K亚群禽白血病病毒荧光定量RT‑PCR检测引物组及试剂盒的制作方法

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒。

背景技术：

禽白血病病毒(Avian leukosis viruses,ALVs)是反转录病毒科、肿瘤病毒亚科的一员，该病毒群引起的所有良性和恶性肿瘤统称为禽白血病(avian leukosis,AL)。(殷震，1997)。禽白血病被列为2012-2020年国家优先防治的动物疫病之一(高鸿宾，2012)。禽白血病病毒诱发的肿瘤主要包括白血病、结缔组织肿瘤、上皮性肿瘤、内皮性肿瘤及其他相关肿瘤，其中白血病又可分为淋巴细胞性白血病(Lymphoid Leucosis,LL)、成红细胞性白血病(Erythroblastosis,EB)、成髓细胞性白血病(Myeloblastosis,MB)和髓细胞性白血病(Myelocytomatosis,ML)(Purchase et al.,1984；霍夫斯塔，1980)。

目前，病毒分离鉴定是检测禽白血病病毒最常规基础的方法，主要是测定病毒或病毒抗原，准确性较高、易操作。其缺点在于耗时长，从采样到检出结果至少需要10天时间；存在假阳性或病毒隐性未检出的可能性；花费高；操作流程繁琐。因此，该方法不适用于大范围、多样品的检测，难以在临床中推广和应用。病毒中和试验是检测禽白血病病毒最灵敏的方法之一。但存在操作步骤繁琐，耗时耗力，花费高等缺点，临床实际检测中很少用到。琼脂扩散试验是哈尔滨兽研所在20世纪80年代建立的方法。该方法需要拔羽取髓，会引起鸡群较大的应激反应，同时特异性也较低，会受内源性病毒的干扰，出现一定的假阳性。(关云涛等，2002)。IFA的基本原理是根据抗原-抗体反应，将荧光色素标记在已知抗体(或抗原)上，当其与对应的抗原(或抗体)结合后，就能够在荧光显微镜下观察到特异性的荧光信号。IFA的主要特点是特异性强，反应速度快，结果易观察，但是，操作步骤繁琐，专业要求高，耗时长，敏感度低，会因非特异染色而出现假阳性，在临床上推广范围较窄。

近几年来，禽白血病发生频繁，给我国农业经济的发展带来很大冲击。经典外源性的禽白血病病毒亚群ALV-A、ALV-B、ALV-J在检测、净化等方面已经相对成熟，而对于在2008年才发现命名的ALV-K亚群，在相关方面的研究非常滞后。因此，建立一种快速有效的针对ALV-K的检测方法就显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、简单快速的K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针，其是根据K亚群禽白血病病毒序列进行设计的。

作为优选的，所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行设计的。

所述引物对和探针的核苷酸序列如下所示：

ALV-F：5’-CCCCTGCTATTTAGGCAAGCT-3’(SEQ ID NO.1)，

ALV-R：5’-AGTTGGCAAGCACCTTGAGAA-3’(SEQ ID NO.2)，

ALV-Pb：5’-CCATGTTAGCACCCAACCACACAGAA-3’(SEQ ID NO.3)。

一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其含有如上所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针。

一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中病毒RNA；

(2)利用权利要求1-3任一项所述的引物对和探针对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增；

(3)收集荧光信号，对比标准曲线，计算得到病毒拷贝数。

RT-PCR扩增反应的条件为：42℃5min，95℃0.1min，95℃0.05min，60℃0.34min，共40个循环。

本发明的有益效果是：

本发明设计的引物和探针，能够特异性的扩增出ALV-K，种内和种间的特异性均非常好；构建阳性重组质粒，制作标准曲线，阳性质粒在8.4×10¹⁰copies/μL～8.4×10¹copies/μL之间呈现良好的线性关系，y＝-3.402x+48.355，斜率为-3.402，相关系数为R²为0.998，扩增效率Eff％为96.768；最低能够检测到8.4×10copies/μL的病毒，灵敏度是普通PCR的100倍；批内变异系数和批间变异系数均小于5％，证明此方法特异性强，灵敏度高，重复稳定性好，扩增效率高，可以用于临床ALV-K的检测。

附图说明

图1为阳性重组质粒PCR扩增产物的凝胶电泳图(M.DNA Marker 4500；1.RT-PCR产物；2.重组质粒PCR产物；3.阴性对照)；

图2为ALV-K实时荧光定量RT-PCR的标准曲线。

图3荧光定量RT-PCR的种内特异性实验结果图；

图4荧光定量RT-PCR的种间特异性实验结果图；

图5荧光定量RT-PCR的灵敏度实验结果图(1-10模板含量分别为(单位copies/μL)：8.4×10¹⁰；8.4×10⁹；8.4×10⁸；8.4×10⁷；8.4×10⁶；8.4×10⁵；8.4×10⁴；8.4×10³；8.4×10²；8.4×10¹)；

图6普通PCR的灵敏度实验结果图(1-9模板含量分别为(单位copies/μL)：8.4×10¹⁰；8.4×10⁹；8.4×10⁸；8.4×10⁷；8.4×10⁶；8.4×10⁵；8.4×10⁴；8.4×10³；10为阴性对照)；

图7为ALV-K对机体生长发育的影响柱形图；

图8不同脏器中基因拷贝数的比较。

具体实施方式

下面结合实施了对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

1实验材料

毒株、细胞

美国ATCC鸡胚成纤维细胞系(DF-1)、A亚群禽白血病RAV-1株(GenBank登录号：M19113)、B亚群禽白血病RAV-2株(GenBank登录号：M14902)、J亚群禽白血病HPRS-103株(GenBank登录号：Z46390)、E亚群禽白血病RAV-0株(GenBank登录号：M12172)、K亚群禽白血病GDFX0601株(GenBank登录号：KP686142.1)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)为华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室保存。

2实验方法与结果

2.1阳性重组质粒的构建

参考GDFX0601株前病毒全基因组，设计了一对引物用于质粒标准品的构建：env-F：5’-CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGATAC-3’(SEQ ID NO.4)；env-R：5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCATTTTCG-3’(SEQ ID NO.5)。利用该引物对特异性的扩增ALV-K，目的基因1850bp，琼脂凝胶电泳结果显示在1850bp附近有一条特异性的目的条带；再以构建的阳性质粒为模板，得到预期大小的目的条带(图1)，测序结果显示插入的基因序列与目的基因一致，结果表明阳性重组质粒构建成功。

质粒标准品的定量：DNA拷贝数＝{[X(g/μL)DNA/DNA长度bp×660]×6.02×10²³}＝Y(拷贝/μL)。用蛋白核酸定量仪测定阳性重组质粒DNA浓度，质粒浓度为170ng/μL＝170×10^-9g/μL；质粒的分子量＝1850(碱基总数)×660(碱基对的平均分子量)；DNA拷贝数＝(170×10^-9×6.02×10²³)/(1850×660)＝8.4×10¹⁰copies/μL。

2.2 RT-PCR引物和探针的设计与合成.

选取K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行TaqMan探针法荧光定量RT-PCR引物的设计。如表1所示。将探针的5’端以荧光报告基团FAM标记；3’端以荧光淬灭基团Eclips标记，引物和探针均由大连宝生物工程有限公司合成。

表1荧光定量RT-PCR引物及探针

2.3 RT-PCR反应体系与条件的优化

按TaKaRa荧光定量试剂盒One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)说明书进行荧光定量RT-PCR，20μL反应体系：

反应条件：42℃5min，95℃0.1min，95℃0.05min，60℃0.34min，共40个循环。

2.4标准曲线的建立

将阳性标准品(阳性重组质粒)10倍梯度稀释(8.4×10¹⁰copies/μL～8.4×10¹copies/μL)，每个稀释度做3个重复，用优化的实时荧光定量RT-PCR进行目的基因的扩增，软件分析系统将自动生成以模板DNA拷贝数为横坐标，以CT值为纵坐标的标准曲线。结果显示阳性标准品在8.4×10¹⁰copies/μL～8.4×10¹copies/μL之间呈现良好的线性关系，拟合得到的标准曲线为y＝-3.402x+48.355，斜率为-3.402，相关系数R²为0.998，扩增效率Eff％为96.768。(图2)。

2.5荧光定量RT-PCR方法的稳定性检测

用优化的荧光定量RT-PCR条件对8.4×10⁷copies/μL、8.4×10⁵copies/μL、8.4×10³copies/μL 3个稀释度的阳性标准品进行3次重复，每个稀释度设3个重复，计算其批内变异系数(intra-assay CV％)。此外，设置3个不同时间重复试验，每次间隔1周，计算其批间变异系数(inter-assay CV％)。结果如表2所示。批内标准差在0.017～0.105之间，变异系数在0.055％～0.565％之间；批间标准差在0.496～0.754之间，变异系数在2.229％～3.321％之间，变异系数均小于5％，证明该方法重复稳定性高，可在临床应用中推广。

表2(a)ALV-K荧光定量RT-PCR批内稳定性

表2(b)ALV-K荧光定量RT-PCR批间稳定性

实施例2特异性实验

以ALV-K、ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-E为模板，进行荧光定量RT-PCR，检测其种内特异性。再以ALV-K、NDV、REV、AIV、MDV、IBV、DF-1为模板，检测其种间特异性。结果表明只有ALV-K呈现“S”型的扩增曲线，ALV的其他亚群以及其他病毒均未出现扩增曲线，证明该方法具有高度的特异性，能有效的检出ALV-K，并能够与其他病毒区分开(见图3和图4)。

实施例3灵敏度实验

将阳性重组质粒从8.4×10¹⁰copies/μL开始10倍梯度稀释，以每个稀释度为模板，进行荧光定量RT-PCR反应。设计一对引物(F：5’-ACGCTTTCAGATTGGTCC-3’(SEQ ID NO.6)；R：5’-AAGCGAGAACCTGTCTGTGC-3’(SEQ ID NO.7))，目的基因182bp，以同样稀释的阳性重组质粒为模板，进行常规PCR反应，比较两种检测方法的灵敏度。结果显示荧光定量RT-PCR最低能够检测8.4×10¹copies/μL的核酸，普通PCR最低只能检测到8.4×10³copies/μL，证明TaqMan探针荧光定量RT-PCR的灵敏度是普通PCR的100倍，该方法适用于临床对ALV-K的检测和鸡场净化(图5和图6)。

实施例4 ALV-K荧光定量RT-PCR的临床应用

1、实验动物攻毒

1日龄SPF鸡110只，分为两组，一组接种4×10⁴TCID₅₀的ALV-K，另一组作为空白对照，严格隔离饲养，在性成熟时期，无菌操作取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，带回实验室提取组织病料的DNA。随机抽取五周龄(35d)攻毒组和对照组的鸡各5只，剖检称重，对比ALV-K对鸡群生长发育的影响。剖检性成熟时期的两组鸡，观察病鸡各组织脏器的病理变化。

观察性成熟时期攻毒组的病鸡，临床上无典型症状，未出现肉眼可见的肿瘤。病鸡消瘦，精神萎靡，部分病鸡出现跛行，腿根部有隆起的肿块。剖检病鸡，病鸡脚掌心、胸腺、肝脏、心脏、脾脏等处均有点状出血，盲肠扁桃体出现灰白色坏死灶。剖检四周龄(35d)病鸡，分别对病鸡的脾脏、法氏囊和胸腺称重，如图7所示，病鸡体重消瘦明显，法氏囊重量也有所减轻，脾脏和胸腺的重量变化不大，结果表明ALV-K对机体的生长发育会产生明显的抑制作用。

2、ALV-K在不同脏器中mRNA的表达水平

检测ALV-K在不同组织脏器中mRNA的表达水平采用绝对定量法计算。实验中设置无模板对照(双蒸水)、阴性对照(健康鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)和8.4×10⁸copies/μL～8.4×10copies/μL 8个不同稀释度的重组质粒作为阳性对照，每个稀释度设3个重复。待检样品为攻毒SPF鸡的组织病料，进行TaqMan探针荧光定量RT-PCR反应，反应结束后，系统会自动通过与标准品扩增曲线进行比较，得到待检鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的拷贝数，以确定ALV-K在不同脏器中mRNA的表达水平。结果显示ALV-K在鸡体内各脏器中均有所分布和表达。如图8所示，通过对比5只攻毒鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的病毒拷贝数，发现在每只鸡体内肝脏、脾脏和肾脏的病毒含量均显著高于心脏和肺脏的。

以上实施例表明，本发明设计的引物和探针，能够特异性的扩增出ALV-K，种内和种间的特异性均非常好；最低能够检测到8.4×10copies/μL的病毒，灵敏度是普通PCR的100倍；批内变异系数和批间变异系数均小于5％，证明此方法特异性强，灵敏度高，重复稳定性好，扩增效率高，可以用于临床ALV-K的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccctgctat ttaggcaagc t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agttggcaag caccttgaga a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccatgttagc acccaaccac acagaa 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cgcggatccg ccaccatgga agccgtcata aaggcatttc tgactggata c 51

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagcgagaac ctgtctgtgc 20