一种提高水生植物富磷能力的方法与流程

本发明涉及一种植物改造方法，尤其涉及一种提高水生植物富磷能力的方法。

背景技术：

水体富营养化是一种氮、磷等元素含量过多引起的水质污染现象。目前在水体治理、水污染控制方面，比较重视氮控制，磷控制相对薄弱。但事实说明，磷的富营养化阈值是氮的十分之一以下。因此，在水体富营养化控制与修复过程中，控制磷元素可以达到事半功倍的效果。

专利号为01010251475.X的中国发明专利，公开了一种缺磷反应调控蛋白及其编码基因和应用。简单来说，该发明的应用限于植物育种；该发明要解决农业生产中，土壤中缺乏磷元素的问题。而我们现在要解决的是水体中磷元素过多的问题。虽然具有一定的相似性，但在运用上还是有诸多限制。因此，水体中磷元素的富营养化仍是当前亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明要解决上述问题，从而提供一种提高水生植物富磷能力的方法。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

一种提高水生植物富磷能力的方法，通过增加PHR1转录因子的过量表达和剪除PHO2基因，从而提高其富磷能力。

具体分成两步：

（1）第一步增加PHR1转录因子的过量表达；

（2）第二步剪除PHO2基因。

作为优选，所述的增加PHR1转录因子的过量表达，是将转录因子PHR1不包括启动子区域的基因组DNA构建到pCAMBIA1300的双元转基因载体，用于过量表达PHR1。

以Border(left)、Border(right)为界，PCAMBIA1300的结构分成两个部分组成：一是基础结构部分，包括kanamycin(R)、pBRori、pBRbom、PVS1rep、PVS1sta；二是进入基因体内改造部分，包括polyA、Hygomycin(R)、caMV35s、IacZ alpha以及钥匙片段（EcoRI(1)、SacI(11)、PstI(44)、HindIII(52)）、过量片段spuer promoter。

增加PHR1转录因子的过量表达，具体方法是：

进入基因体内改造部分通过Hygomycin(R)、caMV35s、IacZ alpha引导进入PHR1基因段内，由钥匙片段EcoRI(1)、SacI(11)、PstI(44)、HindIII(52)，分别对应打开基因片段TCTAGA、CTGCAG、GTCGAC、AAGCTT，然后由过量片段spuer promoter对PHR1整个系列进行克隆增强表达。

本发明上述技术方案中，整个序列指的是基因的全长。

敲除PHO2基因，具体方法是：

在植物组织内注入含有crRNA-tracrRNA chimera基因组合段的生物基因液。crRNA-tracrRNA chimera基因组合段中的AtU发出启动信号，sgRNA对植物体内的PHO2进行匹配查找，找到后35S基因片段启动进入细胞核内，由flag进行标签标定，NLS信号找到切断位置开启，然后hSpCas启动，开始溶解切除PHO2基因片段，crRNA-tracrRNA chimera通过连接扣自动取代PHO2原有位置，让敲除PHO2的基因系统继续工作。

本发明上述技术方案中，质粒PCAMBIA1300是常规的用于转基因的载体。

本发明上述技术方案中，组合基因段crRNA-tracrRNA chimera是常规的用于CRISPR/CAS9的DNA序列。

本发明上述技术方案中，质粒PCAMBIA1300的构建过程如下：

（1）PCR扩增PHR1的全长基因组DNA序列；

（2）通过重组的方法把PHR1的DNA序列导入pCAMBIA1300转基因载体。

（3）测序验证。

本发明上述技术方案中，组合基因段crRNA-tracrRNA chimera的构建过程如下：首先用生物信息学的方法设计对应的sgRNA序列，然后合成引物，连接入CRISPR/CAS9的载体。

本发明具有以下有益效果：

改造完的基因片段的植被，进行复制培养，达到一定数量后，置入待修复的富磷水体，对水体中的磷进行过量吸收，在吸收过程中，植被大量繁殖，吸磷速率增加，实现磷达标。

附图说明

图1是本发明PCAMBIA1300的结构示意图；

图2是本发明敲除PHO2并替换连接示意图；

图3是本发明crRNA-tracrRNA chimera结构示意图；

图4是本发明植物从自然界吸磷的原理示意图；

图5是应用案例一的示意图；

图6是应用案例二的示意图；

图7是本发明应用案例一的运行结果表；

图8是本发明应用案例二的运行结果表。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的解释说明。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制。本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。

提高水生植物富磷能力的基因改造方法，具体分成两步：

第一步，增加PHR1转录因子的过量表达；

第二步，剪除PHO2基因。

PCAMBIA1300的结构如图1所示。以Border(left)、Border(right)为界，PCAMBIA1300的结构分成两个部分组成：一是基础结构部分，包括kanamycin(R)、pBRori、pBRbom、PVS1rep、PVS1sta；二是进入基因体内改造部分，包括polyA、Hygomycin(R)、caMV35s、IacZ alpha以及钥匙片段（EcoRI(1)、SacI(11)、PstI(44)、HindIII(52)）、过量片段spuer promoter。

上述增加PHR1转录因子的过量表达，是将转录因子PHR1不包括启动子区域的基因组DNA构建到pCAMBIA1300的双元转基因载体，用于过量表达PHR1。

第一步的具体操作如下：

进入基因体内改造部分通过Hygomycin(R)、caMV35s、IacZ alpha引导进入PHR1基因段内，由钥匙片段EcoRI(1)、SacI(11)、PstI(44)、HindIII(52)，分别对应打开基因片段TCTAGA、CTGCAG、GTCGAC、AAGCTT，然后由过量片段spuer promoter对PHR1整个系列进行克隆增强表达。

图2是敲除PHO2并替换连接示意图。

图3是crRNA-tracrRNA chimera结构示意图。

剪除PHO2基因，具体操作如下：

所述的敲除PHO2基因，是在植物组织内注入含有crRNA-tracrRNA chimera基因组合段的生物基因液。crRNA-tracrRNA chimera基因组合段中的AtU发出启动信号，sgRNA对植物体内的PHO2进行匹配查找，找到后35S基因片段启动进入细胞核内，由flag进行标签标定，NLS信号找到切断位置开启，然后hSpCas启动，开始溶解切除PHO2基因片段，crRNA-tracrRNA chimera通过连接扣自动取代PHO2原有位置，让敲除PHO2的基因系统继续工作。

原理说明：

如图4所示，植物从自然界（水体或土壤）吸磷开始于缺磷信号。

PHR1转录因子表征吸磷信号，当植物体内开始缺磷，植物体内的PHR1表达增强，即主动过量表达，发生磷需求。

PHO2基因段表征抑磷信号，miR基因段是控制剪除PHO2，当植物体内缺磷时，生物体内发动miR，剪除PHO2，即削弱体内抑磷信号。

PT2是植物从自然环境中开始吸磷的启动信号。当PHR1转录因子表达增强、PHO2削弱，在两者共同作用下启动PT2信号，植物开始从自然环境中吸磷。

所以，增加PHR1过量表达、同时削减PHO2缺磷信号，有助于植物过量吸磷，达到富磷效果。

应用案例一

在某河道中做侧流试验，如图5所示，水泵从河道中取水，分别输送至两个水培池，做对比试验研究。

试验时间：2015年9月；持续时间：30天；平均气温：35度。

试验水量：1m³/d；水培池有效容积：2m³；水培池尺寸：1×2×1.2Hm；有效水深：1m。

水培池A：种植普通狐尾藻，50株，株长20cm。

水培池B：种植改造狐尾藻，50株，株长20cm。

运行结果见图7。

由图7可知，经过基因改造的狐尾藻效果好。

应用案例二

在某水产养殖项目中做工程化的尾水处理的效果对比，如图6所示，鱼塘尾水先经过沉淀池预处理，平行进入湿地A与湿地B进行处理后排放。

运行水量：日均水量20m³/d，最大流量2m³/h；

沉淀池：尺寸4×2×3Hm，数量2座；

湿地（A或B）：尺寸4×25×1.5Hm，数量2座；有效水深1.0m；填料材质为10-30mm碎石；湿地A种植普通狐尾藻；湿地B种植改造狐尾藻。

试验时间：2016年9-10月；平均气温：30-35度。

运行结果见图8。

由图8可知，经过基因改造的狐尾藻效果好，并且磷吸收加强后，有助于COD的去除。