本发明涉及农副产品深加工技术领域，具体涉及一种肝素钠的提取方法。
背景技术：
肝素钠是带强负电荷的粘多糖，平均分子量为15000道尔顿，用于防治血栓形成或栓塞性疾病；各种弥漫性血管内凝血；也用于血液透析、体外循环、导管术、微血管手术等操作中及某些血液标本或器械的抗凝处理。肝素钠粗品是纯化肝素钠的原料，由猪、羊的小肠肠粘膜或牛肺提取而得。
目前肝素钠粗品提取生产工艺都采用酶解---树脂吸附法，行业平均出品率一般在1600-1680条猪小肠提取一个亿单位(不含肠皮)，工艺流程主要分为酶解、树脂吸附、洗涤洗脱、酒精沉淀、脱盐干燥等工序。其中酶解工序是整个流程中的重要工序，酶解程度的大小是决定出品率高低的关键因素。传统的采用碱性蛋白酶进行酶解的过程大多是加入碱性蛋白酶后直接升温至50～55℃后完成一次酶解，直接进行过滤和吸附收集肝素钠，每条猪小肠平均可酶解解离出66000USP单位的肝素钠(平均质量1.25kg，平均长度19米-19.5米的健康猪小肠，下同)，酶解折合出品率1600～1700条/亿单位。而理论上每条猪小肠(不含肠皮)含72000-75000USP单位的肝素钠，其酶解解离回收率为90％-92％，还有8％-10％的肝素未解离出来。
为了提高肝素钠的产率，出现了一些针对酶解过程的研究和改进，如中国专利CN10600875A和CN104448049A均公开了采用二次酶解的方式从猪肠衣中提取肝素钠，但是上述公开的二次酶解过程中对于酶解温度、盐度等的控制不够合理，使得对于肝素钠产率的提升不够显著。因此，需要研究开发出一种新的方法，进一步的提高肝素钠的提取效率。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种肝素钠的提取方法，提高从猪小肠提取肝素钠的产率。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种肝素钠的提取方法，包括以下操作步骤：
1)一次酶解：将准备好的猪肠黏膜原料加入盐度为4.0～4.5度的氯化钠水溶液中，混合均匀，得混合液，加入pH调节剂调节混合液的pH值，并将混合液升温至33±2℃后，加入碱性蛋白酶，持续升温至38±2℃后恒温保持酶解1～1.5小时，完成第一次酶解；
2)二次酶解：第一酶解结束后，加入pH调节剂调节混合液的pH值，调节混合液的盐度为3.0～3.5度，持续升温至55±1℃后，恒温保持酶解2.5～3小时，完成第二次酶解；
3)蛋白质变性：第二次酶解结束后，持续升温至81±1℃，除去上层杂质，保温，过滤，得酶解液；
4)将步骤3)制备的酶解液依次经过吸附、洗涤、洗脱、沉淀、脱水脱盐、干燥，即完成。
可选的，步骤1)和步骤2)中调节混合液的pH值为9.0±0.2。
进一步的，步骤1)第一次酶解过程中和步骤2)第二次酶解过程中保持混合液的pH不低于8.2。
进一步的，步骤1)和步骤2)中采用实时监控和补加pH调节剂的方式保持混合液的pH值不低于8.2。
可选的，步骤1)第一次酶解过程中采用实时监控的方式控制酶解过程的温度不低于35℃；步骤2)第二次酶解过程中采用实时监控的方式控制酶解过程中的温度不低于52℃。
上述对pH和温度的实时监控具体为每20～30分钟测定一侧pH值和温度。
上述盐度采用波美比重计测定。
可选的，步骤1)中碱性蛋白酶的加入量为每条猪肠对应加入4～4.5g碱性蛋白酶。
进一步的，所述碱性蛋白酶为胰蛋白酶或糜蛋白酶。
可选的，所述pH调节剂为2.2～2.5mol/L的氢氧化钠溶液。
可选的，步骤2)中所述氯化钠水溶液的质量百分浓度为3.0～3.5％。
可选的，步骤3)中保温时间为10～15分钟。
可选的，步骤4)所述吸附为将步骤3)制备的酶解液降温至56±2℃后，调整酶解液的pH＝8.5±0.2，盐度＜4度，加入吸附树脂，搅拌吸附。
可选的，所述吸附树脂的加入量为每条猪肠加入15～20g吸附树脂。
可选的，所述搅拌吸附的时间≥8小时，通常采用搅拌吸附过夜。完成吸附操作后的酶解液的pH值应为8.0±0.5，盐度应为3～4度。
可选的，步骤4)中所述洗涤为取吸附完成后的吸附树脂用热水清洗、沥干。吸附完成后的酶解液取出吸附树脂后作为废液按要求排放。
可选的，步骤4)中所述洗脱为在洗涤后的吸附树脂中加入2倍树脂量质量百分浓度为4％的氯化钠溶液中，在55±5℃温度下保温搅拌30～50分钟，完成一次洗脱，固液分离得一次洗脱液和一次洗脱树脂；在一次洗脱树脂中加入等倍树脂量的饱和氯化钠溶液，在55±5℃温度下保温搅拌4～5小时，完成二次洗脱，固液分离得二次洗脱液和二次洗脱树脂；在二次洗脱树脂中加入等倍树脂量的饱和氯化钠溶液，在55±5℃温度下保温搅拌1～1.5小时，完成三次洗脱，固液分离得三次洗脱液和三次洗脱树脂。
可选的，步骤4)中所述沉淀为合并一次洗脱液、二次洗脱液和三次洗脱液，得混合洗脱液，在混合洗脱液中加入乙醇至乙醇质量百分浓度为40～45％，搅拌30～50分钟，静置过夜分层，下层为肝素钠沉淀，固液分离得肝素钠粗品。
可选的，步骤4)中所述脱水脱盐为在肝素钠粗品中加入质量百分浓度为95％的乙醇溶液脱盐脱水2～3次。
可选的，步骤4)中所述干燥为将脱水脱盐后的肝素钠粗品在70～80℃条件下烘干。
可选的，所述猪肠黏膜原料由健康猪肠制备而成，具体为：取猪肠用清水仔细清洗去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净的猪肠，将洁净的猪肠绞碎成糜状，得猪肠黏膜原料。
上述采用的健康猪肠每条的平均重量为1.25kg的健康猪小肠。
本发明肝素钠常温下可贮存3个月，0～10℃温度下密封可长期保存。
本发明肝素钠的提取方法，采用在不同温度和盐度条件下二次酶解的方式，并且在现有技术中没有公开温度和盐度的调整能够提高肝素钠的产量的前提下，创造性的选择一次酶解的温度为38±2℃，盐度为4.0～4.5，选择二次酶解的温度为55±1℃，盐度为3.0～3.5度，使肝素钠出品率达到1490～1510条/亿单位，相比传统的一次酶解和现有技术中公开的二次酶解的方法，提高酶解解离回收率，最终提高肝素钠的产率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种肝素钠的提取方法，具体操作步骤为：
1)准备猪肠黏膜：取每条平均重量为1.25kg的健康猪小肠，用清水仔细清洗去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净的猪肠，将洁净的猪肠绞碎成糜状，得猪肠黏膜；
2)一次酶解：将准备好的猪肠黏膜泵入酶解罐，开启搅拌并泵入浓盐水至盐度为4.2度，加入2.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为9.0，得混合液，开启加温阀，将混合液升温至33℃时，按照每条猪肠加入4.2g的加入量，加入碱性蛋白酶，继续升温至38℃后，关闭加温阀，复测pH值，补加2.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为9.0，保温搅拌1小时，完成一次酶解，保温搅拌过程中每隔20分钟测定一次pH值和温度，通过补加2.5mol/L氢氧化钠溶液，开启加温阀加温的方式控制pH值不低于8.2，温度不低于35℃；
3)二次酶解：一次酶解完成后，开启加温阀，升温至55℃，关闭加温阀，复测pH值，补加2.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为9.0，测定酶解液的盐度，调整酶解液的盐度为3.2度，保温搅拌3小时，完成二次酶解，保温搅拌过程中每隔30分钟检测一次pH值和温度，通过补加2.5mol/L氢氧化钠溶液，开启加温阀加温的方式控制pH值不低于8.2，温度不低于52℃；
4)蛋白质变性：二次酶解完成后，开启加温阀，快速升温至81℃后，撇去上浮油沫，保温10分钟后，测定肝素钠的效价，符合要求后，过滤，得酶解液；
5)吸附：将步骤4)制备的酶解液降温至56℃，调整其pH值为8.5，盐度小于4度，按照每条猪肠加入18g吸附树脂的加入量加入吸附树脂，搅拌吸附过夜，时间为9小时，完成吸附；
6)洗涤：测定肝素钠的效价，符合要求后，将步骤5)完成吸附后的酶解液进行固液分离，得吸附完成后的吸附树脂，采用热水清洗、沥干吸附树脂，完成洗涤；
7)洗脱：在洗涤后的吸附树脂中加入2倍树脂量的质量百分浓度为4％的氯化钠溶液，55℃温度下保温洗脱30分钟后，完成一次洗脱，固液分离，得一次洗脱液和一次洗脱树脂；在一次洗脱树脂中加入等倍树脂量的饱和氯化钠溶液，在55℃温度下保温搅拌4小时，完成二次洗脱，固液分离得二次洗脱液和二次洗脱树脂；在二次洗脱树脂中加入等倍树脂量的饱和氯化钠溶液，在55℃温度下保温搅拌1小时，完成三次洗脱，固液分离得三次洗脱液和三次洗脱树脂，三次洗脱树脂浸泡在饱和氯化钠溶液中可用于下一次吸附操作；
8)沉淀：合并一次洗脱液、二次洗脱液和三次洗脱液，得混合洗脱液，在混合洗脱液中加入乙醇至乙醇质量百分浓度为42％，搅拌30分钟，静置过夜分层，下层为肝素钠沉淀，固液分离得肝素钠粗品；
9)脱水脱盐：在步骤8)制备的肝素钠粗品中加入质量百分浓度为95％的乙醇溶液脱盐脱水2次，回收乙醇溶液重复利用；
10)干燥：将步骤9)脱水脱盐后的肝素钠粗品在75℃条件下烘干；
11)检测、入库、贮存：步骤10)干燥后的肝素钠检测效价后，入库贮存。
实施例2
一种肝素钠的提取方法，具体操作步骤为：
1)准备猪肠黏膜：取每条平均重量为1.25kg的健康猪小肠，用清水仔细清洗去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净的猪肠，将洁净的猪肠绞碎成糜状，得猪肠黏膜；
2)一次酶解：将准备好的猪肠黏膜泵入酶解罐，开启搅拌并泵入浓盐水至盐度为4.0度，加入2.2mol/L氢氧化钠溶液至pH为8.8，得混合液，开启加温阀，将混合液升温至31℃时，按照每条猪肠加入4g的加入量，加入碱性蛋白酶，继续升温至36℃后，关闭加温阀，复测pH值，补加2.2mol/L氢氧化钠溶液至pH为8.8，保温搅拌1.5小时，完成一次酶解，保温搅拌过程中每隔20分钟测定一次pH值和温度，通过补加2.2mol/L氢氧化钠溶液，开启加温阀加温的方式控制pH值不低于8.2，温度不低于35℃；
3)二次酶解：一次酶解完成后，开启加温阀，升温至54℃，关闭加温阀，复测pH值，补加2.2mol/L氢氧化钠溶液至pH为8.8，测定酶解液的盐度，调整酶解液的盐度为3.0度，保温搅拌2.5小时，完成二次酶解，保温搅拌过程中每隔30分钟检测一次pH值和温度，通过补加2.2mol/L氢氧化钠溶液，开启加温阀加温的方式控制pH值不低于8.2，温度不低于52℃；
4)蛋白质变性：二次酶解完成后，开启加温阀，快速升温至80℃后，撇去上浮油沫，保温15分钟后，测定肝素钠的效价，符合要求后，过滤，得酶解液；
5)吸附：将步骤4)制备的酶解液降温至54℃，调整其pH值为8.3，盐度小于4度，按照每条猪肠加入15g吸附树脂的加入量加入吸附树脂，搅拌吸附过夜，时间为8小时，完成吸附；
6)洗涤：测定肝素钠的效价，符合要求后，将步骤5)完成吸附后的酶解液进行固液分离，得吸附完成后的吸附树脂，采用热水清洗、沥干吸附树脂，完成洗涤；
7)洗脱：在洗涤后的吸附树脂中加入2倍树脂量的质量百分浓度为4％的氯化钠溶液，50℃温度下保温洗脱50分钟后，完成一次洗脱，固液分离，得一次洗脱液和一次洗脱树脂；在一次洗脱树脂中加入等倍树脂量的饱和氯化钠溶液，在50℃温度下保温搅拌5小时，完成二次洗脱，固液分离得二次洗脱液和二次洗脱树脂；在二次洗脱树脂中加入等倍树脂量的饱和氯化钠溶液，在50℃温度下保温搅拌1.5小时，完成三次洗脱，固液分离得三次洗脱液和三次洗脱树脂，三次洗脱树脂浸泡在饱和氯化钠溶液中可用于下一次吸附操作；
8)沉淀：合并一次洗脱液、二次洗脱液和三次洗脱液，得混合洗脱液，在混合洗脱液中加入乙醇至乙醇质量百分浓度为40％，搅拌50分钟，静置过夜分层，下层为肝素钠沉淀，固液分离得肝素钠粗品；
9)脱水脱盐：在步骤8)制备的肝素钠粗品中加入质量百分浓度为95％的乙醇溶液脱盐脱水3次，回收乙醇溶液重复利用；
10)干燥：将步骤9)脱水脱盐后的肝素钠粗品在70℃条件下烘干；
11)检测、入库、贮存：步骤10)干燥后的肝素钠检测效价后，入库贮存。
实施例3
一种肝素钠的提取方法，具体操作步骤为：
1)准备猪肠黏膜：取每条平均重量为1.25kg的健康猪小肠，用清水仔细清洗去除内外污物和外部皮肤脂肪，得到洁净的猪肠，将洁净的猪肠绞碎成糜状，得猪肠黏膜；
2)一次酶解：将准备好的猪肠黏膜泵入酶解罐，开启搅拌并泵入浓盐水至盐度为4.5度，加入2.4mol/L氢氧化钠溶液至pH为9.2，得混合液，开启加温阀，将混合液升温至35℃时，按照每条猪肠加入4.5g的加入量，加入碱性蛋白酶，继续升温至40℃后，关闭加温阀，复测pH值，补加2.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为9.2，保温搅拌1.2小时，完成一次酶解，保温搅拌过程中每隔20分钟测定一次pH值和温度，通过补加2.4mol/L氢氧化钠溶液，开启加温阀加温的方式控制pH值不低于8.2，温度不低于35℃；
3)二次酶解：一次酶解完成后，开启加温阀，升温至56℃，关闭加温阀，复测pH值，补加2.4mol/L氢氧化钠溶液至pH为9.2，测定酶解液的盐度，调整酶解液的盐度为3.5度，保温搅拌2.8小时，完成二次酶解，保温搅拌过程中每隔30分钟检测一次pH值和温度，通过补加2.4mol/L氢氧化钠溶液，开启加温阀加温的方式控制pH值不低于8.2，温度不低于52℃；
4)蛋白质变性：二次酶解完成后，开启加温阀，快速升温至82℃后，撇去上浮油沫，保温12分钟后，测定肝素钠的效价，符合要求后，过滤，得酶解液；
5)吸附：将步骤4)制备的酶解液降温至58℃，调整其pH值为8.7，盐度小于4度，按照每条猪肠加入20g吸附树脂的加入量加入吸附树脂，搅拌吸附过夜，时间为10小时，完成吸附；
6)洗涤：测定肝素钠的效价，符合要求后，将步骤5)完成吸附后的酶解液进行固液分离，得吸附完成后的吸附树脂，采用热水清洗、沥干吸附树脂，完成洗涤；
7)洗脱：在洗涤后的吸附树脂中加入2倍树脂量的质量百分浓度为4％的氯化钠溶液，60℃温度下保温洗脱40分钟后，完成一次洗脱，固液分离，得一次洗脱液和一次洗脱树脂；在一次洗脱树脂中加入等倍树脂量的饱和氯化钠溶液，在60℃温度下保温搅拌4.5小时，完成二次洗脱，固液分离得二次洗脱液和二次洗脱树脂；在二次洗脱树脂中加入等倍树脂量的饱和氯化钠溶液，在60℃温度下保温搅拌1.2小时，完成三次洗脱，固液分离得三次洗脱液和三次洗脱树脂，三次洗脱树脂浸泡在饱和氯化钠溶液中可用于下一次吸附操作；
8)沉淀：合并一次洗脱液、二次洗脱液和三次洗脱液，得混合洗脱液，在混合洗脱液中加入乙醇至乙醇质量百分浓度为45％，搅拌40分钟，静置过夜分层，下层为肝素钠沉淀，固液分离得肝素钠粗品；
9)脱水脱盐：在步骤8)制备的肝素钠粗品中加入质量百分浓度为95％的乙醇溶液脱盐脱水2次，回收乙醇溶液重复利用；
10)干燥：将步骤9)脱水脱盐后的肝素钠粗品在80℃条件下烘干；
11)检测、入库、贮存：步骤10)干燥后的肝素钠检测效价后，入库贮存。
对比例1
本对比例与实施例1不同的是，酶解过程中温度设定为55℃，酶解4小时，仅进行一次酶解，其他同实施例1。
对比例2
本对比例与实施例1不同的是，一次酶解过程中盐度调整为5度，温度为52℃，二次酶解过程中盐度调整为4.2度，温度为62℃，其他同实施例1。
比较试验：
对比实施例1、对比例1和对比例2对同等质量的猪小肠肝素钠提取效果对比，如下表1所示：
表1
表1中酶解解离回收率(％)为：酶解后测定的肝素钠单位效价*总体积/理论总效价*100％(一般一条小肠理论总效价为7.2万单位)
由上述表1所示的数据可知，相比对比文件1的一次酶解和对比文件2公开的二次酶解，实施例1中通过具体限定二次酶解过程中每次酶解的温度和盐度，进一步提高了酶解解离回收率，最终提高肝素钠的产率。
实施例2和实施例3对肝素钠的提取效率基本等同，本发明方法提取肝素钠的平均出品率为1450～1490条/亿单位(不含肠皮)。