中，至少有两种基因型的snp位点发生突变，所述患者为综合缺陷基因型。

在一些实施方案中，本发明还提供了一种糖尿病分型试剂盒，包括：扩增hnf1b基因snp位点rs1800575的引物对；扩增pdx1基因snp位点rs137852783的引物对；扩增pax6基因snp位点rs121907921的引物对；扩增madd基因snp位点rs10501320的引物对；扩增nkx2-2基因snp位点rs558588132的引物对；扩增insr基因snp位点rs121913135的引物对；扩增srr基因snp位点rs4523957的引物对；扩增nd1基因snp位点rs28358585的引物对；扩增srit1基因snp位点rs2236139的引物对。

在一些实施方案中，所述一种糖尿病分型试剂盒，包括：扩增hnf1b基因snp位点rs1800575的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.1～2所示；扩增pdx1基因snp位点rs137852783的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.3～4所示；扩增pax6基因snp位点rs121907921的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.5～6所示；扩增madd基因snp位点rs10501320的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.7～8所示；扩增nkx2-2基因snp位点rs558588132的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.9～10所示；扩增insr基因snp位点rs121913135的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.11～12所示；扩增srr基因snp位点rs4523957的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.13～14所示；扩增nd1基因snp位点rs28358585的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.15～16所示；扩增srit1基因snp位点rs2236139的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.17～18所示，该糖尿病分型试剂盒的分型检出率在80％以上，分型准确率在73％以上。

本发明还提供了另一种糖尿病分型试剂盒，在上述试剂盒的基础上还包括扩增arap1基因snp位点rs1552224的引物对；扩增thada基因snp位点rs11899863的引物对；扩增dgkb/tmem195基因snp位点rs2191349的引物对；扩增slc30a8基因snp位点rs3802177的引物对；扩增gck基因snp位点rs4607517的引物对；扩增mtnr1b基因snp位点rs10830963的引物对；扩增irs1基因snp位点rs7578326的引物对；扩增pparg基因snp位点rs13081389的引物对；扩增wfs1基因snp位点rs1801214的引物对；扩增kcnq1基因snp位点rs163184的引物对，以进一步提高分型的检出率和准确率。

在一些实施方案中，所述的一种糖尿病分型试剂盒，包括：扩增arap1基因snp位点rs1552224的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.19～20所示；扩增thada基因snp位点rs11899863的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.21～22所示；扩增dgkb/tmem195基因snp位点rs2191349的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.23～24所示；扩增slc30a8基因snp位点rs3802177的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.25～26所示；扩增gck基因snp位点rs4607517的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.27～28所示；扩增mtnr1b基因snp位点rs10830963的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.29～30所示；扩增irs1基因snp位点rs7578326的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.31～32所示；扩增pparg基因snp位点rs13081389的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.33～34所示；扩增wfs1基因snp位点rs1801214的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.35～36所示；扩增kcnq1基因snp位点rs163184的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.37～38所示。该糖尿病分型试剂盒的分型检出率在91％以上，分型准确率在80％以上。

作为优选，所述arap1基因、hnf1b基因、pdx1基因、pax6基因、madd基因、nkx2-2基因、insr基因、srr基因、nd1基因、srit1基因、arap1基因、thada基因、dgkb/tmem195基因、gck基因、mtnr1b基因、irs1基因、pparg基因、wfs1基因和kcnq1基因中的snp位点信息如表1所示。

表1各基因snp位点信息表

作为优选，对所述基因位点进行一代测序分析检测外，还可以采用二代测序技术、taqman探针法、kasp方法、飞行串联质谱方法等snp技术手段进行检测。

作为优选，本发明还提供一种糖尿病分型方法，包括：

s1：检测hnf1b基因或/和pdx1基因是否发生突变；

或，检测pax6基因是否发生突变；

或，检测madd基因或/和nkx2-2基因是否发生突变；

或，检测insr基因或/和srr基因是否发生突变；

或，检测nd1基因或/和srit1基因是否发生突变；

s2：若hnf1b基因snp位点rs1800575或/和pdx1基因snp位点rs137852783发生突变，则判断为胰岛素原合成障碍基因型；

或，若pax6基因snp位点rs121907921发生突变，则判断为胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型；

或，若madd基因snp位点rs10501320或/和nkx2-2基因snp位点rs558588132发生突变，则判断为胰岛素分泌障碍基因型；

或，若insr基因snp位点rs121913135或/和srr基因snp位点rs4523957发生突变，则判断为胰岛素阻抗基因型；

或，若nd1基因snp位点rs28358585或/和srit1基因snp位点rs2236139发生突变，则判断为多器官功能退化基因型；

或，若判断为胰岛素原合成障碍基因型、胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型、胰岛素分泌障碍基因型、胰岛素阻抗基因型和多器官功能退化基因型的基因snp位点中，至少有两种基因型的snp位点发生突变，则判断为综合缺陷基因型。

本发明还提供一种糖尿病分型方法，包括：

s1：检测arap1基因、hnf1b基因和pdx1基因中一种或多种基因是否发生突变；

或，检测thada基因、dgkb/tmem195基因、slc30a8基因和pax6基因中一种或多种基因是否发生突变；

或，检测gck基因、mtnr1b基因、madd基因和nkx2-2基因中一种或多种基因是否发生突变；

或，检测irs1基因、pparg基因、insr基因和srr基因中一种或多种基因是否发生突变；

或，检测wfs1基因、kcnq1基因、nd1基因和srit1基因中一种或多种基因是否发生突变；

s2：若arap1基因snp位点rs1552224、hnf1b基因snp位点rs1800575和pdx1基因snp位点rs137852783中的一个或多个发生突变，则判断为胰岛素原合成障碍基因型；

或，若thada基因snp位点rs11899863、dgkb/tmem195基因snp位点rs2191349、slc30a8基因snp位点rs3802177和pax6基因snp位点rs121907921中一个或多个发生突变，则判断为胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型；

或，若gck基因snp位点rs4607517、mtnr1b基因snp位点rs10830963、madd基因snp位点rs10501320和nkx2-2基因snp位点rs558588132中的一个或多个发生突变，则判断为胰岛素分泌障碍基因型；

或，若irs1基因snp位点rs7578326、pparg基因snp位点rs7578326、insr基因snp位点rs121913135和srr基因snp位点rs4523957中的一个或多个发生突变，则判断为胰岛素阻抗基因型；

或，若wfs1基因snp位点rs1801214、kcnq1基因snp位点rs163184、nd1基因snp位点rs28358585和srit1基因snp位点rs2236139中的一个或多个发生突变，则判断为多器官功能退化基因型；

或，若判断为胰岛素原合成障碍基因型、胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型、胰岛素分泌障碍基因型、胰岛素阻抗基因型和多器官功能退化基因型的基因snp位点中，至少有两种基因型的snp位点发生突变，则判断为综合缺陷基因型，则判断为综合缺陷基因型。

综上所述，本发明的公开的制备ⅱ型糖尿病分型产品的基因，人类全基因组中hnf1b基因、pdx1基因、pax6基因、madd基因、nkx2-2基因、insr基因、srr基因、nd1基因和srit1基因中一种或多种在制备糖尿病分型产品中的应用。因此，本发明的糖尿病分型基因能用于ⅱ型糖尿病的分型，对胰岛素原合成障碍基因型、胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型、胰岛素分泌障碍基因型、胰岛素阻抗基因型、多器官功能退化基因基因型、综合缺陷基因型糖尿病进行有效区分，所述基因以及根据所述基因的snp位点制备的试剂盒能均能有效解决当前对ⅱ型糖尿病分型费时费力，分型不全面的技术缺陷，分型检出率和分型准确率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明糖尿病分型试剂盒的一代测序部分图谱，其中，a为arap1基因、b为thada基因、c为slc30a8基因、d为kcnq1基因、e为pparg基因、f为irs1基因、g为gck基因、h为mtnr1b基因的测序图谱。

图2示本发明的糖尿病分型试剂盒与临床指标值分型结果进行比较分析图分析，其中a为胰岛素原合成障碍基因型、b为胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型、c为胰岛素分泌障碍基因型、d为胰岛素阻抗基因型；其中，横坐标的a和b分别为糖尿病分型试剂盒a和糖尿病分型试剂盒b。

图3示本发明的糖尿病分型试剂盒与临床指标值分型结果比较韦恩图分析，其中a为胰岛素原合成障碍基因型、b为胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型、c为胰岛素分泌障碍基因型、d为胰岛素阻抗基因型、e为多器官功能退化基因型、f为综合缺陷基因型，a和b分别为糖尿病分型试剂盒a和糖尿病分型试剂盒b、c为临床指标值分型方法。

具体实施方式

本发明公开了一种糖尿病分型试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种糖尿病分型试剂盒，其中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：以下实施例采用了两种分型试剂盒：糖尿病分型试剂盒a(以下简称a)和糖尿病分型试剂盒b(以下简称b)；糖尿病分型试剂盒a含有扩增hnf1b基因snp位点rs1800575的引物对；扩增pdx1基因snp位点rs137852783的引物对；扩增pax6基因snp位点rs121907921的引物对；扩增madd基因snp位点rs10501320的引物对；扩增nkx2-2基因snp位点rs558588132的引物对；扩增insr基因snp位点rs121913135的引物对；扩增srr基因snp位点rs4523957的引物对；扩增nd1基因snp位点rs28358585的引物对；扩增srit1基因snp位点rs2236139的引物对。

糖尿病分型试剂盒b含有：扩增hnf1b基因snp位点rs1800575的引物对；扩增pdx1基因snp位点rs137852783的引物对；扩增pax6基因snp位点rs121907921的引物对；扩增madd基因snp位点rs10501320的引物对；扩增nkx2-2基因snp位点rs558588132的引物对；扩增insr基因snp位点rs121913135的引物对；扩增srr基因snp位点rs4523957的引物对；扩增nd1基因snp位点rs28358585的引物对；扩增srit1基因snp位点rs2236139的引物对；扩增arap1基因snp位点rs1552224的引物对；扩增thada基因snp位点rs11899863的引物对；扩增dgkb/tmem195基因snp位点rs2191349的引物对；扩增slc30a8基因snp位点rs3802177的引物对；扩增gck基因snp位点rs4607517的引物对；扩增mtnr1b基因snp位点rs10830963的引物对；扩增irs1基因snp位点rs7578326的引物对；扩增pparg基因snp位点rs13081389的引物对；扩增wfs1基因snp位点rs1801214的引物对；扩增kcnq1基因snp位点rs163184的引物对。

其中，糖尿病分型试剂盒b含有糖尿病分型试剂盒a的引物对，还含有10个其他基因的snp位点引物对。

实施例1

样品dna提取，步骤如下：

1、从某医院中，获得300例已确诊为ⅱ型糖尿病人的血液样本，300名患者无ⅰ型糖尿病和其他种类的糖尿病的典型特征。使用血液样本dna抽提试剂盒(magenhipuretissue&blooddnakitd3018-03)抽提标本dna，具体步骤按照试剂盒说明书上操作。样品dna使用thermo公司的nanodrop进行定量和质控。

2、样品dnapcr扩展

pcr反应体系使用taqdnapolymerase(vazyme，p101)，其中包含10×taqbuffer(mg²⁺)，dntpmix(10mm)。对于每个snp位点，构建一个pcr反应体系。

每个反应体系：

3、pcr反应条件：(使用touchdownpcr方法保证扩展的特异性，并且在后面15个循环，使用较低的退火温度，保证扩展效率)pcr程序步骤设置如下：

(2-4步骤重复20个循环)

5.94℃15s

6.55℃30s

7.72℃30s

(5-7步骤重复15个循环)

8.72℃5min

4℃保存产物。

4、基因位点扩展产物一代测序检测，样品送测序公司进行一代测序，测序平台是abi一代测序平台，如图1所示，图1列举了六个snp位点的测序图谱，编号a为arap1基因rs1552224位点、b为thada基因rs11899863位点、c为slc30a8基因rs3802177位点、d为kcnq1基因rs163184位点、e为pparg基因rs13081389位点、f为irs1基因rs7578326位点，g为gck基因rs4607517、h为mtnr1b基因rs10830963的序列测序图谱，其中a、b、e、g、h为野生型纯合子、c、f突变型为纯合子，d为突变型杂合子。

实施例2

根据实施例1中300例ⅱ型糖尿病人各基因测序结果，对300例糖尿病人进行分型。本实施例中采用两种分型试剂盒，一种是糖尿病分型试剂盒a，另外一种是糖尿病分型试剂盒b。具体的分型结果总结如下表格。(受试者没有以上基因位点突变，属于暂时无法分型组，这是由于ⅱ型糖尿病发病机理非常复杂，至今现在还有很多与其分型相关的发病机理没有被阐明)。

表1糖尿病分型结果分析统计表

可以看到，糖尿病分型试剂盒a，300例人群中能够对90％以上的人群进行分型，糖尿病分型试剂盒b，能够对96％以上的人群进行分型，通过b试剂盒能够有效分型的比例比a高。

实施例3

对实施例2的分型结果进行验证：

一、对实施例2中的300ii型糖尿病例患者血样抽取前采取隔夜禁食10-12h，次日清晨在空腹状态下取静脉血。当日测定空腹血糖、糖化血红蛋白；离取血清置于-80℃冰箱保存，用于统一检测其他指标，包括空腹胰岛素原、空腹胰岛素、空腹c肽。均采用常规设备和方法，具体检测方法如下：

1、血糖及糖化血红蛋白检测采用advia2400全自动生化分析仪完成；

2、血清胰岛素、胰岛素原采用生物素-亲和素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ba-elisa)检测，试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

3、空腹c肽的检测：采用放射免疫法测c肽，检测试剂盒由深圳拉尔文生物工程技术有限公司提供，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

4、胰岛β细胞功能的评价指标(homa-b)，参照文献计算。

5、稳态模型评估胰岛素抵抗水平指标(homa-ir)，参照文献计算。

表1为现有技术公开的利用生理指标进行糖尿病分型的标准表。

表2糖尿病相关生理指标分型方法标准表

根据表2中的标准表对实施例2中的300例患者进行生理指标值分型，分型结果如表3所示。

表3300全体ii型糖尿病例患者进行血清中糖尿病相关生理指标分型方法的结果表

表3结果可知，采用相关生理指标值对糖尿病分型中综合缺陷型比例最高，其次是胰岛素阻抗型和多器官功能退化型，该结果与表1结果类似。

二、对300例已确诊为ii型糖尿病的患者进行临床指标值分型后，得出表3的结果，以该表位标准与实施例2采用基因测序分型的结果进行统计学分析，结果如图2的比较分析图和图3的韦恩图所示。

图2的比较分析图说明了，横坐标为a组、b组和300全体ii型糖尿病例患者组，纵坐标为临床指标值，a组、b组和300全体ii型糖尿病例患者组散点中的短横线为每一组的平均值，图中的虚线表示临床指标值的患病阈值。

请参照图2，具体的，a为胰岛素原合成障碍基因型，该基因型最主要临床特征指标是患者血清中空腹胰岛素原含量值与c肽的含量值分别显著低于0.05μg/l和0.77μg/l的阈值，表1中a组和b组分别检测出12名和14名患者为胰岛素原合成障碍基因型，从图2中的a的左右两幅图可知，这a组和b组检测出的患者的空腹胰岛素原含量与c肽含量均低于空腹胰岛素原含量值和c肽含量值的阈值，a组的12名患者的空腹胰岛素原含量值和c肽含量值与300全体ii型糖尿病例患者组相比均有显著性差异，p<0.01，说明12名患者的空腹胰岛素原含量值和c肽含量值显著比300全体ii型糖尿病例患者的空腹胰岛素原含量值和c肽含量值低；b组的该14名患者的空腹胰岛素原含量值和c肽含量值与300全体ii型糖尿病例患者组相比均有显著性差异，p<0.01，说明该14名患者的空腹胰岛素原含量值和c肽含量值显著比300全体ii型糖尿病例患者的空腹胰岛素原含量值和c肽含量值低。表明实施例2中a组和b组分别检测出12名和14名患者符合该基因分型的临床特征，表3结果显示300全体ii型糖尿病例患者的胰岛素原合成障碍基因型为15人，由此可知，a组的检出率为80％，b组的检出率为93％。

请参照图2，具体的，b为胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型，该基因型最主要的临床特征是患者血清中空腹胰岛素原含量值显著高于0.1μg/l的阈值，空腹c肽的含量值显著低于0.77μg/l的阈值，a组的25名患者的空腹胰岛素原含量值和空腹c肽含量与300全体ii型糖尿病例患者组相比均有显著性差异，p<0.01，说明该25名患者的空腹胰岛素原含量值显著高于300全体ii型糖尿病例患者组，该25名患者的空腹c肽的含量值显著低于300全体ii型糖尿病例患者组；b组的27名患者的空腹胰岛素原和c肽含量与300全体ii型糖尿病例患者组相比均有显著性差异，p<0.01，说明该27名患者的空腹胰岛素原含量值显著高于300全体ii型糖尿病例患者组的空腹胰岛素原含量值，该27名患者的空腹c肽的含量值显著低于300全体ii型糖尿病例患者组的空腹c肽的含量值。表1中a组和b组分别检测出25名和27名患者为胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型，从图2中的b的左右两幅图可知，这a组和b组检测出的患者的空腹胰岛素原含量高于阈值，c肽含量均低于阈值，表明实施例2中a组和b组分别检测出25名和27名患者符合胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型最主要的临床特征，表3结果显示300全体ii型糖尿病例患者中的胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型为29人，由此可知，a组的检出率为86％，b组的检出率为93％。

请参照图2，具体的，c为胰岛素分泌障碍基因型，该基因型最主要的临床特征是患者homa-b评价指标值显著低于30％的阈值，表1中a组和b组分别检测出42名和43名患者为胰岛素分泌障碍基因型，a组的42名患者的homa-b评价指标值与300全体ii型糖尿病例患者组相比均有显著性差异，p<0.01，说明该42名患者的homa-b评价指标值低于300全体ii型糖尿病例患者组的homa-b评价指标值；b组的43名患者的homa-b评价指标值与300全体ii型糖尿病例患者组相比均有显著性差异，p<0.01，说明该43名患者的homa-b评价指标值低于300全体ii型糖尿病例患者组的homa-b评价指标值。从图2中的c图可知，这a组和b组检测出的患者的homa-b评价指标值低于阈值，表明实施例2中a组和b组分别检测出42名和43名患者符合胰岛素分泌障碍基因型最主要的临床特征，表3结果显示300全体ii型糖尿病例患者中胰岛素分泌障碍基因型为46人，因此，a组的检出率为91％，b组的检出率为93％。

请参照图2，具体的，d为胰岛素阻抗基因型，该基因型最主要的临床特征是患者homa-ir评价指标值显著高于4.67的阈值，表1中a组和b组分别检测出58名和60名患者为胰岛素阻抗基因型，a组的58名患者的homa-ir评价指标值与300全体ii型糖尿病例患者组相比均有显著性差异，p<0.01，说明该58名患者的homa-ir评价指标值低于300全体ii型糖尿病例患者组的homa-ir评价指标值；b组的60名患者的homa-ir评价指标值与300全体ii型糖尿病例患者组相比均有显著性差异，p<0.01，说明该60名患者的homa-ir评价指标值低于300全体ii型糖尿病例患者组的homa-ir评价指标值。从图2中的d图可知，这a组和b组检测出的患者的homa-ir评价指标值高于阈值，c肽含量均低于阈值，表明实施例2中a组和b组分别检测出58名和60名患者符合胰岛素阻抗基因型最主要的临床特征，表3结果显示300全体ii型糖尿病例患者中的胰岛素原合成障碍基因型为66人，因此，a组的检出率为88％，b组的检出率为91％。

多器官功能退化基因型的临床特征如表2所示，表1中a组和b组分别检测出50名和53名患者为多器官功能退化基因型，表3结果显示300全体ii型糖尿病例患者中的多器官功能退化基因型为54人，因此，a组的检出率为92％，b组的检出率为98％。

综合缺陷基因型为同时符合胰岛素原合成障碍基因型、胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型、胰岛素分泌障碍基因型和多器官功能退化基因型两种以上的糖尿病分型，其临床特征较其他基因型复杂，表1中a组和b组分别检测出83名和90名患者为综合缺陷基因型，表3结果显示300全体ii型糖尿病例患者中的多器官功能退化基因型为90人，因此，a组的检出率为92％，b组的检出率为100％。

图3的韦恩图显示，左上角圆圈为a组，右上角圆圈为b组，中间圆圈c为临床指标值分型组，三个圆圈重叠部分为用三种方法共同的分型患者人数，左上角圆圈与中间圆圈重叠部分为a组与临床指标值分型组c的重叠分型患者人数，以现有技术的临床指标值分型组c为标准，a组与c组重叠人数越多，说明其分型准确性越高；右上角圆圈与中间圆圈重叠部分为b方法与临床指标值分型方法同样分型患者人数，以现有技术的临床指标值分型组c为标准，b组与c组重叠人数越多，说明其分型准确性越高。

请参照图3，具体的，a表示胰岛素原合成障碍基因型，对表1和表3的数据进行韦恩图分析，以临床指标值分型方法为标准，a方法的分型准确率为73％，b方法的分型准确率为80％。

请参照图3，具体的，b表示胰岛素原与胰岛素转化障碍基因型，对表1和表3的数据进行韦恩图分析，以临床指标值分型方法为标准，a方法的分型准确率为76％，b方法的分型准确率为86％。

请参照图3，具体的，c表示胰岛素分泌障碍基因型，对表1和表3的数据进行韦恩图分析，以临床指标值分型方法为标准，a方法的分型准确率为85％，b方法的分型准确率为89％。

请参照图3，具体的，d表示胰岛素阻抗基因型，对表1和表3的数据进行韦恩图分析，以临床指标值分型方法为标准，a方法的分型准确率为86％，b方法的分型准确率为88％。

请参照图3，具体的，e表示多器官功能退化基因型，对表1和表3的数据进行韦恩图分析，以临床指标值分型方法为标准，a方法的分型准确率为89％，b方法的分型准确率为93％。

请参照图3，具体的，f表示综合缺陷基因型，对表1和表3的数据进行韦恩图分析，以临床指标值分型方法为标准，a方法的分型准确率为89％，b方法的分型准确率为98％。

因此，糖尿病分型试剂盒b含有糖尿病分型试剂盒a的引物对，还含有10个其他基因的snp位点引物对；从以上实施例可知糖尿病分型试剂盒b的分型检出率和分型准确率远远高于糖尿病分型试剂盒a。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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<110>广州普麦健康咨询有限公司

<120>一种糖尿病分型试剂盒

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