一种以植物生物质为培养基质制备解磷菌PA02固体菌剂的方法与流程

本发明属于植物生物质资源化利用和农业微生物技术领域，具体涉及一种以植物生物质凤眼莲秸秆为培养基质制备解磷菌pa02固体菌剂的方法。

背景技术：

磷是植物生长发育的重要营养元素，但是土壤中的磷主要以难溶性磷酸盐的形式存在，植物无法直接吸收利用。解磷菌可以将土壤中的难溶性磷酸盐转化成为溶解态磷让植物直接吸收利用，从而提高土壤中磷的利用效率并改善土壤生态环境。

通常情况下解磷菌的扩繁以葡萄糖、蛋白胨等化学药品为培养基质，还需要附着载体才能制备成固体菌剂。

植物生物质作为自然界中最为丰富的可再生生物质资源，具有数量巨大、成本低廉的特性。植物生物质中不仅富含纤维素、半纤维素和木质素，还有一定量的蛋白质，如水生植物凤眼莲中纤维素、半纤维素、蛋白质的含量分别为24.9％、23.2％和20.4％。如将植物生物质转化为生物产品替代化学药品，不仅可以减轻环境污染，还可以缓解能源危机，具有很大的发展前景。

但是，自然情况下植物细胞壁中的蛋白质与纤维素、半纤维素和木质素等共同作用形成致密而复杂的结构，阻碍了纤维素的酶解。植物细胞壁中蛋白质性状及含量的变化均可能影响纤维素的结构，或者影响纤维素酶自身的活性，进而影响纤维素的酶解效果。然而，关于植物细胞壁中蛋白质性状及含量变化对纤维素结构特性与酶解效率的影响的研究很少，也鲜见利用植物生物质完全代替化学药品扩繁解磷菌的报道。因此，研究利用植物生物质替代葡萄糖、蛋白胨等化学药品作为解磷菌生长的基质和附着的载体制备固体解磷菌菌剂的工艺技术具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种解磷菌pa02,以及一种以植物生物质凤眼莲秸秆代替化学培养基作为解磷菌生长繁殖基质和附着载体制备解磷菌固体菌剂的方法，可实现废弃植物生物质的资源化利用，并降低解磷菌培养成本。

本发明采用的技术方案：一种解磷菌pa02，菌株名称为penicilliumjanthinellumpa02，已于2015年12月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2015758，地址：中国，武汉，武汉大学。

本技术方案的效果是：本发明所提供的解磷菌pa02可以提高土壤的难溶性磷的利用效率。

进一步地，利用引物ist1和ist4对菌株pa02的18srdna进行扩增和正向测序，获得555bp长度的扩增产物，通过blast将序列与genbank数据库中的序列进行对比，其与微紫青霉菌(penicilliumjanthinellum)的相似度大于99％，结合形态特征、培养特性鉴定该菌株为微紫青霉菌。

本发明采用的技术方案：一种以植物生物质为培养基质制备解磷菌pa02固体菌剂的方法，包括以下步骤：s1：凤眼莲的碱预处理：在250ml瓶中加入1g凤眼莲秸秆和100ml去离子水，再加入氢氧化钠并调节溶液的ph值为12-14，并在常温下以180rpm摇床震荡24h，然后用去离子水冲洗固体物质至中性，重新定容到100ml；s2：凤眼莲的蛋白酶水解:在上述步骤s1的凤眼莲溶液中添加5g/l蛋白酶0.6-1ml，使溶液中酶浓度达到30-50mg/l，在35℃、100rpm下震荡酶解24h；s3：凤眼莲的纤维素酶解：用6m的盐酸调节步骤s2中的凤眼莲溶液的ph值至4.8，添加纤维素酶10-30fpu，在50℃、125rpm下震荡酶解48h，获得凤眼莲酶解液；s4：将上述凤眼莲酶解液置于121℃下灭菌30min后冷却，取上述解磷菌pa02菌液1ml加到所述凤眼莲酶解液中，在30℃、180rpm下振荡培养7d，然后用离心分离法在3000rpm下离心倒去上清液，将固体物质在50℃烘干，可获得0.22～0.26g固态解磷菌pa02。

本技术方案的效果是：以植物生物质凤眼莲秸秆完全代替化学培养基作为解磷菌生长繁殖的基质和附着的载体，这不仅实现了废弃植物生物质的资源化利用，降低了解磷菌pa02的培养成本，而且所获得的固态解磷菌菌剂应用于生物有机肥中还可以提高土壤中难溶性磷的利用效率，具有显著的环境效益和经济效益。

进一步地，步骤s1中，凤眼莲秸秆为40-100目。

进一步地，步骤s1中，调节溶液的ph值为12、13、13.5或14。

进一步地，步骤s2中，在凤眼莲溶液中添加5g/l蛋白酶1ml，使溶液中酶浓度达到50mg/l，在35℃、100rpm下震荡酶解24h。

进一步地，步骤s3中，添加纤维素酶30fpu。

附图说明

图1为凤眼莲秸秆经不同ph预处理并酶解后还原糖和蛋白质浓度测定结果图；

图2为解磷菌pa02在难溶性磷酸铝液体培养基中溶磷量和ph的动态变化图；

图3为以凤眼莲秸秆为培养基质制备的解磷菌pa02固体菌剂的sem照片。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明以植物生物质凤眼莲秸秆为解磷菌pa02的生长基质和附着载体制备解磷菌固体菌剂，该解磷菌pa02菌株名称为penicilliumjanthinellumpa02，已于2015年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2015758，地址：中国，武汉，武汉大学。

实施例1植物生物质凤眼莲秸秆的预处理

(1)凤眼莲秸秆的碱预处理：以40-100目的凤眼莲秸秆为原料，在5个250ml锥形瓶中分别加入1g凤眼莲秸秆和100ml去离子水，再分别加入氢氧化钠0、0.04、0.4、2和4g，调节溶液ph值为12、13、13.5和14，常温180rpm下摇床震荡24h；用去离子水冲洗固体物质至中性，然后将洗好的固体转移至250ml干燥锥形瓶中，重新定容到100ml。

(2)凤眼莲的蛋白酶水解：在步骤(1)的5个中性凤眼莲溶液中分别添加5g/l蛋白酶1ml，使溶液中蛋白酶浓度达到50mg/l，并在35℃、100rpm下震荡酶解24h，取样5ml上清液测定蛋白质浓度，水系过滤至10ml离心管。

(3)凤眼莲的纤维素酶解：用6m盐酸调节步骤(2)中凤眼莲溶液ph至4.8，添加纤维素酶30fpu，在50℃、125rpm下震荡酶解48h，取样三次测定上清液还原糖的浓度。

凤眼莲秸秆经不同ph预处理和蛋白酶、纤维素酶酶解后，溶液中的还原糖和蛋白质浓度如图1所示。由图1可知，ph13.5预处理后凤眼莲秸秆的还原糖和蛋白质浓度最高，分别达到2136.3和1416.3mg/l。

实施例2解磷菌pa02溶磷能力测定

对实验室筛选获得的解磷菌pa02溶解磷酸铝的能力进行测定。

(1)配制难溶性磷酸铝液体培养基：组成成分为：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，mgso4·7h2o0.3g，mnso4·h2o0.03g，feso4·7h2o0.03g，alpo45g，蒸馏水1000ml；将alpo4与其它药品分别灭菌后混合，调节溶液ph为7.0-7.2。

(2)解磷菌pa02溶磷能力测定：在250ml三角瓶中加入100ml难溶性磷酸铝液体培养基，接种1ml活化后的解磷菌pa02孢子液，在30℃、180rpm下连续培养5d。每天取5ml培养液，于5000r/min下离心10min后取上清液，采用钼锑抗分光光度法测定上清液中的可溶性磷含量，并用ph计测定溶液ph值变化，结果如图2所示。由图2可知，随着解磷菌pa02的生长和溶磷量的升高，溶液ph逐渐下降，溶磷量在第4天达到119.3mg/l的最高值，同时ph降低至2.9。

实施例3以植物生物质为培养基质制备解磷菌固体菌剂

将实施例1中预处理的凤眼莲秸秆溶液在121℃下灭菌30min后冷却，取实施例2中的解磷菌pa02菌液1ml到凤眼莲秸秆溶液中，在30℃、180rpm的恒温摇床中振荡培养7d，然后用离心机在3000rpm下离心倒去上清液，将固体物质在50℃烘干获得固态解磷菌，称重。结果表明，转化1g植物生物质可获得0.26g的固体解磷菌菌剂。采用jeoljsm-6390lv扫描电子显微镜对获得的固体解磷菌进行50～5000倍的放大观察并拍照，结果如图3所示。

如此，本发明所提供的解磷菌pa02，可以提高土壤的难溶性磷的利用效率，具有显著的环境效益和经济效益；同时以植物生物质为培养基质制备解磷菌pa02固体菌剂的方法，以植物生物质凤眼莲秸秆完全代替化学培养基作为解磷菌生长繁殖的基质和附着的载体，这不仅实现了废弃植物生物质的资源化利用，降低了解磷菌pa02的培养成本，而且所获得的固态解磷菌菌剂应用于生物有机肥中还可以提高土壤中难溶性磷的利用效率，具有显著的环境效益和经济效益，应用前景广阔。

可以理解地，酶浓度越高，酶解效果越好。在凤眼莲的蛋白酶水解时，可在凤眼莲溶液中添加5g/l蛋白酶0.6-1ml，从而使溶液中酶浓度达到30-50mg/l；在凤眼莲的纤维素酶解时，可添加纤维素酶10-30fpu。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。