一种检测鲑鱼甲病毒的EvaGreen荧光定量PCR检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及用于病毒检测的引物和试剂盒，特别是涉及用于检测鲑鱼甲病毒的特异性的荧光定量PCR引物，本发明还涉及利用该引物和Eva Green荧光染料进行鲑鱼甲病毒检测的方法和试剂盒。本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术：

鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)隶属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)，主要感染大西洋鲑(salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和褐鳟(Salmo trutta L.)等鲑科鱼类引起胰脏病、心肌炎症和昏睡等症状，致死率达1％～48％，并在水产养殖的各个阶段均有爆发。1995年Nelson等在爱尔兰首次从患胰脏病的大西洋鲑和虹鳟体内分离出该病毒，1997年Castric等又在法国从患昏睡病的大西洋鲑和虹鳟体内分离到SAV，目前该病广泛流行于英格兰、苏格兰、挪威、法国、波兰、意大利和西班牙等欧洲国家，据统计从1995年至2007年发病率逐年增加高达90％，每年由此疫病造成巨大的经济损失。2013年鲑鱼甲病毒感染被列入OIE水生动物疫病名录中。虽然，我国目前尚未有文献报道检测到该病毒，但是，随着近年我国对鲑科鱼类进口和鲑科鱼类卵引进的增加，该病传入我国的风险也日益增大。因此，我国建立SAV快速诊断和测检方法是紧迫的任务。

目前已发现六个基因型(SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5、SAV 6)。其中，SAV 1、SAV 3、SAV 4、SAV 5、SAV 6可感染大西洋鲑引起胰腺病(Salmon pancreas disease，PD)；SAV 2可感染虹鳟引起睡病(Sleeping disease，SD)。SAV病毒粒子具有囊膜，大小为65nm。单股正链RNA病毒，基因组长11-12kb，且含有两个开放阅读框(ORF)。基因组的第二个ORF编码26S子基因的mRNA，最终产生5个结构蛋白，即衣壳蛋白、E3、E2、6K、和E1共同构成了病毒的囊膜糖蛋白。E2在未成熟时，与E3相连，组成E2的前体，E3的作用相当于E2的信号肽。当E2成熟时，E2与E3分离，E2被转运到病毒粒子表面。

近年来，我国一些地方，特别是北方地区，大规模发展了冷水鱼类(如：虹鳟)养殖，且取得了巨大的经济效益。虽然我国目前尚未发现该病毒，但是随着近年我国对鲑科鱼类进口的增加，该病传入我国的风险也日益增大，因此有必要尽早建立对鲑鱼甲病毒快速灵敏的检测方法，防止该病传入我国，SAV的有效预报或者诊断是我们必须解决的问题。

核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为鲑鱼甲病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够简便、快速、灵敏、特异和高效地检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR方法。该方法检测覆盖鲑鱼甲病毒六个基因型，是一种特异性强，准确性高、灵敏性高的检测方法。

为了实现本发明目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明对已知鲑鱼甲病毒基因序列进行比对，筛选出鲑鱼甲病毒六个基因型的保守区序列，即E2蛋白基因中的一段保守序列(9471-9668bp)。针对该序列本发明发明人经反复筛选和验证，得到一对用于检测鲑鱼甲病毒六个不同基因型的荧光定量PCR引物，扩增片段大小为197bp(SEQ ID NO.1所示)，所述引物的序列如下：

上游引物(TS1)：5’-GCAACATTGCCGATCTGAGGTGTGG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物(TS2)：5’-CGTAACATGCAACGACAGCCAGTGC-3’(SEQ ID NO.3)

进一步的，本发明还提出了一种用于检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，含有用于检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR引物对以及Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液，其中所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液包括dNTPs、Mg²⁺、Eva Green、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液为Golden HS EVA Green qPCR Mix。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，还包括阳性对照和阴性对照，所述的阳性对照为含有鲑鱼甲病毒E2基因的重组质粒标准品，所述的阴性对照为去离子水。

更进一步的，本发明还提出了使用本发明所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒检测鲑鱼甲病毒时，包括以下步骤：

(1)将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；

(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80℃，备用；

(3)以步骤(2)得到的总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；

(4)PCR反应结束后，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数。

其中，优选的，PCR扩增反应体系为：5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，浓度为0.3μM的上游引物及下游引物各0.5μl，模板1μl，最后用灭菌的去离子水补至20μl。

其中，优选的，实时荧光定量PCR的反应程序为：(1)95℃预变性15min；(2)95℃变性10s、60℃退火30s，共40个循环。

其中，优选的，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：Ct值≤40.0时样品结果为阳性；Ct值＞40.0的样品结果为阴性。

再进一步的，本发明还提出了所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒在制备检测鲑鱼甲病毒的试剂中的应用。

其中，所述的鲑鱼甲病毒包括以下六个基因型：SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5以及SAV 6。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明参考多种鲑鱼甲病毒六个基因型毒株，基于E2基因，设计合成可以用于Eva Green荧光定量PCR检测的特异性引物；

2、本发明成功建立了Eva Green荧光定量PCR检测方法，优选采用Golden HS EVA Green为荧光试剂，成本低，定量PCR反应液配制简单，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、定性检测，重复性好，可信度高，可适用于各荧光定量PCR扩增仪；

3、本发明定量检测方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可用于所有鲑鱼甲病毒六个基因型毒株的快速检测。

附图说明

图1为鲑鱼甲病毒Eva Green荧光定量PCR扩增动力学曲线；

图2为鲑鱼甲病毒Eva Green荧光定量PCR标准曲线；

图3为鲑鱼甲病毒Eva Green荧光定量PCR扩增产物溶解曲线；

图4为普通PCR方法检测本发明建立引物的灵敏性核酸电泳图；

图5为普通PCR方法检测OIE批准的用于检测鲑鱼甲病毒引物的灵敏性核酸电泳图；

图6为鲑鱼甲病毒Eva Green荧光定量PCR的特异性试验扩增动力学曲线。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1鲑鱼甲病毒六个基因型特异性引物的设计

根据Genebank中发表的鲑鱼甲病毒(SAV)E2基因序列(JX163854)，比较SAV的6个基因型不同毒株的E2基因序列，筛选出一段保守序列(9471-9668bp)。设计引物时，注意避开序列的突变点，经反复筛选和验证，得到一对用于检测鲑鱼甲病毒六个不同基因型的Eva Green荧光定量PCR引物：

上游引物(TS1)：5’-GCAACATTGCCGATCTGAGGTGTGG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物(TS2)：5’-CGTAACATGCAACGACAGCCAGTGC-3’(SEQ ID NO.3)

扩增鲑鱼甲病毒六个基因型的E2基因，片段大小为197bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR检测方法的建立

1、鲑鱼甲病毒E2基因重组质粒标准品的制备：

按照总RNA提取说明书提取鲑鱼甲病毒SAV 4640的总RNA，参照TOYOBO反转录试剂盒说明书进行反转录，将反转录所得cDNA用扩增鲑鱼甲病毒E2全长基因的引物进行常规PCR扩增，所述引物序列为：

上游引物序列：PF:5’-AGCTTCTTGCCGTCACCACCT-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物序列：PR:5’-GCGGCCGCTTGGTCCACAAGTAG-3’(SEQ ID NO.5)

PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增E2全长为1375bp，用胶回收试剂盒回收目的产物，将回收片段与pET32a载体连接，转化感受态细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序正确的阳性质粒命名为pET 32a-SAV E2，并作为DNA标准品，用分光光度仪测定浓度后进行10倍系列稀释，用于构建标准曲线。并根据标准质粒的浓度进行分析，根据公式计算出每微升质粒液体中含有的质粒拷贝数。

经计算得pET32a-SAV E2浓度为119ng/μl，根据得到的结果，将重组质粒进行10倍倍比稀释，得到的浓度为1.5×10¹⁰、1.5×10⁹、1.5×10⁸、1.5×10⁷、1.5×10⁶、1.5×10⁵、1.5×10⁴、1.5×10³，1.5×10²、1.5×10¹copies/μl的重组质粒，将其作为标准品模板。样品都设立1个阳性对照样品和阴性对照样品。阳性对照样品为上述重组质粒；阴性对照样品为去离子水。

2、Eva Green荧光定量PCR检测

分别取浓度为1.5×10¹⁰、1.5×10⁹、1.5×10⁸、1.5×10⁷、1.5×10⁶copies/μl的重组质粒pET32a-SAV E2为模板进行Eva Green荧光定量PCR的扩增，得到扩增动力学曲线和标准曲线，如图1及图2所示，标准曲线的相关系数为0.99，斜率为-3.1，由此可看出线性关系良好。

其中PCR扩增反应体系为：5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，浓度为0.3μM引物TS1、TS2各0.5μl，模板1μl，最后用灭菌的去离子水补至20μl。

PCR扩增反应程序为：

(1)95℃预变性15min；

(2)95℃变性10s、60℃退火30s，此步为一个循环，共40个循环。

当反应结束后，确认荧光定量PCR的溶解曲线，如图3所示，仅有单一套峰，引物特异性强，扩增效率最高，标准品的溶解温度都在87.2℃。

4、反应结束后，根据荧光定量PCR仪显示图片判断检测结果：

阴性样品没有扩增曲线出现，阳性样品有明显扩增曲线，且Ct值小于25。此时阴性对照和阳性对照都成立，可以对待测样品起对照作用；若待测样品扩增曲线Ct值小于或等于40，则说明样品为SAV核酸阳性；若待测样品无扩增曲线，或扩增曲线Ct值大于40，则样品为SAV核酸阴性。

实施例3鲑鱼甲病毒Eva Green荧光定量PCR检测方法的特性评价

1、灵敏度评价，即real-time PCR的最低检测限。

阳性参考DNA原液浓度为1.5×10¹⁰copies/μl。先将其10倍梯度稀释至1.5×10¹copies/μl，再分别以每个稀释度的溶液为模板，采用本发明实施例2建立的荧光定量PCR方法进行扩增，确定该方法最低可以检测到的模板量。根据检测结果，该荧光定量PCR方法最低可检测量为1.5×10¹copies/μl，说明本发明检测方法灵敏度高。

为了比较本发明建立的Eva Green荧光定量PCR引物与OIE认可的用于检测鲑鱼甲病毒普通RT-PCR引物(E2F/E2R)的灵敏性，用普通PCR检测同一模板来评价引物的最低检测限。OIE批准用于检测SAV的普通PCR引物序列为：

E2F:5’-CCGTTGCGGCCACACTGGATG-3’(SEQ ID NO.6)

E2R:5’-CCTCATAGGTGATCGACGGCAG-3’(SEQ ID NO.7)

该引物特异性扩增鲑鱼甲病毒E2基因，扩增目的片段大小为516bp。因此选用本发明建立的标准品质粒pET32a-SAV E2用灭菌的去离子水进行10倍梯度稀释，稀释质粒浓度为1.5×10¹⁰copies/μl至1.5×10¹copies/μl，再以每个稀释度的溶液为模板，分别用本研究建立的Eva Green荧光定量PCR引物和OIE认可的鉴定鲑鱼甲病毒引物(E2F/E2R)进行普通PCR，用去离子水作为阴性对照，检测同一模板来评价引物的最低检测限。

检测鲑鱼甲病毒的普通PCR反应体系见表1：

表1检测鲑鱼甲病毒普通PCR反应体系

本发明建立的荧光定量引物的PCR条件为：

95℃5min；94℃30s，58.8℃30s，72℃30s，共进行30个循环；72℃10m in。

引物E2F/E2R的PCR条件为：

95℃5min；94℃30s，57.5℃30s，72℃30s，共进行30个循环；72℃10m in。

将获得的PCR产物经2.5％核酸胶电泳，如图4和图5所示。图4显示本发明建立的Eva Green荧光定量所设计的引物最低质粒检出浓度为1.5×10⁶copies/μl，扩增片段大小为197bp；E2F/E2R引物最低质粒检测浓度为1.5×10⁷copies/μl，扩增片段大小为516bp(图5)。由此可见本发明建立的Eva Green荧光定量PCR的引物敏感性是OIE认定的鉴定鲑鱼甲病毒所用的普通PCR引物的10倍；本发明建立的荧光定量PCR方法最低可检测量为1.5×10¹copies/μl，其灵敏性远远高于普通PCR方法检测鲑鱼甲病毒，说明该发明检测方法灵敏度高。

2、特异度评价

利用本发明建立的EVA Green荧光定量PCR检测方法，在体系中分别加入了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、禽传染性法氏囊病毒(IBDV)、牛轮状病毒(BRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核酸作为阳性对照，同时以灭菌去离子水作为阴性对照，验证此方法的特异性。试验结果如图6显示，阳性对照及阴性对照均无S型曲线，只有以重组质粒pET32a-SAV E2为模板的PCR扩增，有S型曲线，说明具有很好的特异性。

3、重复性评价

采用构建好的阳性质粒pET32a-SAV E2模板，选取3个稀释度，分别作为模板在同等条件下进行扩增，每个稀释度做3个平行试验，计算Cq值的变异系数；同时，将上述所用样品保存，每周检查1次，连续检测2周，计算不同批次间Cq值的变异系数。结果显示批内变异系数在1％左右，批间变异系数均在1％以内，说明该方法具有较好的重复性(见下表2)；

表2本发明重复性试验结果

实施例4检测鲑鱼甲病毒的临床应用及灵敏性评价

由于我国目前尚未发现鲑鱼甲病毒的感染，因此采用人工感染SAV的鱼苗作为待检病料，来评价本发明建立的检测SAV的Eva Green荧光定量PCR方法。利用SAV1(V4640)和SAV2(V4583)细胞培养病毒感染健康的虹鳟幼鱼制备病料进行检测。

按照总RNA提取说明书提取各组鱼苗组织病料的总RNA，参照TOYOBO反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA并保存至-80℃备用。为了与已发表的同样检测SAV针对E1基因设计的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的灵敏性进行对比，将获得的cDNA用灭菌的去离子水进行10倍比稀释，分别用这两种方法检测同一模板来评价引物的最低检测限，每组样品做三个平行。

1、采用已发表的引物分别进行SYBR GreenⅠ和EVA Green荧光定量PCR反应的体系及程序

已发表的针对E1基因设计的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR引物序列为：

227-F：5’-GACTGGCCTCCTTACGGGG-3’(SEQ ID NO.8)

227-R：5’-TTACAACCGTGCGGTGCTGT-3’(SEQ ID NO.9)

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增反应体系为20μl，反应体系如下：

THUNDERBIRD qPCR Mix10μl，上、下游引物(0.3μM)各1μl，cDNA模板3μl，ddH₂O 5μl。

PCR扩增反应程序为：

(1)95℃预变性30s；

(2)95℃变性3s、60℃退火30s，共40个循环；

EVA Green荧光定量PCR扩增反应体系为20μl，反应体系如下：

5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，浓度为0.3μM引物TS1,TS2各0.5μl，模板1μl，最后用灭菌的去离子水补至20μl。

PCR扩增反应程序为：

(1)95℃预变性15min；

(2)95℃变性10s、60℃退火30s，此步为一个循环，共40个循环；

2、采用本发明的引物进行检测的体系及反应程序

引物序列分别如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。

PCR扩增反应体系为20μl，反应体系如下：

5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，浓度为0.3μM引物TS1，TS2各0.5μl，模板1μl，最后用灭菌的去离子水补至20μl。

PCR扩增反应程序为：

(1)95℃预变性15min；

(2)95℃变性10s、60℃退火30s，此步为一个循环，共40个循环；

试验结果如表3显示，本发明对感染SAV1(V4640)组织病料的cDNA可检测的最低稀释度为10^-6，其灵敏度是已发表引物进行Eva green荧光定量检测方法的1000倍，是已发表引物进行SYBR GreenⅠ荧光定量检测方法的100倍；对感染SAV2(V4583)组织病料的cDNA可检测的最低稀释度为10^-5，其灵敏度是已发表的引物用两种荧光定量检测方法的10倍。由此可见，本发明建立的针对SAV的Eva Green荧光定量PCR检测方法对于鲑鱼甲病毒临床样品的检测具有较高的灵敏性。

表3两种方法对感染SAV的临床样品检测的灵敏性比对

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR试剂盒及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 197

<212> DNA

<213> SAV

<400> 1

gcaacattgc cgatctgagg tgtggcttgc cctgggtgat actggcagcc gttaggactg 60

gctcctcaca cgtaaacgtc tgggagtcgc tggtgaaagt gacggttgcc aagtcagcgc 120

tcttgcattt cttgtcgaat ttcactgtgg taccaggtgg caccctcact gtgcactggc 180

tgtcgttgca tgttacg 197

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaacattgc cgatctgagg tgtgg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtaacatgc aacgacagcc agtgc 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcttcttgc cgtcaccacc t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggccgctt ggtccacaag tag 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgttgcggc cacactggat g 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctcataggt gatcgacggc ag 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gactggcctc cttacgggg 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttacaaccgt gcggtgctgt 20