一种表达载体及其在培育转基因植物中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达载体及其在培育转基因植物中的应用。

背景技术：

土壤盐渍化是限制农业生产的一个全球性问题，全世界盐碱地的面积已达9.5亿公顷，其中我国就有3665万公顷，而且由于耕地的次生盐渍化，盐渍土地面积还在不断增加。我国盐碱土壤的形成，大部分与土壤中碳酸盐的积累有关，因此碱化程度普遍较高，严重的盐碱土壤地区植物几乎不能生存。随着世界人口的急剧增加以及耕地面积的日益减少，开发利用大面积存在的盐碱地也变得愈发重要。

目前，人们主要通过以下两种方式来开发盐碱地：一是通过合理灌溉、淡水冲洗、施用化学改良药剂来改良土壤，为植物生长创造适宜环境；二是培育耐盐植物新品种以适应盐渍环境，达到开发利用盐碱地的目的。实践证明，第一种方法成本高，效果也不理想，虽有一定进展但也有其难以避免的缺点，比如土壤改良效果不持久、工程费用昂贵、淡水冲洗同时流失土壤养分，以及淡水资源匮乏等。而培育耐盐植物品种具有更为广泛的应用前景，也是开发利用大面积的盐渍土地资源的重要途径之一。随着植物耐盐相关基因的发掘和植物基因工程技术的快速发展，利用转基因技术增强植物的耐盐性越来越受到育种科研工作者的重视。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何培育抗逆性增强的转基因植物。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种表达载体。

本发明所提供的表达载体，可包含表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲依次可包括如下元件：启动子甲、编码GhSOS1蛋白的核酸分子和终止序列甲；所述表达盒乙依次可包括如下元件：启动子乙、编码GhNHX1蛋白的核酸分子和终止序列乙。

上述表达载体中，所述GhSOS1蛋白可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；

a2)在a1)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

上述表达载体中，所述GhNHX1蛋白可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

b2)在b1)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述a3)或所述b3)中，所述“经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加”可为经过10个以下氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述表达载体中，所述“编码GhSOS1蛋白的核酸分子”可为如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的DNA分子：

c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

c3)与c1)或(c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述GhSOS1蛋白的DNA分子；

c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述GhSOS1蛋白的DNA分子。

上述表达载体中，所述“编码GhNHX1蛋白的核酸分子”可为如下d1)或d2)或d3)或d4)所示的DNA分子：

d1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

d3)与d1)或(d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述GhNHX1蛋白的DNA分子；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述GhNHX1蛋白的DNA分子。

上述表达载体中，所述启动子甲或所述启动子乙可为CaMV 35S启动子。所述终止序列甲或所述终止序列乙可为NOS终止子。所述CaMV 35S启动子的核苷酸序列具体可如序列表中序列3自5’末端第1至835位所示。所述NOS终止子的核苷酸序列具体可如序列表中序列3自5’末端第2502至2754位所示。

上述表达载体中，所述表达盒甲的核苷酸序列具体可如序列表中序列6所示。所述表达盒乙的核苷酸序列具体可如序列表中序列3所示。

上述表达载体中，所述表达载体自5’末端至3’末端依次可包括所述表达盒甲和所述表达盒乙。

上述任一所述表达载体具体可为重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1。所述重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1是向载体pBI 121的限制性内切酶BamHI和SacI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子得到的。

上述任一所述表达载体在培育转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：将上述任一所述的表达载体导入受体植物中，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗逆性增强。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述GhSOS1蛋白和所述GhNHX1蛋白的含量或活性，从而增强抗逆性。

上文中，所述抗逆性具体可为抗盐性。

上文中，所述植物可为如下e1)至e5)中的任一种：e1)双子叶植物；e2)单子叶植物；e3)十字花科植物；e4)拟南芥；e5)哥伦比亚生态型拟南芥。

实验证明，将本发明构建的重组质粒pBI121-GhNHX1、重组质粒pBI 121-GhSOS1、重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1和载体pBI 121分别导入野生型拟南芥中，经过筛选，依次得到T₃代纯合转GhNHX1基因拟南芥、T₃代纯合转GhSOS1基因拟南芥、T₃代纯合转GhNHX1基因和GhSOS1基因拟南芥、和、T₃代纯合转空载体拟南芥，然后播种于含250mM NaCl的MS固体培养基上进行耐盐性鉴定。结果表明，T₃代纯合转GhNHX1基因和GhSOS1基因拟南芥的发芽率显著高于T₃代纯合转GhNHX1基因拟南芥和T₃代纯合转GhSOS1基因拟南芥，T₃代纯合转GhNHX1基因拟南芥和T₃代纯合转GhSOS1基因拟南芥的发芽率均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和T₃代纯合转空载体拟南芥的发芽率无显著差异。因此，采用本发明提供的表达载体可培育抗逆性显著增强的转基因植物。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为重组质粒pBI 121-GhNHX1的酶切鉴定结果。

图2为重组质粒pBI 121-GhSOS1的酶切鉴定结果。

图3为重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1的酶切鉴定结果。

图4为拟南芥种子在MS固体培养基上的发芽率统计结果。

图5为拟南芥种子在含250mM NaCl的MS固体培养基上的发芽率统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

棉花品种中9807记载于如下文献中：Wang X，Lu X，Wang J，Wang D，Yin Z，Fan W，Wang S，Ye W.Mining and Analysis of SNP in Response to Sal inity Stress in Upland Cotton(Gossypium hirsutum L.).PLoS One.2016Jun 29；11(6)：e0158142.棉花品种中9807以下简称中9807。

载体pBI 121记载于如下文献中：Chen PY，Wang CK，Soong SC，To KY.Complete sequence of the binary vector pBI121and its appl ication in cloning T-DNA insertion from transgenic plants.Molecular Breeding.2003，17(4):287-293.

实施例1、表达载体的构建

一、重组质粒pBI 121-GhNHX1的构建

1、提取中9807的叶片组织的总RNA，然后将该总RNA用逆转录酶反转录出第一链cDNA，即得到中9807叶片组织的cDNA。

2、以中9807叶片组织的cDNA为模板，以F1：

5’-CACGGGGGACTCTAGAATGGTGGCTCCGCAGTTAGC-3’和R1：

5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATTGCCATTGAGGCAGAT-3’为引物进行PCR扩增，得到约1670bp的PCR扩增产物1。

3、用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切载体pBI 121，回收约12.9kb的载体骨架1。

4、采用In-fusion HD Cloning Kit将PCR扩增产物1和载体骨架1进行连接，得到重组质粒pBI 121-GhNHX1。

用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切重组质粒pBI 121-GhNHX1，实验结果见图1(M为DNA Marker，泳道1-4均为重组质粒pBI 121-GhNHX1)。结果表明，用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切重组质粒pBI 121-GhNHX1，可获得大小为1642bp的DNA片段，与预期结果完全一致。

对重组质粒pBI 121-GhNHX1进行测序。根据测序结果，对重组质粒pBI 121-GhNHX1进行结构描述如下：向载体pBI 121的限制性内切酶BamHI和SacI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。序列表中的序列1所示的DNA分子即为GhNHX1基因(Genebank号为：AF515632.2)的核苷酸序列，编码序列表中序列4所示的GhNHX1蛋白。

二、重组质粒pBI 121-GhSOS1的构建

1、提取中9807的叶片组织的总RNA，然后将该总RNA用逆转录酶反转录出第一链cDNA，即得到中9807叶片组织的cDNA。

2、以中9807叶片组织的cDNA为模板，以F2：

5’-GGACTCTAGAGGATCCATGGAGGAAGTGAAAGAGT-3’和R2：

5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAAGAAGCCTGGTGGAAT-3’为引物进行PCR扩增，得到约3500bp的PCR扩增产物2。

3、用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切载体pBI 121，回收约12.9kb的载体骨架1。

4、采用In-fusion HD Cloning Kit将PCR扩增产物2和载体骨架1进行连接，得到重组质粒pBI 121-GhSOS1。

用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切重组质粒pBI 121-GhSOS1，实验结果见图2(M为DNA Marker，泳道1-4均为重组质粒pBI 121-GhSOS1)。结果表明，用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切重组质粒pBI 121-GhSOS1，可获得大小为3742bp的DNA片段，与预期结果完全一致。

对重组质粒pBI 121-GhSOS1进行测序。根据测序结果，对重组质粒pBI 121-GhSOS1进行结构描述如下：向载体pBI 121的限制性内切酶BamHI和Sac I酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子。序列表中的序列2所示的DNA分子即为GhSOS1基因(Genebank号为：KU994886.1)的核苷酸序列，编码序列表中序列5所示的GhSOS1蛋白。

三、重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1的构建

1、以重组质粒pBI 121-GhNHX1为模板，以F3：

5’-TATGTTACTAGATCGGGAATTCCCAGATTAGCCTTTTCAA-3’和R3：5’

-AAACGACGGCCAGTGAATTCCGATCTAGTAACATAG-3’为引物进行PCR扩增，得到约2780bp的PCR扩增产物3。

2、用限制性内切酶EcoRI酶切重组质粒pBI 121-GhSOS1，回收约16.3kb的载体骨架2。

3、采用In-fusion HD Cloning Kit将PCR扩增产物3和载体骨架2进行连接，得到重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1。

用限制性内切酶HindⅢ酶切重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1，实验结果见图3(M为DNA Marker，泳道1-7均为重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1)。结果表明，用限制性内切酶HindⅢ酶切重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1，可获得大小为2362bp的DNA片段，与预期结果完全一致。

对重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1进行测序。根据测序结果，对重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1进行结构描述如下：向载体pBI 121的限制性内切酶BamHI和SacI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列3所示的DNA分子。

重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1具有两个表达盒，分别命名为表达盒甲和表达盒乙。

表达盒甲的核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中序列表中序列6的自5’末端第1至835位为CaMV 35S启动子的核苷酸序列，第854至4312位为GhSOS1基因的核苷酸序列，第4329至4581位为NOS终止子的核苷酸序列(用于终止转录)。

表达盒乙的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中序列表中序列3的自5’末端第1至835位为CaMV 35S启动子的核苷酸序列，第854至2485位为GhNHX1基因的核苷酸序列，第2502至2754位为NOS终止子的核苷酸序列(用于终止转录)。

实施例2、实施例1构建的表达载体在培育转基因植物中的应用

一、重组农杆菌的获得

1、将实施例1中步骤一制备的重组质粒pBI 121-GhNHX1导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/pBI 121-GhNHX1。

2、将实施例1中步骤二制备的重组质粒pBI 121-GhSOS1导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/pBI 121-GhSOS1。

3、将实施例1中步骤三制备的重组质粒pBI121-GhNHX1-GhSOS1导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/pBI121-GhNHX1-GhSOS1。

4、将载体pBI 121导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/pBI121。

二、转基因拟南芥的获得

哥伦比亚生态型拟南芥为Arabidopsis Biological Resource Center的产品，详见网址http://abrc.osu.edu/。在下文中，哥伦比亚生态型拟南芥简称为野生型拟南芥。

1、采用拟南芥花序浸花转化法(Clough SJ,Bent AF(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J 16:735–743.)，将步骤一中1制备的LBA4404/pBI 121-GhNHX1转至野生型拟南芥中，获得T₁代拟转GhNHX1基因拟南芥的种子。

2、将T₁代拟转GhNHX1基因拟南芥的种子种植于含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T₁代转GhNHX1基因阳性苗。T₁代转GhNHX1基因阳性苗收到的种子即为T₂代转GhNHX1基因拟南芥的种子。

3、将步骤2筛选出的不同株系的T₂代转GhNHX1基因拟南芥的种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GhNHX1基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T₃代转GhNHX1基因拟南芥的种子。

4、将步骤3筛选出的T₃代转GhNHX1基因拟南芥的种子再次播种于含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T₃代纯合转GhNHX1基因拟南芥。随机选择一个T₃代纯合转GhNHX1基因拟南芥的株系命名为N，并进行后续实验。

按照上述方法，将LBA4404/pBI 121-GhNHX1替换为LBA4404/pBI 121-GhSOS1，其它步骤均相同，得到T₃代纯合转GhSOS1基因拟南芥。随机选择一个T₃代纯合转GhSOS1基因拟南芥的株系命名为S。

按照上述方法，将LBA4404/pBI 121-GhNHX1替换为LBA4404/pBI121-GhNHX1-GhSOS1，其它步骤均相同，得到T₃代纯合转GhNHX1基因和GhSOS1基因的拟南芥。随机选择一个T₃代纯合转GhNHX1基因和GhSOS1基因拟南芥的株系命名为NS。

按照上述方法，将LBA4404/pBI 121-GhNHX1替换为LBA4404/pBI121，其它步骤均相同，得到T₃代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。

三、RT-PCR检测

1、采用TRIzol试剂提取拟南芥幼苗(野生型拟南芥幼苗、转空载体拟南芥幼苗、N的幼苗、S的幼苗或NS的幼苗)的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到拟南芥幼苗的cDNA。拟南芥幼苗的cDNA中，DNA浓度为50ng/μL。

2、通过实时荧光定量PCR检测拟南芥幼苗的cDNA中GhNHX1基因和GhSOS1基因的相对表达量(以Actin基因作为内参基因)。

检测GhNHX1基因的引物为F4：5’-CAGCCAGCATGCTCTCAGAC-3’和R4：5’-ACATAGGGCGCATGAAGGCA-3’。

检测GhSOS1基因的引物为F5：5’-TGGGAAGGATTGGTGATGGC-3’和R5：5’-GGACCAGCAAGCAGAACCAT-3’。

检测Actin基因的引物为F6：5’-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3’和R6：5’-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3’。

结果表明，与野生型拟南芥相比，N和NS中GhNHX1基因的表达量显著增加，S和NS中GhSOS1基因的表达量显著增加；野生型拟南芥和转空载体拟南芥中GhNHX1基因和GhSOS1基因不表达。

因此，N为转GhNHX1基因拟南芥；S为转GhSOS1基因拟南芥；NS为转GhNHX1基因和GhSOS1基因的拟南芥。

四、耐盐性鉴定

待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、N的T₃代种子、S的T₃代种子或NS的T₃代种子。

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、向EP管中加入待测拟南芥种子，先用超纯水清洗一次，再用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，最后用超纯水清洗三次，在无菌滤纸上晾干，得到无菌的待测拟南芥种子。

2、完成步骤1后，将50粒无菌的待测拟南芥种子播种于MS固体培养基或含250mMNaCl的MS固体培养基，然后正常培养7d，统计发芽率(发芽率＝已发芽的待测拟南芥种子的粒数/50粒×100％)。正常培养的条件为：25℃。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。光照培养时的光照强度为5000Lx。

部分拟南芥种子在MS固体培养基上的发芽率统计结果见图4(WT为野生型拟南芥)。部分拟南芥种子在含250mM NaCl的MS固体培养基上的发芽率统计结果见图5(WT为野生型拟南芥)。结果表明，在MS固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，发芽率也无显著差异；在含250mM NaCl的MS固体培养基上，NS的发芽率均显著高于S和N，S和N的发芽率均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥基本没有萌发、发芽率无显著差异。因此，与野生型拟南芥、N和S相比，NS的抗盐性显著增强。

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>一种表达载体及其在培育转基因植物中的应用

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.)

<400> 1

atggtggctc cgcagttagc tgctgtcttt actaagttgc agacactatc tacttcagac 60

catgcgtctg tggtctccat gaacatattt gtagcgcttc tttgtgcttg cattgtgatt 120

ggtcatcttt tggaggagaa tagatggatg aacgaatcaa ttactgccct tatcattggt 180

gtttttactg gggtcattat tttgttgaca agtgggggta aaagctctca tcttttagtc 240

ttcagtgaag atctgttctt tatctatctt ctgcccccta ttatattcaa tgctgggttt 300

caggtgaaaa agaagcaatt tttccgtaac tttatcacca tcatgctgtt tggggctgtt 360

ggtacactaa tatcttgtac aattatctct ttaggtgtaa ttaacttctt caaggaaatg 420

gacattggct ccttagacat tggagatttt ctagcaattg gtgcaatatt tgctgcgaca 480

gattctgttt gcacactgca ggtgcttaat caggatgaga ctccattact ctacagtttg 540

gttttcggag agggtgttgt aaatgatgca acatctgtgg tgcttttcaa tgcaatccag 600

agttttgacc tcgttaatac cagtcctaga attcttctgg agtttattgg cagctttttg 660

tatttatttt tagcaagcac tatgctggga gtgattgttg ggttggttag tgcttacatc 720

atcaaaaagt tgtactttgg aaggcactca acagatcgtg aatttgctct tatgatgctt 780

atggcatacc tttcgtatat catggctgaa ctgttctatt tgagtggcat tcttacagta 840

ttcttttgtg ggattgtgat gtcacattat acctggcaca atgtaactga gagttcaaga 900

gtaactacaa agcatgcctt tgctaccttg tcatttgttg ctgagacttt tctctttctt 960

tatgtcggga tggatgcttt ggacatggag aagtggagat ttgtcagtga tagccctgga 1020

acgtcagttg ctgttagtgc tgtgctgatg ggtcttgtta tggttggaag agcggctttt 1080

gtgtttcccc tgtcattttt atccaacttg gcaaagaaat caactagtga gaaaatcagc 1140

ttcagggaac aaattataat atggtgggct gggctcatga gaggcgctgt atctatggca 1200

cttgcatata atcagtttac aagggggggc catactcagt tgcgaggaaa tgcaattatg 1260

attacaagca ccataaccat tgttctattc agcactgtgg tttttggttt aatgactaaa 1320

cctctaataa ggttcttgct gcctcatccc aaaccaacag ccagcatgct ctcagaccaa 1380

tccactccaa aatcaatgga ggcaccattt ctcggaagcg gccaggactc ttttgatgat 1440

agtttaattg gagttcatcg accaaacagc attcgtgcac ttcttacaac tccagcacac 1500

actgttcatt actattggcg aaagtttgat aatgccttca tgcgccctat gtttggtggc 1560

cggggttttg tgcccttcgt tcctggctcc ccaacagaaa ggagtgaacc taatctgcct 1620

caatggcaat ga 1632

<210> 2

<211> 3459

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 2

atggaggaag tgaaagagta tctatacgtg ttaccttcga gaatgctaga ggaaattagc 60

tccggtgaat cggagccagt ggatgcggtc atctttgttg ggatttcttt ggtattagga 120

atcgcttcca ggcatcttct tcgcggcacc agagttcctt acactgtcgc tttgctcatc 180

attggccttg gtctcggctc tctcgaatat ggtacaagtc ataaattggg aaggattggt 240

gatggcattc gactttggaa caacattgat cctgaccttc tattagctgt ttttctaccc 300

gcattacttt ttgagagtgc attttctatg gaagtgcacc agataaagag gtgtatggca 360

caaatggttc tgcttgctgg tcctggagtt attatttcaa ccttctgtct tggatttgct 420

ctgaagatca cttttccata tgagtggaac tggaaaacat cgctgttgct tgggggactt 480

ctgagtgcta ctgatcctgt tgctgttgtg gctttgttga aggagcttgg tgctagcaaa 540

aaactgagca ccataattga aggagaatcc ttaatgaatg atgggacagc aattgtggtc 600

tatcagttat tctttaaaat ggtaaatgga gagagcttta gttgggatgc cattgttgga 660

tttctggcca aagtcgctct tggagctgtt ggccttggaa ttgcttttgg gatagcatct 720

gttttgtggc ttggatttat tttcaatgat acagtgattg agattacatt gacagttgct 780

gtgagctacg ttgtttactt cactggtcaa gaaggtattg aagtttctgg tgttttggca 840

gtgatgactt taggaatgtt ttatgctgct tttgcgaaga cagcctttaa gggtgatggt 900

cagcagagtt tgcatcactt ttgggaaatg gttgcttata ttgcaaatac attaattttc 960

atcttgagtg gagttgttat agctgaaggc attcttggca atgataagat atttcagaac 1020

aatggaaatt catggggtta tctgattctt ctgtacatct ttgtccaagt atcacgttgc 1080

attgttgttg gagtattgta tccattctta cgatattttg gatatggttt ggatttaaag 1140

gaggccgcca tcctaatatg gtcggggctt cggggagctg ttgcattatc actttctctc 1200

tctgttaagc gttccagtgg tggctcattt aatctcagct ctgaaactgg aagccggttc 1260

attttcttca ccggtggaat tgtattcctg acacttattg tgaatggatc aactacacag 1320

ttcattttac attttctggg tctggataaa ctatcagcag ccaagaagcg tatactagac 1380

tacacaaagt atgaaatgtt gaacaaagca ttcgaggctt ttgaagacct cgtagatgat 1440

gaggaacttg gacctgccga ttggcctaca gtaaagagat acattacaag cttacacgat 1500

ttggaggggg accgtgtgca tcctcatact gaatctgaag ctgataatga cctggaccct 1560

tcaaacttga aagatataag aatacgactt ctaaatggta tccaggcagc atactgggaa 1620

atgcttgatg aagggagaat tgcacaaagc acagctaatc tgttgatgca atctgtagat 1680

gaagctattg atacggcatc tcatgaacct ttatgtgatt ggaagggctt aaaatctaat 1740

gtgcagttcc cgaattatta caagtttctt cagacaagca tgttcccaca aaaattgatt 1800

acatttttca ctgtggaaag gctggaaaat gggtgttgta tttgtgctgc atttcttcga 1860

gctcatagaa tagcacgacg gcaacttcat gaatttatag gtgacagtgt agttgcttct 1920

actgtaattg ctgaaagtga agctgaagga gaagaggcga ggaagtttct ggaagatgtc 1980

cgtataactt ttcatcaggt tttacgtgtt gtgaaaacaa gacaagtgac ctactcagta 2040

ctgaaccatc tgattgatta tttacataac ctcgagaagg cggggttact ggaagaaaaa 2100

gaaatgcttc atcttcatga tgctgtccag actgacttga agaggctttt aaggaatcct 2160

ccattagtaa agattccaaa aataaatgat attataagtg ctcatccttt tctaggcgcc 2220

tttccttcta gtgtccgcga atcattagaa tgttctacaa aagaaaaaat gaaaacacgt 2280

ggtatgacac tttacaaaga gggctctaaa ccaaatggta tttggcttat ttcaaatggt 2340

gttgtcaagt ggaagagtaa gagcatacga aacaagcact caatgcatcc aacttttact 2400

catgggagta cgttgggctt gtatgaagta ttggttggaa aaccatacat ctgtgacatg 2460

atctcagatt ccgtggttct ctgttttttt attgaaagtg acagaatact ttcaatgcta 2520

aggtcggatc ctgcactaga agattttctg tggcaggaaa gtgctattgt acttgccaaa 2580

ctcttgtttc ctcaaatatt tgagaaaata gcgctgcatg atttgagagc tcttgtggca 2640

gaaaggtcat caatgaaaac atacattaca ggggaaacaa tagaagtgtc tcaccaatct 2700

gtcggcttca tgttggaagg gttcattaaa ccctcacatg ctgaaggcga actcattaag 2760

tcaccagcag ttcttttgcc ttcacaaggg aatcaaagtt tcttgcatgc agataagtca 2820

ggttctacaa cagccagttt ttctcatcag cgatccgggt atctacttga gacaagagga 2880

agcataatat accaagttga gaccagagca agagtaatta tatttgatat ttcaacactt 2940

gaaggcaata gggttttgcg gaataattca tcttcattta acctttcaca tagatcttta 3000

actagagaac atggaggtct tatgagttgg cccgaacatt tctttagggg aagacaacat 3060

acacaaaatc atgacgcaac tgatcaacaa gtaaacagat tgtcagcgag agccatgcag 3120

ttaagcatat ttggcagtaa ggtaaatttg ccacagcgta gctggagttt atcaaggatg 3180

aatcagtctc agccaataaa caacccgtca tataatagat ttctttcatt ccctggccat 3240

ctactggtct ctgccggatc agaaggagct tctactatga ggaagaatca caaagaagct 3300

ggaaagataa caaggcgagt tccctcagca caagcgaaca agatggacac gaaagagggt 3360

cacgtaaatg atgattcaag tgatgaatct ggtggtgagg atgagatcct ggtaagaatc 3420

gattcgccta gtgtactatc attccaccag gcttcttaa 3459

<210> 3

<211> 2754

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60

cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120

ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180

aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240

acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300

aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360

aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420

tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480

gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540

cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600

atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780

cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga 840

ctctagagga tccatggtgg ctccgcagtt agctgctgtc tttactaagt tgcagacact 900

atctacttca gaccatgcgt ctgtggtctc catgaacata tttgtagcgc ttctttgtgc 960

ttgcattgtg attggtcatc ttttggagga gaatagatgg atgaacgaat caattactgc 1020

ccttatcatt ggtgttttta ctggggtcat tattttgttg acaagtgggg gtaaaagctc 1080

tcatctttta gtcttcagtg aagatctgtt ctttatctat cttctgcccc ctattatatt 1140

caatgctggg tttcaggtga aaaagaagca atttttccgt aactttatca ccatcatgct 1200

gtttggggct gttggtacac taatatcttg tacaattatc tctttaggtg taattaactt 1260

cttcaaggaa atggacattg gctccttaga cattggagat tttctagcaa ttggtgcaat 1320

atttgctgcg acagattctg tttgcacact gcaggtgctt aatcaggatg agactccatt 1380

actctacagt ttggttttcg gagagggtgt tgtaaatgat gcaacatctg tggtgctttt 1440

caatgcaatc cagagttttg acctcgttaa taccagtcct agaattcttc tggagtttat 1500

tggcagcttt ttgtatttat ttttagcaag cactatgctg ggagtgattg ttgggttggt 1560

tagtgcttac atcatcaaaa agttgtactt tggaaggcac tcaacagatc gtgaatttgc 1620

tcttatgatg cttatggcat acctttcgta tatcatggct gaactgttct atttgagtgg 1680

cattcttaca gtattctttt gtgggattgt gatgtcacat tatacctggc acaatgtaac 1740

tgagagttca agagtaacta caaagcatgc ctttgctacc ttgtcatttg ttgctgagac 1800

ttttctcttt ctttatgtcg ggatggatgc tttggacatg gagaagtgga gatttgtcag 1860

tgatagccct ggaacgtcag ttgctgttag tgctgtgctg atgggtcttg ttatggttgg 1920

aagagcggct tttgtgtttc ccctgtcatt tttatccaac ttggcaaaga aatcaactag 1980

tgagaaaatc agcttcaggg aacaaattat aatatggtgg gctgggctca tgagaggcgc 2040

tgtatctatg gcacttgcat ataatcagtt tacaaggggg ggccatactc agttgcgagg 2100

aaatgcaatt atgattacaa gcaccataac cattgttcta ttcagcactg tggtttttgg 2160

tttaatgact aaacctctaa taaggttctt gctgcctcat cccaaaccaa cagccagcat 2220

gctctcagac caatccactc caaaatcaat ggaggcacca tttctcggaa gcggccagga 2280

ctcttttgat gatagtttaa ttggagttca tcgaccaaac agcattcgtg cacttcttac 2340

aactccagca cacactgttc attactattg gcgaaagttt gataatgcct tcatgcgccc 2400

tatgtttggt ggccggggtt ttgtgccctt cgttcctggc tccccaacag aaaggagtga 2460

acctaatctg cctcaatggc aatgagagct cgaatttccc cgatcgttca aacatttggc 2520

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 2580

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 2640

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 2700

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatc 2754

<210> 4

<211> 543

<212> PRT

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 4

Met Val Ala Pro Gln Leu Ala Ala Val Phe Thr Lys Leu Gln Thr Leu

1 5 10 15

Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Ile Phe Val Ala

20 25 30

Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Ile Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg

35 40 45

Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly Val Phe Thr Gly

50 55 60

Val Ile Ile Leu Leu Thr Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Leu Leu Val

65 70 75 80

Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe

85 90 95

Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Ile

100 105 110

Thr Ile Met Leu Phe Gly Ala Val Gly Thr Leu Ile Ser Cys Thr Ile

115 120 125

Ile Ser Leu Gly Val Ile Asn Phe Phe Lys Glu Met Asp Ile Gly Ser

130 135 140

Leu Asp Ile Gly Asp Phe Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr

145 150 155 160

Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser

180 185 190

Val Val Leu Phe Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Val Asn Thr Ser

195 200 205

Pro Arg Ile Leu Leu Glu Phe Ile Gly Ser Phe Leu Tyr Leu Phe Leu

210 215 220

Ala Ser Thr Met Leu Gly Val Ile Val Gly Leu Val Ser Ala Tyr Ile

225 230 235 240

Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Phe Ala

245 250 255

Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Ile Met Ala Glu Leu Phe

260 265 270

Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser

275 280 285

His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys

290 295 300

His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu

305 310 315 320

Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Met Glu Lys Trp Arg Phe Val Ser

325 330 335

Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ala Val Leu Met Gly Leu

340 345 350

Val Met Val Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser

355 360 365

Asn Leu Ala Lys Lys Ser Thr Ser Glu Lys Ile Ser Phe Arg Glu Gln

370 375 380

Ile Ile Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala

385 390 395 400

Leu Ala Tyr Asn Gln Phe Thr Arg Gly Gly His Thr Gln Leu Arg Gly

405 410 415

Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Ile Val Leu Phe Ser Thr

420 425 430

Val Val Phe Gly Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Phe Leu Leu Pro

435 440 445

His Pro Lys Pro Thr Ala Ser Met Leu Ser Asp Gln Ser Thr Pro Lys

450 455 460

Ser Met Glu Ala Pro Phe Leu Gly Ser Gly Gln Asp Ser Phe Asp Asp

465 470 475 480

Ser Leu Ile Gly Val His Arg Pro Asn Ser Ile Arg Ala Leu Leu Thr

485 490 495

Thr Pro Ala His Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asn Ala

500 505 510

Phe Met Arg Pro Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Val Pro

515 520 525

Gly Ser Pro Thr Glu Arg Ser Glu Pro Asn Leu Pro Gln Trp Gln

530 535 540

<210> 5

<211> 1152

<212> PRT

<213> 棉花（Gossypium hirsutum L.）

<400> 5

Met Glu Glu Val Lys Glu Tyr Leu Tyr Val Leu Pro Ser Arg Met Leu

1 5 10 15

Glu Glu Ile Ser Ser Gly Glu Ser Glu Pro Val Asp Ala Val Ile Phe

20 25 30

Val Gly Ile Ser Leu Val Leu Gly Ile Ala Ser Arg His Leu Leu Arg

35 40 45

Gly Thr Arg Val Pro Tyr Thr Val Ala Leu Leu Ile Ile Gly Leu Gly

50 55 60

Leu Gly Ser Leu Glu Tyr Gly Thr Ser His Lys Leu Gly Arg Ile Gly

65 70 75 80

Asp Gly Ile Arg Leu Trp Asn Asn Ile Asp Pro Asp Leu Leu Leu Ala

85 90 95

Val Phe Leu Pro Ala Leu Leu Phe Glu Ser Ala Phe Ser Met Glu Val

100 105 110

His Gln Ile Lys Arg Cys Met Ala Gln Met Val Leu Leu Ala Gly Pro

115 120 125

Gly Val Ile Ile Ser Thr Phe Cys Leu Gly Phe Ala Leu Lys Ile Thr

130 135 140

Phe Pro Tyr Glu Trp Asn Trp Lys Thr Ser Leu Leu Leu Gly Gly Leu

145 150 155 160

Leu Ser Ala Thr Asp Pro Val Ala Val Val Ala Leu Leu Lys Glu Leu

165 170 175

Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Thr Ile Ile Glu Gly Glu Ser Leu Met

180 185 190

Asn Asp Gly Thr Ala Ile Val Val Tyr Gln Leu Phe Phe Lys Met Val

195 200 205

Asn Gly Glu Ser Phe Ser Trp Asp Ala Ile Val Gly Phe Leu Ala Lys

210 215 220

Val Ala Leu Gly Ala Val Gly Leu Gly Ile Ala Phe Gly Ile Ala Ser

225 230 235 240

Val Leu Trp Leu Gly Phe Ile Phe Asn Asp Thr Val Ile Glu Ile Thr

245 250 255

Leu Thr Val Ala Val Ser Tyr Val Val Tyr Phe Thr Gly Gln Glu Gly

260 265 270

Ile Glu Val Ser Gly Val Leu Ala Val Met Thr Leu Gly Met Phe Tyr

275 280 285

Ala Ala Phe Ala Lys Thr Ala Phe Lys Gly Asp Gly Gln Gln Ser Leu

290 295 300

His His Phe Trp Glu Met Val Ala Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Ile Phe

305 310 315 320

Ile Leu Ser Gly Val Val Ile Ala Glu Gly Ile Leu Gly Asn Asp Lys

325 330 335

Ile Phe Gln Asn Asn Gly Asn Ser Trp Gly Tyr Leu Ile Leu Leu Tyr

340 345 350

Ile Phe Val Gln Val Ser Arg Cys Ile Val Val Gly Val Leu Tyr Pro

355 360 365

Phe Leu Arg Tyr Phe Gly Tyr Gly Leu Asp Leu Lys Glu Ala Ala Ile

370 375 380

Leu Ile Trp Ser Gly Leu Arg Gly Ala Val Ala Leu Ser Leu Ser Leu

385 390 395 400

Ser Val Lys Arg Ser Ser Gly Gly Ser Phe Asn Leu Ser Ser Glu Thr

405 410 415

Gly Ser Arg Phe Ile Phe Phe Thr Gly Gly Ile Val Phe Leu Thr Leu

420 425 430

Ile Val Asn Gly Ser Thr Thr Gln Phe Ile Leu His Phe Leu Gly Leu

435 440 445

Asp Lys Leu Ser Ala Ala Lys Lys Arg Ile Leu Asp Tyr Thr Lys Tyr

450 455 460

Glu Met Leu Asn Lys Ala Phe Glu Ala Phe Glu Asp Leu Val Asp Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Gly Pro Ala Asp Trp Pro Thr Val Lys Arg Tyr Ile Thr

485 490 495

Ser Leu His Asp Leu Glu Gly Asp Arg Val His Pro His Thr Glu Ser

500 505 510

Glu Ala Asp Asn Asp Leu Asp Pro Ser Asn Leu Lys Asp Ile Arg Ile

515 520 525

Arg Leu Leu Asn Gly Ile Gln Ala Ala Tyr Trp Glu Met Leu Asp Glu

530 535 540

Gly Arg Ile Ala Gln Ser Thr Ala Asn Leu Leu Met Gln Ser Val Asp

545 550 555 560

Glu Ala Ile Asp Thr Ala Ser His Glu Pro Leu Cys Asp Trp Lys Gly

565 570 575

Leu Lys Ser Asn Val Gln Phe Pro Asn Tyr Tyr Lys Phe Leu Gln Thr

580 585 590

Ser Met Phe Pro Gln Lys Leu Ile Thr Phe Phe Thr Val Glu Arg Leu

595 600 605

Glu Asn Gly Cys Cys Ile Cys Ala Ala Phe Leu Arg Ala His Arg Ile

610 615 620

Ala Arg Arg Gln Leu His Glu Phe Ile Gly Asp Ser Val Val Ala Ser

625 630 635 640

Thr Val Ile Ala Glu Ser Glu Ala Glu Gly Glu Glu Ala Arg Lys Phe

645 650 655

Leu Glu Asp Val Arg Ile Thr Phe His Gln Val Leu Arg Val Val Lys

660 665 670

Thr Arg Gln Val Thr Tyr Ser Val Leu Asn His Leu Ile Asp Tyr Leu

675 680 685

His Asn Leu Glu Lys Ala Gly Leu Leu Glu Glu Lys Glu Met Leu His

690 695 700

Leu His Asp Ala Val Gln Thr Asp Leu Lys Arg Leu Leu Arg Asn Pro

705 710 715 720

Pro Leu Val Lys Ile Pro Lys Ile Asn Asp Ile Ile Ser Ala His Pro

725 730 735

Phe Leu Gly Ala Phe Pro Ser Ser Val Arg Glu Ser Leu Glu Cys Ser

740 745 750

Thr Lys Glu Lys Met Lys Thr Arg Gly Met Thr Leu Tyr Lys Glu Gly

755 760 765

Ser Lys Pro Asn Gly Ile Trp Leu Ile Ser Asn Gly Val Val Lys Trp

770 775 780

Lys Ser Lys Ser Ile Arg Asn Lys His Ser Met His Pro Thr Phe Thr

785 790 795 800

His Gly Ser Thr Leu Gly Leu Tyr Glu Val Leu Val Gly Lys Pro Tyr

805 810 815

Ile Cys Asp Met Ile Ser Asp Ser Val Val Leu Cys Phe Phe Ile Glu

820 825 830

Ser Asp Arg Ile Leu Ser Met Leu Arg Ser Asp Pro Ala Leu Glu Asp

835 840 845

Phe Leu Trp Gln Glu Ser Ala Ile Val Leu Ala Lys Leu Leu Phe Pro

850 855 860

Gln Ile Phe Glu Lys Ile Ala Leu His Asp Leu Arg Ala Leu Val Ala

865 870 875 880

Glu Arg Ser Ser Met Lys Thr Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Ile Glu Val

885 890 895

Ser His Gln Ser Val Gly Phe Met Leu Glu Gly Phe Ile Lys Pro Ser

900 905 910

His Ala Glu Gly Glu Leu Ile Lys Ser Pro Ala Val Leu Leu Pro Ser

915 920 925

Gln Gly Asn Gln Ser Phe Leu His Ala Asp Lys Ser Gly Ser Thr Thr

930 935 940

Ala Ser Phe Ser His Gln Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Glu Thr Arg Gly

945 950 955 960

Ser Ile Ile Tyr Gln Val Glu Thr Arg Ala Arg Val Ile Ile Phe Asp

965 970 975

Ile Ser Thr Leu Glu Gly Asn Arg Val Leu Arg Asn Asn Ser Ser Ser

980 985 990

Phe Asn Leu Ser His Arg Ser Leu Thr Arg Glu His Gly Gly Leu Met

995 1000 1005

Ser Trp Pro Glu His Phe Phe Arg Gly Arg Gln His Thr Gln Asn

1010 1015 1020

His Asp Ala Thr Asp Gln Gln Val Asn Arg Leu Ser Ala Arg Ala

1025 1030 1035

Met Gln Leu Ser Ile Phe Gly Ser Lys Val Asn Leu Pro Gln Arg

1040 1045 1050

Ser Trp Ser Leu Ser Arg Met Asn Gln Ser Gln Pro Ile Asn Asn

1055 1060 1065

Pro Ser Tyr Asn Arg Phe Leu Ser Phe Pro Gly His Leu Leu Val

1070 1075 1080

Ser Ala Gly Ser Glu Gly Ala Ser Thr Met Arg Lys Asn His Lys

1085 1090 1095

Glu Ala Gly Lys Ile Thr Arg Arg Val Pro Ser Ala Gln Ala Asn

1100 1105 1110

Lys Met Asp Thr Lys Glu Gly His Val Asn Asp Asp Ser Ser Asp

1115 1120 1125

Glu Ser Gly Gly Glu Asp Glu Ile Leu Val Arg Ile Asp Ser Pro

1130 1135 1140

Ser Val Leu Ser Phe His Gln Ala Ser

1145 1150

<210> 6

<211> 4581

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60

cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120

ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180

aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240

acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300

aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360

aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420

tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480

gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540

cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600

atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780

cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga 840

ctctagagga tccatggagg aagtgaaaga gtatctatac gtgttacctt cgagaatgct 900

agaggaaatt agctccggtg aatcggagcc agtggatgcg gtcatctttg ttgggatttc 960

tttggtatta ggaatcgctt ccaggcatct tcttcgcggc accagagttc cttacactgt 1020

cgctttgctc atcattggcc ttggtctcgg ctctctcgaa tatggtacaa gtcataaatt 1080

gggaaggatt ggtgatggca ttcgactttg gaacaacatt gatcctgacc ttctattagc 1140

tgtttttcta cccgcattac tttttgagag tgcattttct atggaagtgc accagataaa 1200

gaggtgtatg gcacaaatgg ttctgcttgc tggtcctgga gttattattt caaccttctg 1260

tcttggattt gctctgaaga tcacttttcc atatgagtgg aactggaaaa catcgctgtt 1320

gcttggggga cttctgagtg ctactgatcc tgttgctgtt gtggctttgt tgaaggagct 1380

tggtgctagc aaaaaactga gcaccataat tgaaggagaa tccttaatga atgatgggac 1440

agcaattgtg gtctatcagt tattctttaa aatggtaaat ggagagagct ttagttggga 1500

tgccattgtt ggatttctgg ccaaagtcgc tcttggagct gttggccttg gaattgcttt 1560

tgggatagca tctgttttgt ggcttggatt tattttcaat gatacagtga ttgagattac 1620

attgacagtt gctgtgagct acgttgttta cttcactggt caagaaggta ttgaagtttc 1680

tggtgttttg gcagtgatga ctttaggaat gttttatgct gcttttgcga agacagcctt 1740

taagggtgat ggtcagcaga gtttgcatca cttttgggaa atggttgctt atattgcaaa 1800

tacattaatt ttcatcttga gtggagttgt tatagctgaa ggcattcttg gcaatgataa 1860

gatatttcag aacaatggaa attcatgggg ttatctgatt cttctgtaca tctttgtcca 1920

agtatcacgt tgcattgttg ttggagtatt gtatccattc ttacgatatt ttggatatgg 1980

tttggattta aaggaggccg ccatcctaat atggtcgggg cttcggggag ctgttgcatt 2040

atcactttct ctctctgtta agcgttccag tggtggctca tttaatctca gctctgaaac 2100

tggaagccgg ttcattttct tcaccggtgg aattgtattc ctgacactta ttgtgaatgg 2160

atcaactaca cagttcattt tacattttct gggtctggat aaactatcag cagccaagaa 2220

gcgtatacta gactacacaa agtatgaaat gttgaacaaa gcattcgagg cttttgaaga 2280

cctcgtagat gatgaggaac ttggacctgc cgattggcct acagtaaaga gatacattac 2340

aagcttacac gatttggagg gggaccgtgt gcatcctcat actgaatctg aagctgataa 2400

tgacctggac ccttcaaact tgaaagatat aagaatacga cttctaaatg gtatccaggc 2460

agcatactgg gaaatgcttg atgaagggag aattgcacaa agcacagcta atctgttgat 2520

gcaatctgta gatgaagcta ttgatacggc atctcatgaa cctttatgtg attggaaggg 2580

cttaaaatct aatgtgcagt tcccgaatta ttacaagttt cttcagacaa gcatgttccc 2640

acaaaaattg attacatttt tcactgtgga aaggctggaa aatgggtgtt gtatttgtgc 2700

tgcatttctt cgagctcata gaatagcacg acggcaactt catgaattta taggtgacag 2760

tgtagttgct tctactgtaa ttgctgaaag tgaagctgaa ggagaagagg cgaggaagtt 2820

tctggaagat gtccgtataa cttttcatca ggttttacgt gttgtgaaaa caagacaagt 2880

gacctactca gtactgaacc atctgattga ttatttacat aacctcgaga aggcggggtt 2940

actggaagaa aaagaaatgc ttcatcttca tgatgctgtc cagactgact tgaagaggct 3000

tttaaggaat cctccattag taaagattcc aaaaataaat gatattataa gtgctcatcc 3060

ttttctaggc gcctttcctt ctagtgtccg cgaatcatta gaatgttcta caaaagaaaa 3120

aatgaaaaca cgtggtatga cactttacaa agagggctct aaaccaaatg gtatttggct 3180

tatttcaaat ggtgttgtca agtggaagag taagagcata cgaaacaagc actcaatgca 3240

tccaactttt actcatggga gtacgttggg cttgtatgaa gtattggttg gaaaaccata 3300

catctgtgac atgatctcag attccgtggt tctctgtttt tttattgaaa gtgacagaat 3360

actttcaatg ctaaggtcgg atcctgcact agaagatttt ctgtggcagg aaagtgctat 3420

tgtacttgcc aaactcttgt ttcctcaaat atttgagaaa atagcgctgc atgatttgag 3480

agctcttgtg gcagaaaggt catcaatgaa aacatacatt acaggggaaa caatagaagt 3540

gtctcaccaa tctgtcggct tcatgttgga agggttcatt aaaccctcac atgctgaagg 3600

cgaactcatt aagtcaccag cagttctttt gccttcacaa gggaatcaaa gtttcttgca 3660

tgcagataag tcaggttcta caacagccag tttttctcat cagcgatccg ggtatctact 3720

tgagacaaga ggaagcataa tataccaagt tgagaccaga gcaagagtaa ttatatttga 3780

tatttcaaca cttgaaggca atagggtttt gcggaataat tcatcttcat ttaacctttc 3840

acatagatct ttaactagag aacatggagg tcttatgagt tggcccgaac atttctttag 3900

gggaagacaa catacacaaa atcatgacgc aactgatcaa caagtaaaca gattgtcagc 3960

gagagccatg cagttaagca tatttggcag taaggtaaat ttgccacagc gtagctggag 4020

tttatcaagg atgaatcagt ctcagccaat aaacaacccg tcatataata gatttctttc 4080

attccctggc catctactgg tctctgccgg atcagaagga gcttctacta tgaggaagaa 4140

tcacaaagaa gctggaaaga taacaaggcg agttccctca gcacaagcga acaagatgga 4200

cacgaaagag ggtcacgtaa atgatgattc aagtgatgaa tctggtggtg aggatgagat 4260

cctggtaaga atcgattcgc ctagtgtact atcattccac caggcttctt aagagctcga 4320

atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg 4380

gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 4440

tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 4500

tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 4560

tgtcatctat gttactagat c 4581