一种水黄皮耐逆相关基因MpSRG及其编码的蛋白与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种水黄皮耐逆相关基因MpSRG，其碱基序列如SEQ?ID?NO：1所示。构建MpSRG重组植物表达载体，用农杆菌转化拟南芥，获得转MpSRG基因拟南芥，结果表明MpSRG基因在拟南芥中超表达，提高了转基因拟南芥的耐盐性，证明MpSRG基因具有提高植物耐逆性的作用。
【专利说明】一种水黄皮耐逆相关基因MpSRG及其编码的蛋白与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种水黄皮耐逆相关基因MpSRG及其编码的蛋白质与应用。
【背景技术】
[0002]盐碱、干旱等非生物胁迫影响着农作物的生长发育，严重时甚至导致作物死亡。为了提高农作物产量，培育耐逆性作物品种是主要的应对方法之一。目前，通过基因工程的方法育种已经成为培育耐逆性作物的重要方法之一。高等植物可以通过多种途径来应对环境中的这些不利因素。随着测序技术的发展，尤其是转录组测序技术的广泛应用，人们在植物体内发现了很多功能未知的基因可能参与了植物耐逆调控。这些新的基因功能未知，有些也没有发现保守结构域，对其所发挥的机理也知之甚少。人们从苜蓿、鹰嘴豆、沙冬青和大豆等不同豆科植物中克隆到了许多功能未知的基因，然而还未从水黄皮中克隆到与非生物逆境相关的基因。
[0003]水黄皮为典型的半红树植物，既能生长于海岸或沿河的滩涂地区，又可在远离海边的陆地上生长，对土壤盐度表现出广泛的适应性，因而是研究植物耐逆性的良好材料。同时，作为豆科植物，水黄皮的基因资源将可通过转基因技术应用于大豆或其它农作物的品种改良。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种水黄皮耐逆相关基因MpSRG,其喊基序列如SEQ IDNO:1所示。在本发明中，所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG的具体碱基序列长度为402bp，如SEQ ID NO:1 所示:
[0005]
atgcttcaca caatcaaaac ggttttacac tatccaccag tttcattccc acggtctctc 60 tcttcaaacc ttggtagaga aacttccgca cttagattct gcaccgaacc tgatcgtact 120 aacaacacac agagtgctca taagHtggac gacaagactc agaagccaag tgaggaaaat 180 actcatactc atggggacgc gatgtctcat tcgtt.tgggg tagggtatgc cacgaggtca 240 gatgaagaag gatttggggg aertttatggt ggaaaccaat ccattcccaa gacagagacg 300 gataaatacg tacatgaaaa tcactcagct tatgacasga cacagggaag cgaggggaag 360 gagaaggaaa aagctgggca ccggaccaac gctaatgctt aa420
[0006]在本发明中，将SEQ ID NO:1所示的基因序列命名为MpSRG。
[0007]本发明的第二个目的在于提供一种水黄皮耐逆相关基因MpSRG编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。在本发明中，水黄皮耐逆相关基因MpSRG编码的蛋白质的具体长度为133aa， 如SEQ ID NO:2所示:
[0008]Met Leu His Thr He Lys Thr Val Leu His Tyr Pro Pro Val Ser Phe Pro Arg Ser
151015
Leu Ser Ser Asn Leu Gly Arg Glu Thr Ser Ala Leu Arg Phe Cys Thr Glu Pro Asp
20253035
Arg Thr Asi \ n Thr Gln Ser Ala His Lys Met Asp Asp Ly、Thi Gln Lys Pro Ser
40455U55
Glu Glu Asn Thr His Thr His Gly Asp Ala Met Ser His Ser Phe Gly Val Gly Tyr
60657075
Ala Thr Arg Ser Asp Glu Glu Gly Phe Gly Gly He Tyr Gly Gly A i bin Ser He
80859095
Pro Lys Thr Glu Thr Asp Lys Tyr Val His Glu Asn His Ser Ala Tyr Asp Lys Thr
100105HO
Gln Gly Ser Glti Gly Lys Glu Lys Glu Lys Ala Gly His Arg Thr Asn Ala Asn Ala
115120125130
[0009]本发明的第三个目的在于提供一种含有所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG的重组载体。
[0010]所述重组载体为重组植物表达载体。所述重组载体可以通过将上述水黄皮耐逆相关基因MpSRG插入到克隆载体或表达载体而得到。
[0011]适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如pMD18-T、pMD19-T、pMD20-T、pMD19-T Simple Vecter、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119 等。
[0012]适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如:pBI121、pl3W4、pGEM等。
[0013]重组植物表达载体包括但不限于双元农杆菌表达载体、可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0014]使用MpSRG构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0015]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。
[0016]本发明的第四个目的在于提供含有本发明所述重组载体的重组细胞。所述重组细胞可以通过将含有水黄皮耐逆相关基因MpSRG的重组载体转化至宿主细胞而得到。
[0017]适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如:根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101 等。
[0018]在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为根癌农杆菌细胞LBA4404_MpSRG。
[0019]本发明的第五个目的在于提供所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG及其编码的蛋白质在提高植物耐逆性中的应用，尤其在提高作物耐逆性中的应用。
[0020]本发明的第六个目的在于提供一种提高植物耐逆性的方法，将水黄皮耐逆相关基因MpSRG导入植物组织或细胞，得到耐逆性提高的植物，所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG是下述核苷酸序列之一:
[0021]1) SEQ ID NO:1 所示 DNA 序列；
[0022]2)编码SEQ ID NO:2所示氨基酸残基序列的DNA序列。
[0023]所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG通过含有所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG的重组植物表达载体导入植物组织或细胞。
[0024]所述重组植物表达载体为PBI121_MpSRG。
[0025]本发明又一方面，还涉及一种制备本发明所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG的方法，包括如下步骤:利用分子生物学方法从水黄皮中克隆耐逆相关基因，命名为MpSRG。
[0026]所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG还可以通过人工合成的方法制备，例如:利用核酸合成仪，根据SEQ ID NO:1所示碱基，人工合成水黄皮耐逆相关基因MpSRG。
[0027]本发明的技术路线为:
[0028]1)利用分子生物学方法从水黄皮中克隆耐逆相关基因，命名为MpSRG ；
[0029]2)构建MpSRG重组植物表达载体PBI121_MpSRG，用农杆菌转化拟南芥，获得转MpSRG基因拟南芥；
[0030]3)结果表明=MpSRG基因在拟南芥中超表达，提高了转基因拟南芥的耐盐性。
[0031]本发明克隆了一种水黄皮耐逆相关基因MpSRG，构建MpSRG重组植物表达载体，用农杆菌转化拟南芥，获得转MpSRG基因拟南芥，结果表明MpSRG基因在拟南芥中超表达，提高了转基因拟南芥的耐盐性。证明MpSRG基因具有提高植物耐逆性的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为实时荧光定量PCR分析MpSRG在盐胁迫处理下的表达特征图；
[0033]图2MpSRG重组植物表达载体PBI 121_MpSRG构建流程图；
[0034]图3为MpSRG基因在转MpSRG基因拟南芥植株中的表达量RT-PCR检测图；
[0035]图4为野生型植株和转MpSRG基因植株在盐胁迫下的相对根长测定及表型观察图，注:(a)纵坐标相对根长用小数表不作图,两个星号表不P〈0.01 ；
[0036]图5为野生型植株和转MpSRG基因植株在盐胁迫下的生长比较图，注:(a)转基因拟南芥在150mM NaCl胁迫10天后恢复10天和30天表型观察；(b)转基因拟南芥在150mMNaCl胁迫10天后恢复10天的存活率统计；(c)转基因拟南芥在150mM NaCl胁迫10天后恢复30天的干重统计；(d)转基因拟南芥在150mM NaCl胁迫10天后恢复30天统计主茎高；一个星号表不P〈0.05,两个星号表不P〈0.01。
【具体实施方式】
[0037]以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
[0038]实施例1水黄皮耐逆性相关蛋白MpSRG编码基因的筛选及其全长cDNA克隆
[0039]用海水(相当于30%。NaCl)和淡水处理水黄皮一月龄植株，然后选取处理2、4和8小时的根和叶样品分别进行RNA提取，再将三个时间点的RNA等量混合，构建得到四个文库(即根淡水处理、根海水处理、叶淡水处理和叶海水处理)后进行Illumina测序。最后，将测序结果进行组装和拼接，得到十万多条unigene序列。根据以下三个原则选择基因:首先，该基因在盐胁迫后表达显著上调表达；其次，该基因同源性最高的序列来自于豆科物种；再次，与该基因相似性最大的几个基因在植物耐盐和干旱机制方面的还未见研究报道。根据以上三原则得到一个水黄皮基因，其表达受盐胁迫诱导。
[0040]提取水黄皮幼苗总RNA，通过RACE技术获取全长cDNA。将水黄皮总RNA分别经5’和3’RACE所用化学试剂处理，然后进行巢式PCR，将得到的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。将该回收片段与PMD18-T载体连接，把连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态，通过PMD18-T载体上的氨苄青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的M13-47和RV-M序列引物进行测序。将测序结果用GeneTool软件进行拼接并分析，又将拼接后序列与转录组测序获得的序列进行比对，并且将拼接后序列与NCBI数据库比对。比对结果表明，RACE所获得的序列在5’端具有帽子结构，在3’端具有poly (A)结构，说明这就是全长cDNA序列，进一步分析获得了开发阅读框(0RF)。结果表明MpSRG基因由402个脱氧核糖核苷酸组成，具体序列如SEQ ID NO:1所示；其编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
`[0041]RACE实验巢式所用引物如下:
[0042]
【权利要求】
1.一种水黄皮耐逆相关基因MpSRG，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的水黄皮耐逆相关基因MpSRG编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
3.含有权利要求1所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG的重组载体。
4.权利要求3所述重组载体为重组植物表达载体。
5.含有权利要求3或4所述重组载体的重组细胞。
6.权利要求1所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG在提高植物耐逆性中的应用。
7.权利要求6所述植物为农作物。
8.一种提高植物耐逆性的方法，将水黄皮耐逆相关基因MpSRG导入植物组织或细胞，得到耐逆性提高的植物，所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG是下述核苷酸序列之一:
1)SEQ ID NO:1 所示 DNA 序列； 2)编码SEQID NO:2所示氨基酸残基序列的DNA序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG通过含有所述水黄皮耐逆相关基因MpSRG的重组植物表达载体导入植物组织或细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述重组植物表达载体为PBI121-M pSRG。
【文档编号】C12N5/10GK103468710SQ201310363323
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】郑易之, 黄健子, 黄荣峰, 陈受宜, 张万科, 严昊 申请人:深圳大学