一种同步检测4种辣椒病毒的多重PCR方法与流程

本发明属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，特别是涉及一种反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的体系及其应用，该体系可用于同步检测4种侵染辣椒的RNA病毒，达到准确、快速、高效检测的目的。

背景技术：

辣椒(Capsicum spp.)是茄科辣椒属植物，因其果实风味独特和营养丰富而成为人们喜爱的蔬菜和调味品，还用于食品色素、医药及工业组分的提取，因此在美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲等地区广为种植，随着辣椒需求量和贸易量的加大，有进一步扩大的趋势。我国辣椒种植面积133万hm²，经济总产值700亿元，均居世界首位，辣椒还是贵州、云南、四川、重庆等省份贫困山区农民的主要经济来源。病毒病是辣椒上一类重要病害，自上世纪70年代以来，随着种植面积的不断扩大、种植区气候和耕作制度的变化，病毒病的发生呈现逐年上升趋势，侵染后常常造成落花、落叶、落果，减产可达30％-70％，甚至绝收，已成为影响辣椒产量和品质的重要限制因素之一。

目前，在世界范围内可侵染辣椒的病毒病原有49种之多，其中约15个大类的20种病毒能引起严重症状,在我国约有23种能引起病害症状的辣椒病毒病原。常见有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)、辣椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)等。辣椒植株受病毒侵染后表现不同的症状，常见的有花叶、黄化、斑驳、皱缩、畸形、坏死、植株矮化等。但在自然界，同一辣椒植株同时遭受两种或两种以上病毒侵染(复合侵染)的情况非常普遍，复合侵染不仅能削弱寄主的抗性，加重病害症状，还使得病害的症状更加复杂，给病害识别带来很大的困难，直接影响病害的及时防治。2016年贵州省贵阳市自然发生的辣椒病毒病为害严重，且病害症状复杂，经小RNA深度测序和PCR鉴定发现是BBWV-2CMV、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒侵染所致，因此生产上急需准确、快速、简便、易操作的方法同时鉴别多种病毒病害。

随着分子生物学技术的长足发展，基于核酸操作的多项技术在病毒病害的检测中发挥了巨大的作用，如多聚酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、基因芯片、核酸等温扩增等技术可同时检测多个靶标病原物，具有快速、准确、样品消耗少等特点。多重PCR(multiplex PCR)技术因其快速、灵敏、准确等优点已被广泛应用于病毒、细菌、真菌等病原物的检测和鉴定，为病害的早期诊断发挥了巨大的作用。多重PCR是指在同一个PCR反应体系中同时加入两种或两种以上的靶标病原物的核苷酸模板和特异性引物对，通过一次反应扩增片段大小不同的两种或两种以上的目的基因，从而同时区别两种或两种以上靶标病原物。基于此原理，本发明建立了隶属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和马铃薯Y病毒(PVY)以及豇豆花叶病毒科(Comoviridae)蚕豆病毒属(Fabavirus)的典型种蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)等四种辣椒病毒的多重PCR检测体系，该体系可以准确、高效、快速的鉴定田间自然发病的辣椒标样，为辣椒病害的早期诊断和鉴定提供手段。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于同步检测侵染辣椒的四种病毒的方法。该方法能够准确、高效、灵敏的同时检测多种植物病毒病标样。

一种同步检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物对：

扩增BBWV2的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′，

SEQ ID NO.2：5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′；

扩增PVY的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′，

SEQ ID NO.4：5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′；

扩增ChiVMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，

SEQ ID NO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；

扩增CMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.7：5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。

所述PCR体系中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV引物的摩尔比分别为2.5：1：2.5：1。

所述的PCR体系总体积25μL，其中含有cDNA 2μL、10mM dNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mM的MgCl₂ 1.5μL以及10μmol/L的BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV上下游引物分别为0.5μL、0.2μL、0.5μL、0.2μL。

所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、57℃退火45秒和72℃延伸90秒，共40个循环；最后72℃延伸10分钟。

上述方法在同步检测农作物中四种辣椒病毒病原BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV中的应用。

所述农作物为辣椒。

一种检测试剂盒，含有上述四对引物。

本发明提供的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒的特异性引物对，通过RT-PCR分别可以获得1406bp,1202bp,600bp和376bp的单一的特异性条带。通过对PCR反应体系和反应条件的优化，建立了同步检测上述4种病毒的多重RT-PCR方法，突破了同步检测侵染辣椒的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒的技术瓶颈，也可以为其他病毒病原的鉴定提供借鉴。具体发明内容涉及到：1)病毒RNA的提取；2)特异性引物对的设计和特异性分析；3)四种病毒的PCR鉴定体系；4)基于单重PCR技术的多重PCR检测方法的建立与优化；5)多重PCR检测方法灵敏度的测定。本发明的多重PCR反应的最佳体系和条件经优化确定为：10mM dNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mM MgCl₂ 1.5μL，以及57℃的退火温度。多重PCR扩增的最佳反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、57℃退火45秒、72℃延伸90秒，共40个循环；最后72℃延伸10分钟。

所述四种病毒的特异性引物对可作为组合同步检测辣椒上的BBWV2、PVY、ChiVMV、CMV四种病毒，PCR检测均能获得单一的特异性条带，可以用于鉴定4种辣椒病毒病。

所述四种病毒复合侵染的辣椒标样为田间自然发病植株，采集自贵州省农业科学院试验田，经小RNA深度测序和PCR鉴定确认携带BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV四种辣椒病毒。

该检测方法可制作成试剂盒用于检测四种病毒。

相比于现有技术，本发明具有以下优点：

1.本发明首次提出在辣椒上同步检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒；

2.本发明设计的检测引物对具有特异性和兼容性，可以扩增同一标样中的四种病毒；

3.本发明优化了PCR扩增的反应体系和条件，在保证检测结果可靠的前提下，极大地缩短了检测时间，提高了检测效率；本发明反应体系灵敏性好，该多重PCR体系的检测底线是10^-1cDNA。

4.本发明的检测是在同一个PCR体系中经过一次扩增反应完成，既节约了病毒RNA和PCR扩增体系种的各种试剂，尤其是反转录酶、rTaq的使用量，最大程度的降低了检测成本，也节约了人力。

附图说明

图1.四种病毒特异性引物的特异性示意图.1-a为引物对BBWV2-F(SEQ ID NO.1)/BBWV2-R(SEQ ID NO.2)的Primer-Blast检索结果；1-b为引物对PVY-F(SEQ ID NO.3)/PVY-R(SEQ ID NO.4)的Primer-Blast检索结果；1-c为引物对ChiVMV-F(SEQ ID NO.5)/ChiVMV-R(SEQ ID NO.6)的Primer-Blast检索结果；1-d为引物对CMV-F(SEQ ID NO.7)/CMV-R(SEQ ID NO.8)的Primer-Blast检索结果

图2.四种病毒特异性引物的PCR扩增结果

泳道M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker),从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和 250bp；泳道1～4分别为辣椒标样中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV的特异性条带；泳道5为健康植株的扩增结果(阴性对照)，未扩增到特异性条带。

图3.四种病毒特异性引物的兼容性PCR扩增结果

泳道M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker),从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1为以四种病毒复合侵染的辣椒标样的总RNA为模板，用四种病毒的特异性引物同时扩增的结果；泳道2为健康植株；泳道3～6分别为BBWV2、PVY、ChiVMV、CMV四种病毒特异性引物的扩增结果。

图4.多重PCR体系的优化

A:退火温度的优化,泳道1～5分别为53、55、57、59和61℃；B:dNTPs用量的优化,泳道1～5分别为1、2、3、4和5μL；C:rTaq用量的优化,泳道1～5分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5U；图中M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker),从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp。

图5.多重PCR体系的灵敏度测定。

泳道M代表核酸标准分子量(DL2000DNA Marker),从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1～4的cDNA浓度分别为10⁰～10^-3。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.辣椒叶组织总RNA的提取

采用美国Invitrogen公司的TRIzol reagent提取健康及被BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒复合侵染的辣椒植株的总RNA。操作步骤如下：1)取新鲜或冰冻的辣椒叶片加液氮充分研磨后，迅速转移100mg干粉组织至经液氮冷冻过的1.5ml经DEPC处理的无菌离心管中；2)加入1mL TRIzol reagent，充分混匀，室温静置5分钟；3)加入0.2mL氯仿，剧烈手摇15秒，室温静置2-3分钟；12000g/4℃离心15分钟；4)取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，置冰上10分钟；12000g/4℃离心15分钟，去上清；5)沉淀中加入1mL预冷的75％乙醇(无菌DEPC水配制)洗涤，7500g/4℃离心5分钟，重复洗涤沉淀3次；6)干燥沉淀，加DEPC处理的水50μL溶解，此即为辣椒总RNA。7)取1μL RNA溶液，用NanoDrop-2000紫外分光光度计测定RNA样品的纯度和浓度值。合格的样品置于-70℃冰箱保存备用。

实施例2.四种病毒特异性引物对的设计

根据NCBI公布的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV等四种病毒的核苷酸序列，采用Vector NTI软件分别设计每种病毒的特异性引物对，每对引物退火温度相似，具有一定的保守性，扩增产物不形成二级机构，GC含量在40％-60％之间，四种引物之间碱基不互补，引物由上海生物工程有限公司合成(4种引物情况见表1)。

表1.BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒的多重PCR检测体系中的特异性引物

实施例3.四对引物的特异性检测

实施例2种所设计的四对引物分别可以检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒。BBWV2所属的蚕豆病毒属(Fabavirus)共包括5种病毒，除BBWV2侵染辣椒外，其它四种病毒分别是蚕豆萎蔫病毒1号(Broad bean wilt virus 1，BBWV-1)、野芝麻轻型花叶病毒(Lamium mild mosaic virus，LMMV)、南瓜花叶病毒(Cucurbit mild mosaic virus，CMMV)和龙胆草花叶病毒(Gentian mosaic virus，GMV)，它们均不侵染辣椒。同样，与CMV同属于黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的另外三种--花生矮化病毒(Peanut stunt virus，PSV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)和蛇鞭菊属轻斑驳病毒(Gayfeather mild mottle virus，GMMV)，也均不侵染辣椒。而PVY和ChiVMV同属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，采用二者的引物并未扩增出对方的条带，说明二者的引物具有唯一性。

为了确保本发明所设计引物的特异性，采用NCBI的在线比对软件Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对实施例2中所设计引物的特异性进行了检索。检索设置扩增长度为100～2000bp，最大扩增产物长度为2000bp，检索NR(All non-redundant GenBank CDS translations+RefSeq Proteins+PDB+SwissProt+PIR+PRF)数据库的所有物种。结果显示：以BBWV2-F(SEQ ID NO.1)/BBWV2-R(SEQ ID NO.2)为引物对的检索结果共获得6条长度为1406bp的可能的扩增产物，均属于BBWV2，未检索到其它物种(如图1中1-a)；以PVY-F(SEQ ID NO.3)/PVY-R(SEQ ID NO.4)为引物对进行检索，共获得长度为287条长度为1202bp、1条长度为1205bp的可能扩增产物，均属于PVY(如图1中1-b)，未查到其它物种；以ChiVMV-F(SEQ ID NO.5)/ChiVMV-R(SEQ ID NO.6)为引物对进行检索，共获得2条长度为600bp的可能扩增结果(如图1中1-c)，同属于ChiVMV，均未查到其它物种；以CMV-F(SEQ ID NO.7)/CMV-R(SEQ ID NO.8)为引物对进行检索，共获得280条长度为355～383bp的可能扩增结果(如图1中1-d)，也均属于CMV，且无其他物种基因扩出可能性。因此，说明本发明所设计引物具有特异性。

实施例4.四种辣椒病毒的RT-PCR体系

cDNA的合成：反应总体积为20μL，其中辣椒总RNA(1μg/μL)1μL,下游引物(10μmol/L)2μL,DEPC处理的ddH₂O 8μL，混匀后90℃变性1min，立刻置冰上2min；再依次加入dNTPs(10mM)2μL,5×MMLV Buffer 4μL，M-MLV反转录酶(Promega,USA)1μL以及RRI(Takara,China)0.5μL。混匀后，37℃孵育1hr,70℃10min。

PCR反应体系：反应总体积为25μL，其中cDNA 2μL,10×PCR Buffer(15mM Mg²⁺)2.5μL,dNTPs(10mM)2μL,上下游引物各0.3μL,rTaq(Takara,China)1U，加ddH₂O补齐25μL。扩增条件为94℃预变性3min，94℃30s、57℃45s和72℃90s共40个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，电压每厘米2伏，电泳1.5～2小时，紫外下观察照像。电泳结果显示：用BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV各自的特异性引物分别扩增获得了1406bp、1202bp、600bp和376bp的单一条带(图2泳道1～4)。

将电泳条带回收、纯化、连接到pEASY-T5载体(北京全式金生物技术有限公司)，采用冻融法转化Trans-T1的感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，选取3个PCR阳性单克隆，经北京六合华大基因科技有限公司测序，采用Vector NTI软件比对，结果表明获得的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒序列与原参考序列的一致性分别为98.3％、99.1％、99.2％、98.7％，均在98％以上，证明了扩增结果的正确性。

实施例5.四种病毒的多重RT-PCR体系的建立

多重PCR反应是在一个PCR反应体系中同时检测多种病毒，因此多重PCR反应体系中的RNA和引物均为多种病毒RNA和特异性引物对的混合物，其他设计如反转录酶、RNA聚合酶、dNTPs等的浓度相同。本发明中所用核苷酸模板为BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒同时侵染的辣椒植株的总RNA；引物为四种病毒特异性引物对的混合物，引物对的最佳比例为BBWV2：PVY：ChiVMV：CMV＝2.5：1：2.5：1，结果表明4对引物分别扩增到1406bp、1202bp、600bp和376bp的单一条带，具有良好的兼容性(图3，泳道1)。

PCR反应体系的优化：本发明对不同的退火温度、dNTPs和rTaq浓度等做了优化。退火温度设置有53、55、57、59和61℃5个梯度；在25μL的总反应体积中，dNTPs用量设置有1、2、3、4和5μL的5个梯度，rTaq用量设置有0.5、1.0、1.5、2.0和2.5U的5个梯度，优化结果表明：最佳退火温度为57℃，10mM的dNTPs 3μL和rTaq 1.5U(如图4)。

最佳的多重RT-PCR体系为：cDNA合成反应总体积为20μL，其中辣椒总RNA(1μg/μL)1μL,下游引物(10μmol/L)2μL,DEPC处理的ddH₂O 8μL，混匀后90℃变性1min，立刻置冰上2min；再依次加入dNTPs(10mM)2μL,5×MMLV Buffer 4μL，M-MLV反转录酶(Promega,USA)1μL以及RRI(Takara,China)0.5μL。混匀后，37℃孵育1hr,70℃10min。取上述合成体系中的cDNA 2μL,10×PCR Buffer(15mM Mg²⁺)2.5μL,dNTPs(10mM)3μL,rTaq(Takara,China)1.5U，及BBWV2、PVY、ChiVMV、CMV上下游引物各0.5、0.2、0.5、0.2μL，加ddH₂O补齐25μL。

最佳反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、57℃退火45秒、72℃延伸90秒，共40个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，电压每厘米2伏，电泳1.5～2小时，紫外下观察照像。电泳结果显示：用BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV各自的特异性引物分别扩增获得了1406bp、1202bp、600bp和376bp的单一条带(图3泳道3～6)。

实施例6.多重PCR体系的灵敏度测定

将按照实施例4获得的cDNA浓度分别稀释1，10，100和1000倍(即10⁰-10^-3)，其他PCR扩增条件不变，结果表明当cDNA稀释1倍和10倍时均能很好的检测出BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒；当稀释100倍时，BBWV2条带比较模糊，PVY、ChiVMV和CMV三种病毒能检测到；但当稀释到1000倍时，已经检测不到BBWV2和PVY，ChiVMV和CMV在这四个浓度梯度下皆能检测得到(如图5)，因此，该多重PCR体系的检测底线是10^-1cDNA。

实施例7多重RT-PCR体系的应用

我们应用建立的多重PCR体系对2016年采集自贵州省贵阳市的4株表现病毒病症状的辣椒标样进行了检测，结果显示：样品1和3中扩增到到BBWV、ChiVMV和CMV三种病毒，在样品2和4中则扩增到BBWV、ChiVMV、CMV和PVY四种病毒。单克隆测序结果与参考序列的一致性均在98％以上，说明本发明建立的多重RT-PCR检测体系可用于田间标样的检测，且结果可靠。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种同步检测4种辣椒病毒的多重PCR方法

<130> PP17009-ZWB

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增BBWV2的特异性引物

<400> 1

gcgtcctgag tttgttgtag cg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 扩增BBWV2的特异性引物2

<400> 2

cctccatcaa gccttgacca tatc 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增PVY的特异性引物1

<400> 3

cggttcgttt gaatgcaagc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 扩增PVY的特异性引物2

<400> 4

cttgctgctt ctcccctatg g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增ChiVMV的特异性引物1

<400> 5

tggctgtgca agttaccttc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增ChiVMV的特异性引物2

<400> 6

acctgtgtga tgacgtgggt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 扩增CMV的特异性引物1

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

aaancttgtt tcgcgcattc a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增CMV的特异性引物2

<400> 8

gagggagggt tctgggaaca 20