专利名称：逆转录病毒免疫疗法的策略的制作方法
技术领域：
本发明提供一种治疗哺乳动物被试者中逆转录病毒感染的方法。更具体而言，本发明提供一种治疗导致人类被试者中免疫缺陷-相关疾病的逆转录病毒感染的方法。
背景技术：
人免疫缺陷病毒(HIV)可诱导持续和进展性的感染，在绝大多数情况下，导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的发生。现有至少有2种不同类型的HIVHIV-1和HIV-2。在人类中，HIV感染最终导致免疫机能不全、机会性感染、神经机能障碍、肿瘤生长、及最后的死亡。
HIV是逆转录病毒的慢病毒家族的成员。逆转录病毒是较小的有包膜病毒，含有单链RNA基因组，并经由DNA中间体插入到通过病毒编码的逆转录酶产生的宿主DNA中而复制。其它逆转录病毒包括，例如，致癌病毒，如人T-细胞白血病病毒(HTLV-I、-II、-III)、猫白血病病毒、和鼠C型逆转录病毒。
HIV病毒颗粒包括病毒核心，部分由被称作p24和p18的衣壳蛋白组成，以及病毒RNA基因组和早期复制事件所需的那些酶。十四酰化gag蛋白围绕病毒核心形成外层病毒壳，其依次被来源于感染细胞膜的脂膜包膜围绕。HIV包膜表面糖蛋白被合成为一个单一的160千道尔顿的前体蛋白，其在病毒向两个糖蛋白gp41和gp120中芽殖的过程中被细胞蛋白酶裂解。gp41是一种跨膜糖蛋白，gp120是一种胞外糖蛋白，其保持与gp41非共价关联，可能是三聚或多聚的形式。
HIV感染属于流行病，且HIV-相关疾病代表了一种主要的世界健康问题。虽然已经付出巨大的努力来设计有效的疗法，但是目前还没有抗AIDS的可治愈的抗逆转录病毒药物或疗法存在。在研制这种药物的尝试中，HIV生命周期的若干阶段已经被认为是治疗性干预的目标(Mitsuya等，1991)。
人们已经关注研制用于治疗HIV感染的疫苗。HIV-1包膜蛋白(gp160、gp120、gp41)已经显示是AIDS患者中存在的抗-HIV抗体的主要抗原(Barin等，1985)。因此，迄今这些蛋白似乎是作为抗-HIV疫苗研究的抗原起作用的最有希望的候选物。很多小组已经开始使用gp160、gp120、和/或gp41的各个部分作为宿主免疫系统的免疫原性靶(US 5,141,867；WO 92/22654；WO 91/09872；WO 90/07119；US 6,090,392)。尽管作了这些努力，但是还没有研制出用于治疗HIV感染的有效疫苗策略。
本发明提供一种用于治疗逆转录病毒感染的替代免疫疗法。
发明概述本发明人已经注意到在应答感染哺乳动物的逆转录病毒时产生至少两个免疫细胞群体。具体而言，感染逆转录病毒的哺乳动物的免疫系统能够通过一组细胞，此处通常称作“效应细胞”增强抗所述病毒的免疫应答，然而，第二细胞群体也同时产生，它们可调节“效应细胞”，此处通常称作“调节细胞”，限制哺乳动物有效控制或消除逆转录病毒感染的能力。
然而不希望受到理论的限制，提出了人含有很多与在它们基因组内断裂成稳定的可遗传元件的逆转录病毒序列同源或近似同源的序列。因此，由这些序列编码的蛋白可在免疫应答的发展过程中“自我”识别。随后的逆转录病毒感染还可部分“自我”识别，限制免疫系统增强成功的免疫应答的能力。这个提议，至少部分，可解释为什么直到现在还很难研制出抗HIV的有效疫苗。
这种假设的支持已经由Rakowicz-Szulczynska及其同事(1998和2000)提出，它们证明了与乳腺癌有关的某些抗原与由HIV-1编码的蛋白在分子学和免疫学方面相似。相似的观察结果已经相对于其它癌症作出。此外，Coll等(1995)已经报道了结合患有自身免疫疾病，如Sjogren’s综合征和系统性红斑狼疮的患者中的HIV-1的抗体。此外，对具有人免疫缺陷病毒基因组序列的人基因组数据库进行的BLAST检索表明两个基因组之间的很多区明显相同。人们已经注意到在调节细胞扩展前，相对数量的效应细胞在应答抗原时扩展。本发明提供了一种防止“调节细胞”产生、限制“调节细胞”功能，或破坏“调节细胞”，同时维持“效应细胞”的可能。
此外，本发明人还发现当抗“调节细胞”的试剂可在治疗逆转录病毒感染中给药时，急性期炎症指标的水平可被用作指示剂。
因此，第一方面本发明提供一种治疗哺乳动物被试者中逆转录病毒感染的方法，该方法包括给予被试者一种组合物，该组合物可增加抗逆转录病毒的效应细胞的数量、和/或激活效应细胞，随后给予被试者一种可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂，其中该试剂的给药时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
有很多方式都可增加抗逆转录病毒的效应细胞的数量、和/或活性。在某些情况中，这可能会由于无意中感染逆转录病毒，例如，被含病毒的注射器的针尖刺到而发生。众所周知，健康的工作人员和研究人员都可能有在针刺损伤过程中感染病毒的危险。同样，公众也可能经由废弃的注射器，特别是在海滩上，和拥有这种注射器的罪犯而处于这种危险之中。因此，在怀疑与逆转录病毒，特别是HIV接触之后，哺乳动物被试者可利用本发明的方法。
本发明的方法还可用于治疗已经感染逆转录病毒一段时间的哺乳动物被试者。虽然这种被试者的免疫系统已经接触了逆转录病毒，但其它逆转录病毒抗原的加入会导致进一步的效应细胞应答，具有随后消除这些新的效应物的调节子的机会。
感染逆转录病毒的被试者可使用抗逆转录病毒的药物，如HAART疗法进行治疗，从而将病毒负荷维持在较低水平。这种被试者还可用所述组合物给药，从而引发新的效应细胞免疫应答，然而随后给予所述试剂可消除调节细胞。
在优选实施方案中，监测急性期炎症指标水平的波动以确定何时给予所述试剂。正如本领域已知的，某些急性期炎症指标最初在免疫应答过程中增加(此后称作急性期炎症阳性指标)，而另外一些最初在免疫应答过程中降低(此后称作急性期炎症阴性指标)。
优选，所述急性期炎症指标是急性期炎症阳性指标，且所述试剂大约是在标记水平最初增加之后、急性期炎症阳性指标水平开始降低时给予的。在这种情况下，效应细胞的产生和/或活性是通过急性期炎症阳性指标水平的增加所表示的。调节细胞克隆扩展之后，效应细胞的活性被下调，从而导致急性期炎症阳性指标水平降低。
优选，所述急性期炎症阳性指标是c-反应性蛋白。
在特别优选的实施方案中，所述试剂大约是在c-反应性蛋白水平已经达到峰值并开始降低时给予的。
人们还发现急性期炎症指标可作为病毒负荷的指示剂，这是因为有效的免疫应答可导致病毒负荷降低，从而导致急性期炎症指标水平降低。因为急性期炎症指标水平可很容易地在少量的血液样品中测量，因此它可被用作何时开始监测病毒负荷的指示剂。
因此，在另一优选实施方案中，所述试剂大约是给予所述组合物之后，病毒颗粒的数量开始稳定或增加时给予的，其中在给予所述组合物后，急性期炎症阳性指标水平开始降低时，开始测试被试者中的病毒颗粒水平。应注意的是，所述试剂的给药时间还可符合在最初的峰值之后，病毒颗粒的数量降低(见
图18)。
优选，急性期炎症阳性指标是c-反应性蛋白。
在第一方面的另一优选实施方案中，感染哺乳动物被试者中效应细胞的再次刺激可通过含有逆转录病毒抗原多肽的组合物获得。优选，所述抗原多肽是通过给予一种含有逆转录病毒抗原多肽和药学上可接受载体的疫苗而提供给被试者的。更优选，所述疫苗还含有佐剂。
在另一实施方案中，所述抗原多肽是通过给予一种编码逆转录病毒抗原多肽的DNA疫苗而提供给被试者的。
在另一实施方案中，所述抗原多肽是通过食用表达逆转录病毒抗原多肽的转基因植物而提供给被试者的。
取消抗逆转录病毒疗法通常可引起抗感染被试者中再次出现的病毒的效应细胞的快速再扩展。因此，可在适宜的时间给予所述试剂，从而消除调节细胞，而无需给予此处所定义的组合物。
因此，第二方面，本发明提供一种治疗哺乳动物被试者中逆转录病毒感染的方法，该方法包括使被试者接受抗逆转录病毒药物疗法，随后给予被试者能够抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂，其中所述试剂是在抗逆转录病毒药物疗法已经结束后给予的，且逆转录病毒数量的最终扩展导致抗逆转录病毒的效应细胞数量的增加、和/或激活，且其中该试剂的给药时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
优选，所述急性期炎症指标是急性期炎症阳性指标。优选，所述急性期炎症指标是c-反应性蛋白。
在优选实施方案中，所述试剂是在c-反应性蛋白水平已经达到峰值并开始降低时给予的。
优选，所述抗逆转录病毒药物疗法是HAART。
在取消抗逆转录病毒药物疗法后，病毒负荷增加(例如，见Daar等，1998和图18)。如此导致抗逆转录病毒的效应细胞扩展和/或激活，其开始使病毒负荷稳定。大约在逆转录病毒数量已经达到峰值、或在该峰值之后开始降低时，应当给予该试剂。如上所述，急性期炎症指标水平可以成为病毒负荷的指示剂。
因此，在第二方面的又一优选实施方案中，所述试剂大约是在病毒颗粒数已经达到峰值、或在该峰值之后开始降低时给予的，应答抗逆转录病毒药物疗法的结束，其中在抗逆转录病毒药物疗法结束后，急性期炎症阳性指标水平开始增加时，测试被试者中的病毒颗粒水平。
另一方面，本发明提供可增加抗逆转录病毒的效应细胞的数量、和/或激活效应细胞的组合物用于制造给予感染逆转录病毒的哺乳动物被试者的药物的用途，其中随后给予被试者可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂，且其中给予该试剂的时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
另一方面，本发明提供可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂用于制造给予感染逆转录病毒的哺乳动物被试者的药物的用途，其中先前已经给予被试者可增加抗逆转录病毒的效应细胞的数量、和/或激活效应细胞的组合物，且其中给予该试剂的时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
另一方面，本发明提供抗逆转录病毒药用于制造给予感染逆转录病毒的哺乳动物被试者的药物的用途，其中随后给予被试者可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂，且其中给予该试剂的时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
另一方面，本发明提供可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂用于制造给予感染逆转录病毒的哺乳动物被试者的药物的用途，其中先前已经给予该被试者抗逆转录病毒药物，且其中给予该试剂的时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
优选，用于消除调节细胞的试剂选自抑制调节细胞活性下调的抗体、放疗和抗-增殖药物。优选，抗-增殖药物选自长春花碱和脱水长春花碱。
优选抗体的例子包括，但不限制于，抗-CD4+、抗-CTLA-4(细胞毒性淋巴细胞相关抗原-4)、和抗-CD28。
优选，逆转录病毒选自HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2。
正如本领域那些技术人员很容易认识到的那样，本发明的方法可被重复从而提供更完全的治疗。
优选，哺乳动物被试者是人。
另一方面，本发明提供一种试剂盒，它含有i)一种用于增加抗哺乳动物被试者中逆转录病毒的效应细胞的数量、和/或激活效应细胞的组合物；ii)可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂；和iii)用于测定急性期炎症指标水平的工具。
另一方面，本发明提供一种试剂盒，它含有i)至少一种抗逆转录病毒的药物；ii)可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂；和iii)用于测定急性期炎症指标水平的工具。
在上面描述的各方面，“调节细胞”群的消除可使“效应细胞”群减少或消除逆转录病毒负荷，因为效应物的任何下调(由于自我耐受机理)已被除去。
很明显，本发明其中一个方面的优选特征和性质可应用于本发明其它方面。
在本说明书中，词语“包含”或变换，如“包括”或“含有”可被理解为包括规定的元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤的集合，但不排除任何其它的元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤的集合。
此后，将通过下列非限制性附图和实施例描述本发明。
附图简述图1感染LP-BM5的B6小鼠中MAIDS的时间过程。
图2在感染后10周时，单一剂量的长春花碱(6mg/kg，i.p.)对MAIDS进展的作用。
图3感染后10周，用长春花碱治疗过的小鼠脾脏的组织学。
图4进行长春花碱治疗后，在感染后20周时，可免受MAIDS感染。n＝5。
图5进行保护性长春花碱治疗后，用MAIDS病毒再次侵袭。n＝5。
图6第14天时，长春花碱对感染MAIDS(MAIDS+)的小鼠和对照小鼠(MAIDS-)中脾细胞百分比的作用。n＝3。
图7脾转移实验方案。
图8脾细胞从感染MAIDS的供体小鼠转移。n＝7。
图9体内损耗实验方案。
图10感染后第14天，CD4+或CD8+细胞的体内损耗。n＝5。
图11在实施例第4部分中描述的过继转移实验方案的流程图。
图12使用未感染的供体细胞进行的CD4+CD25+/-过继转移的结果。脾重量是在MAIDS感染后10用时获得的(n＝5只小鼠/组)。
图13感染MAIDS小鼠的血清中的IL-4。每个时间点代表9只小鼠的平均值+/-SEM。
图14感染MAIDS小鼠的血清中的IL-10。每个时间点代表9只小鼠的平均值+/-SEM。
图15通过脾脏总WBC中胞内流动测定的IL-4和IL-10水平。数据是以每组3只小鼠的平均值+/-SEM表示的。
图16通过感染MAIDS小鼠的脾WBC的ELISpot测定的IL-4产生。数据是以每组3只小鼠的平均值+/-SEM表示的。
图17通过感染MAIDS小鼠的脾WBC的ELISpot测定的IL-10产生。数据是以每组3只小鼠的平均值+/-SEM表示的。
图18应答取消人类患者进行的HAART治疗时，HIV RNA、c-反应性蛋白和T细胞的水平。
发明详述
定义这里所用的术语“治疗”是指获得逆转录病毒负荷的降低。最优选，逆转录病毒负荷被完全消除。
“调节细胞”包括，但不是必需限制于，CD4+T细胞的亚群。这种细胞在本领域中还可被称作“抑制细胞”。调节细胞或者可以直接作用于效应细胞，或者可以通过其它机理维持它们对效应细胞的作用。
CD4+细胞表达本领域已知的标记CD4。通常，这里所用的术语“CD4+T细胞”不指代也表达CD8的细胞。然而，该术语可包括也表达其它抗原标记，如CD25的T细胞。
“效应细胞”包括，但不是必需限制于，被称作CD8+细胞的T细胞群。
这里所用的术语“消除”或“消除”当涉及“调节细胞”与所述试剂接触时，是指调节细胞的数量、和/或活性被该试剂下调。最优选，调节细胞的数量、和/或活性被该试剂完全消除。
除非另有说明，本发明中所用的重组DNA和免疫学技术属于标准操作，对于本领域那些技术人员而言是熟知的。这类技术通过下列来源的文献来描述和解释，如J.Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)，T.A.Brown(编者)，EssentialMolecular BiologyA Practical Approach，卷1和2，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNA CloningAPractical Approach，卷1-4，IRL Press(1995和1996)，和F.M.Ausubel等人(编者)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括到目前为止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编者)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，，和J.E.Coligan等人(编者)Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons(包括到目前为止的所有更新)，它们引入此处作为参考。
可抑制调节细胞的产生 限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂所述试剂可以是选择性或非选择性导致调节细胞的产生被破坏或抑制的任何因子或治疗。例如，CD4+特异性抗体可用于特异性针对CD4+T细胞。然而，在某些情况下，可使用非选择性试剂，如抗增殖药物或放疗，两者都可破坏分裂的细胞。
术语“抗增殖药物”是本领域熟知的术语，指代可破坏分裂的细胞或抑制它们经过进一步增殖的任何化合物。抗增殖药物包括，但不限制于，氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、六甲基三聚氰胺、噻替派、白消安、卡莫司汀、罗氮芥、司莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖孢苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷托他丁、长春花碱、脱水长春花碱、长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、L-天门冬酰胺酶、顺铂、米托蒽醌、羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、氨鲁米特、泼尼松、羟基孕酮己酸盐、甲羟孕酮醋酸盐、甲地孕酮醋酸盐、己烯雌酚、乙炔雌二醇、他莫昔芬、睾酮丙酸盐、放射性同位素、蓖麻毒蛋白A链、紫杉醇、白喉毒素和假单胞菌外毒素A。
所述试剂可以本领域所用的标准剂量给药。在其中一个实施方案中，所述试剂可以作为单一的大输液给药。在另一实施方案中，所述试剂可在一段时间、例如24小时内通过输注给药。
被试者接受试剂的时间正如上面所描述的，本发明依赖于在调节细胞之前，效应细胞的相对数量在应答抗原时发生扩展的观察结果。因此，这里所用的术语“效应细胞的活性没有显著降低”是指该试剂的给药时间是所述试剂对调节细胞的作用较之对效应细胞的作用，成比例地更大。显然，优选所述试剂是在对调节细胞的作用与对效应细胞的作用的比值达到最大时给药。
据报道，在进行抗逆转录病毒治疗后病毒负荷开始降低后，例如，在感染HIV的被试者中，病毒负荷增加，且随后在取消治疗后，存在对病毒负荷增加的免疫应答刺激(Oritz等，1999；Kilby等，2000；Lifson等，2000)。因此，使被试者接受抗病毒疗法后，再取消该疗法可用于增加抗逆转录病毒的效应细胞的数量、和/或激活效应细胞，使可靶向的调节细胞扩展。
给予所述试剂的适宜时间的例子可参考Daar等人(1998)来确定。该文献提供了取消高活性抗逆转录病毒疗法(也称作HAART)的患者的病毒负荷，及CD8+和CD4+T细胞的水平。病毒负荷开始升高后，当CD8+T细胞已经达到最大数量时，病毒负荷出现降低，并因此发挥作用(见Daar等人，1998的图1)。在该时间点(几天)后，CD8+T细胞立刻开始减少，病毒负荷在下降后开始稳定。
同样，图18显示在结束HAART之后，患者中的病毒负荷开始增加，接着由于效应细胞的活性，HIV RNA降低，然后由于效应细胞的调节，HIV RNA水平再次增加。
峰值可被用作推论点来预测随后调节细胞的克隆扩展和调节细胞消除的介入点。所述试剂应当在绝大多数调节细胞处于克隆扩展(有丝分裂)时应用，其通常相当于病毒负荷最初增加之后已经稳定时和/或最初增加之后已经达到峰值时、和/或最初增加之后病毒负荷可能降低(如图18所示)时、和/或最迟在病毒负荷第二次升高刚刚开始时。
在绝大多数情况下，给予所述试剂的时间点需要在感染的不同阶段，根据被试者免疫应答动力学的变化而凭经验确定。其它因素，如被试者的一般健康状况和/或被试者的遗传组成也将影响给予所述试剂的适宜时间。
人们已经确定了c-反应性蛋白水平的增加与病毒负荷增加大约同时发生(见图18)。随后，由于效应细胞活性对病毒负荷的作用，使逆转录病毒数降低，从而致c-反应性蛋白的水平降低。因此，该信息可用于确定所述试剂的正确给药时间。因此，在优选实施方案中，所述试剂大约是在c-反应性蛋白水平已经达到峰值并开始降低时给药的。
确定给予所述试剂时间点的另一途径是在刺激免疫应答后监测病毒负荷。因为c-反应性蛋白测定法相对简单而且灵敏，且c-反应性蛋白的水平与病毒负荷相关联(见图18)，因此这种测定法可用于确定何时开始结束监测病毒负荷。例如，当c-反应性蛋白的水平已经开始增加时，可开始监测病毒负荷。
上述与c-反应性蛋白有关的这些方法可使用其它急性期炎症阳性指标进行。
预期病毒负荷降低是由于效应细胞的活性，然而，随后调节细胞的增加将对效应细胞进行下调，导致病毒负荷降低减缓。因此，所述试剂可在病毒负荷降低减缓之前给药。本领域已知的技术，例如RT-PCR可用于监测这些情况下的病毒负荷。
监测可能需要非常频繁地进行，例如，常常每隔几小时进行一次，以确保选择给予所述试剂的正确的时间点。优选，至少每隔48小时进行一次监测。更优选，每隔24小时进行一次监测。
最好持续进行监测以测定所述试剂的作用。治疗大约7天内，调节细胞的不充分消除、再现或病毒负荷的增加是指应当重复本发明的方法。这种治疗的重复循环可产生免疫记忆。因此，很可能以重复方式使用的本发明可提供某些预防性保护作用。
急性期炎症指标如上所述，一些急性期炎症指标在免疫应答过程中开始增加(此后称为急性期炎症阳性指标)，而另一些则在免疫应答过程中开始降低(此后称为急性期炎症阴性指标)。在本领域中，急性期炎症指标也被称为急性期反应物或急性期蛋白。
急性期炎症阳性指标的例子包括，但不限制于，c-反应性蛋白、血清淀粉样A、血清淀粉样P成分、补体蛋白如C2、C3、C4、C5、C9、B、C1抑制剂和C4结合蛋白、血纤蛋白原、冯维勒布兰德因子、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-抗纤维蛋白溶酶、肝素辅因子II、纤溶酶原激活物抑制剂I、触珠蛋白、血红素结合蛋白(haemopexin)、血浆铜蓝蛋白、超氧化锰歧化酶、α1-酸性糖蛋白、血红素(haeme)加氧酶、甘露糖-结合蛋白、白细胞蛋白I、脂蛋白(a)和脂多糖-结合蛋白。急性期炎症阴性指标的例子包括，但不限制于，白蛋白、前-白蛋白、转铁蛋白、apoAI、apoII、α2HS糖蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂和富含组氨酸的糖蛋白。
血清淀粉样A的水平可按照本领域已知的来测定，见，例如O′Hara等，(2000)。
c-反应性蛋白(CRP)是一种重要的急性期阳性反应蛋白，在急性期反应过程中，其在血清中的浓度可增加多达1,000-倍。CRP是一种由5个相同亚单位组成的五聚物，每个亚单位的分子量约为23,500。
c-反应性蛋白的水平可使用本领域抑制的技术测定，这些包括，但不限制于，在Senju等人(1983)，Price等人(1987)和Eda等人(1998)中公开的那些。
HAART术语“HAART”包括具有至少3种抗逆转录病毒剂的任何联合疗法，其中每种试剂都以治疗有效量给予被试者。就本发明的目的而言，抗逆转录病毒剂包括可抑制、减少或消除细胞逆转录病毒感染的任何物质。这些试剂多数可商业获得，并按照制造商建议的剂量用于给药。这些抗逆转录病毒剂包括，但不限制于，逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂两类，以及属于病毒侵入抑制剂的试剂。虽然可使用三种或更多这些试剂的任何组合，但优选HAART包括给予治疗有效量的至少一种逆转录酶抑制剂和至少一种蛋白酶抑制剂联合至少一种其它的抗逆转录病毒剂。
很多逆转录酶抑制剂都可商业获得，用于给予HAART。例子包括，但不限制于，从Glaxo-Wellcome Inc.，Research Triangle，NC27709获得的商标为RETROVIR的齐多夫定(AZT)；从Bristol-MyersSquibb Co.，Princeton，NJ 08543获得的商标为VIDEX的地达诺新(ddl)；从Roche Pharmaceuticals，Nutley，N.J.07110获得的商标为HIVID的扎西胞苷(ddC)；从Bristol-Myers Squibb Co.，Princeton，N.J.08543获得的商标为ZERIT的司他夫定(d4T)；从Glaxo-Wellcome Research Triangle，N.C.27709获得的商标为EPIVIR的拉米夫定(3TC)；在WO 96/30025中公开并且从Glaxo-Wellcome Research Triangle，N.C.27709获得的商标为ZIAGEN的abacavir(1592U89)；从Gilead Sciences，Foster City，Calif.94404获得的商标为PREVON的阿德福韦二叔戊酰氧甲酯[双(POM)-PMEA]；洛布卡韦(BMS-180194)，一种在EP-0358154和EP-0736533中公开并由Bristol-Myers Squibb，Princeton，N.J.08543研制的核苷逆转录酶抑制剂；BCH-10652，一种由Biochem Pharma，Laval，Quebec H7V，4A7，Canada研制的逆转录酶抑制剂(BCH-10618和BCH-10619的外消旋混合物形式)；由Emory University under EmoryUniv.US 5,814,639许可并由Triangle Pharmaceuticals，Durham，N.C.27707研制的emitricitabine[(-)-FTC]；由Yale大学许可Vion Pharmaceuticals，NewHaven Conn.06511生产的β-L-FD4(也称作β-L-D4C和β-L-2′，3′-dicleoxy-5-氟cytidene)；和DAPD，在EP 0656778中公开并由Emory大学和Georgia大学许可TrianglePharmaceuticals，Durham，N.C.27707生产的嘌呤核苷，(-)-β-D-2，6，-二氨基嘌呤二氧戊环；和lodenosine(FddA)，9-(2，3-二脱氧-2-氟-b-D-苏型-pentofuranosyl)腺嘌呤，一种由NIH发现并由U.S.Bioscience Inc.，West Conshohoken，Pa.19428研制的酸稳定性的嘌呤-基逆转录酶抑制剂。
用于本发明中的蛋白酶抑制剂的例子包括，但不限制于，从RochePharmaceuticals，Nutley，N.J.07110-1199获得的沙喹那韦(Ro31-8959)的商标为INVIRASE的硬明胶胶囊和商标为FORTOUASE的软明胶胶囊；从Abbott Laboratories，Abbott Park，111.60064获得的商标为NORVIR的利托那韦(ABT-538)；从Merck & Co.，Inc.，West Point，Pa.19486-0004获得的商标为CRIXIVAN的吲哚那韦(MK-639)；从Agouron Pharmaceuticals，Inc.，LaJolla，Calif.92037-1020获得的商标为VIRACEPT的奈非那韦(AG-1 343)；安泼那韦(141W94)，一种由Vertex Pharmaceuticals，Inc.，Cambridge，Mass.02139-4211研制并从Glaxo-Wellcome，Research Triangle，N.C.获得的非-肽蛋白酶抑制剂，在扩展存取程序下；从Bristol-Myers Squibb，Princeton，N.J.08543获得的lasinavir(BMS-234475)(最初由Novartis，Basel，Switzerland(CGP-61755发现)；DMP-450，一种由Dupont发现并由Triangle Pharmaceuticals研制的环状脲；BMS-2322623，一种由Bristol-Myers Squibb，Princeton，N.J.08543研制的，作为第2代HIV-1 PI的氮杂肽；和由Abbott，Abbott Park，I11.60064研制的ABT-378；和AG-1549，一种由Shionogi(Shionogi #S-1153)发现并由AgouronPharmaceuticals，Inc.)，LaJolla Calif.92037-1020研制的口服活性咪唑氨基甲酸酯。
这些化合物的适宜人用剂量可广泛变化。然而，这种剂量可由本领域那些技术人员很容易地确定。治疗有效量的这些药物是在HAART过程中给予的。“治疗有效量”是指足以降低HIV感染作用的抗逆转录病毒剂的用量、或足以有利地影响HAART方案所用的一种或多种其它抗逆转录病毒剂的药动学分布的用量。“有利地影响”是指当以治疗有效量给药时，所述抗逆转录病毒剂可影响HAART中所用的一种或多种其它抗逆转录病毒剂的代谢，这样就可增加其它试剂的生物利用度。
有关任何已知抗逆转录病毒剂的给药剂量的指导在本领域中可以获得，且包括以它们的建议剂量给予商业获得的试剂。
抗原多肽这里所用的“抗原”多肽是含有能够产生抗逆转录病毒的免疫应答的表位的任何多肽序列。通常，抗原多肽含有在绝大多数逆转录病毒分离物中高度保守的序列。然而，预期可以对感染个体的特定逆转录病毒进行表征，且与分离物的序列最大程度匹配的抗原多肽产生有效免疫应答的可能性。
有关HIV抗原，如gp120和其它候选物的信息参见Stott等人(1998)。
抗原多肽可以本领域已知的任何方式提供，其可导致免疫应答。抗原多肽可以是，例如，天然的、重组的或合成的。这种抗原多肽包括，但不限制于，负责与细胞表面受体连接从而引发感染过程的病毒蛋白，如包膜糖蛋白。
例如，天然抗原多肽可通过提供减毒的逆转录病毒、热灭活的逆转录病毒或任何其它被杀死的逆转录病毒而制备。
抗原多肽可以分离多肽的形式在疫苗组合物中提供。在这种情况下，所述多肽可从感染逆转录病毒的细胞纯化，表达并从重组细胞分离，或使用肽合成仪合成产生。
疫苗疫苗可从一个或多个逆转录病毒多肽制备。含有抗原多肽的疫苗的制备是本领域技术人员已知的。通常，这种疫苗可被制成可注射的，或口服的，如液体溶液或混悬液；还可制备注射之前适用于溶液或混悬液中的、或适于口服消耗的固体形式。所述制剂还可以被乳化，或将蛋白包裹在脂质体中。所述抗原多肽常常与药学上可接受的且与活性成分相容的载体/赋形剂混合。适宜的载体/赋形剂是，例如，水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。
此外，如果需要，所述疫苗还可含有微量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂、和/或可提高疫苗有效性的佐剂。
这里所用的术语“佐剂”是指非特异性提高对抗原多肽的免疫应答的物质。有效佐剂的例子包括但不限制于N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，被称作正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷氧酰基)-乙胺(CGP 19835A，称作MTP-PE)、和RIBI，在2％角鲨烯/Tween 80乳液中，其含有从细菌中提取的3个成分，单磷酰脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐剂的其它例子包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(alum)、细菌性内毒素、脂类X、棒状杆菌属(痤疮丙酸杆菌)、百日咳杆菌、多核糖核苷酸、藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂甙、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡萄糖、嵌段共聚物或其它合成的佐剂。这种佐剂可从各种来源商业获得，例如，Merck Adjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。
抗原多肽与佐剂的比例可在较宽的范围内变化，只要以有效量存在。例如，氢氧化铝可占疫苗混合物的约0.5％用量(Al2O3主要成分)。很方便地，将所述疫苗配制成含有0.2-200μg/ml、优选5-50μg/ml、最优选15μg/ml终浓度的抗原多肽。
配制后，可将所述疫苗加入到无菌容器中，然后将容器密封并在低温，例如4℃下贮存，或将它冷冻干燥。冷冻干燥可使得以稳定形式长期贮存。
通常，所述疫苗可通过注射，例如，皮下或肌内注射而非肠道给药。适于其它给药方式的其它制剂包括栓剂和，在某些情况下，口服制剂。就栓剂而言，常规的粘合剂和载体可包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；这种栓剂可从含有0.5-10％、优选1-2％活性成分的混合物形成。口服制剂包括这类正常使用的赋形剂，例如，制药级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物可采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉剂的形式，并含有10％-95％、优选25％-70％的活性成分。在将疫苗组合物冷冻干燥的情况下，可在给药之前，将冷冻干燥的物质重构，例如，重构成混悬液。重构优选在缓冲剂中进行。
用于口服给予患者的胶囊剂、片剂和丸剂可用含有，例如，Eudragit ″S″、Eudragit ″L ″、醋酸纤维素酯、邻苯二甲酸乙酸纤维素或羟丙基甲基纤维素的肠溶衣提供。
DNA接种DNA接种包括将编码抗原的DNA直接体内引入到被试者的组织中，使患者组织的细胞表达该抗原。此处称这种疫苗为“DNA疫苗”或“基于核酸的疫苗”。DNA疫苗在US 5,939,400、US 6,110,898、WO95/20660和WO 93/19183中描述，其中公开的内容整体引入此处作为参考。编码抗原、直接注射的DNA引发保护性免疫应答的能力已经在若干实验系统中被证实(见，例如，Conry等人，1994；Cardoso等人，1996；Cox等人，1993；Davis等人，1993；Sedegah等人，1994；Montgomery等人，1993；Ulmer等人，1993；Wang等人，1993；Xiang等人，1994；Yang等人，1997)。
迄今为止，哺乳动物系统中的绝大多数DNA疫苗依赖源于巨细胞病毒(CMV)的病毒启动子。这些在很多哺乳动物物种的肌肉和皮肤接种中都具有良好的效能。已知可影响由DNA免疫接种引发的免疫应答的因子属于DNA送递的方法，例如，非肠道途径可产生低速的基因转移并产生基因表达的大量变异(Montgomery等人，1993)。使用基因枪高速接种质粒可提高小鼠的免疫应答(Fynan等人，1993；Eisenbraun等人，1993)，这大概是由于更高效率的DNA转染和树状细胞的更有效的抗原呈递。还可将含有本发明基于核酸的疫苗的载体通过本领域已知的其它方法，例如转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、或DNA载体转运蛋白而引入到所需宿主中。
来源于转基因植物的疫苗产生逆转录病毒抗原多肽的转基因植物可使用本领域熟知的过程构造。目前，已经相对于动物和人类的病原体研制了很多可食用的植物来源的疫苗(Hood和Jilka，1999)。免疫应答还可能是由于用产生病毒样颗粒(VLP)、或展示表位的嵌合植物病毒的转基因植物口服接种(Mason等人，1996；Modelska等人，1998；Kapustra等人，1999；Brennan等人，1999)而产生。人们已经提出颗粒形式的这些VLP或嵌合病毒可导致抗原在胃中的更高稳定性，有效增加肠中吸收的抗原量(Mason等人，1996；Modelska等人，1998)。
实施例实施例1为了证实本发明，使用鼠AIDS模型。
由易感小鼠中LP-BM5鼠白血病病毒(MuLV)诱导的鼠AIDS(MAIDS)病理是研究逆转录病毒诱导的免疫缺陷机理的有效工具。该MAIDS动物模型显示出很多人AIDS的特征。易感株，如用LP-BM5感染C57BL/6小鼠的感染可导致慢性脾肿大、血丙球蛋白过多和T细胞及B细胞免疫缺陷的发展。在体外，T细胞和B细胞对致有丝分裂或特异性抗原刺激的应答能力出现进展性损害。在体内，感染小鼠对使用各种机会生物进行的侵袭越来越敏感，并发展成B-细胞淋巴瘤。首先在感染后(pi)8-10周时观察到死亡，且在24周内所有小鼠均死亡(图1)。免疫功能的这些改变反映了免疫网所有组份的表型和功能的复杂变化。
1.在感染后的不同时间给予的单一剂量的长春花碱的治疗作用用单一剂量的抗-有丝分裂剂长春花碱(Vb)在pi不同时间治疗能够防止MAIDS的发展/进行。图2显示在从6hr到28天的pi不同时间给予单一6mg/kg i.p.剂量的Vb对MAIDS发展的作用(由pi 10周的平均脾重量表示)。显然，在pi 6hr或14天给药时，Vb治疗分别对100％(10/10)和74％(20/27)的小鼠具有显著的治疗作用，pi 10周时则没有MAIDS发展的体征(通过脾重量、组织学和FACS分析测定)。类似的保护作用在pi 6天(6/13或46％)治疗的某些小鼠中观察到。其它实验提供的结果是pi 14天用Vb治疗(没有数据显示)后至少12个月，100％的小鼠没有MAIDS发展的体征。虽然不像治疗第14天后见到的保护那样显著，但仍然观察到对MAIDS发展的适度保护。然而，也很重要的是注意到在很多其它时间点的治疗，如pi第2天和第7天，对MAIDS的发展没有保护作用。在pi 6小时给予Vb的小鼠中见到的对MAIDS发展的全部保护并不是预料不到的，这是因为病毒在积极复制的细胞中复制，这些细胞是抗-有丝分裂药物的靶，因此感染病毒的任何细胞都可被Vb杀死，Vb可防止病毒在宿主中迅速建立感染。然而，在pi 14天用Vb单一治疗后观察到的高度保护作用十分显著，在这个阶段，病毒感染被很好地建立，且早期疾病过程在很好的进行当中。我们提出这种高度的治疗作用是由于Vb在免疫调节细胞的扩展阶段针对它们的特定亚组，并由此改变对病毒感染的免疫应答。免疫效应细胞的下调是通过针对调节细胞的Vb治疗而被除去的，由此通过免疫系统的效应细胞更有效且甚至可能完全清除该病毒。这样一来，可在感染后并治疗的多个月时间内，使长期疾病患者自由存活。
2.进一步描述第14天的治疗作用2.1.在感染后10周，Vb治疗小鼠中的脾组织学将pi第14天Vb治疗的小鼠及感染和未感染对照小鼠的脾脏称重并进行组织学检查。所有MAIDS感染小鼠的脾脏结构像先前报道的那样被严重破坏(Hartley等人，1989)。相反，具有标准脾重量(低于0.25g)的Vb治疗小鼠的脾脏结构与未感染的对照小鼠不能区别(图3)。
作为该组织学数据的支持，在pi 10周时，基于pi第14天Vb治疗的小鼠脾细胞的FACS分析的初步结果显示出与在正常未感染小鼠(没有给出数据)中观察到的那些类似的细胞比例(CD4+、CD8+和B细胞)和分布。
2.2.Vb治疗后对MAIDS发展的长期保护为了测定感染小鼠的MAIDS发展是否完全受到保护或是否Vb治疗仅仅延迟疾病的发作和进行，我们在pi第14天用Vb治疗小鼠并等到pi 20周检查小鼠。该实验的结果(图4)显示在pi 20周，80％(4/5小鼠)的任何脾肿大都受到保护，证实第14天Vb治疗法的高度有效作用。
2.3.Vb治疗后，对病毒再次侵袭没有保护作用为了测定MAIDS在pi第14天受到Vb治疗保护的小鼠是否发生免疫应答，其然后保护它们免受随后小鼠MAIDS病毒组的再次侵袭，在pi第14天进行Vb治疗，在Vb治疗后3或8周，用MAIDS病毒再次侵袭。该小鼠没有免受病毒的再次侵袭并发展成脾肿大和淋巴结病，表明在第20周MAIDS发展(图5)。这并不是意想不到的，是由于调节细胞群所致的优势免疫抑制已经因对第二次(未治疗的)感染的免疫效应应答而恢复。
3.针对CD4+细胞的Vb治疗3.1.在感染后第14天进行Vb治疗后，脾细胞的直接FACS分析对从pi第14天用Vb治疗小鼠的脾脏制备的CD4+和CD8+T细胞进行FACS分析(图6)。并时CD25+CD4+T细胞进行检验，这是因为近来它们已经被鉴定为在自身免疫疾病和肿瘤免疫学的小鼠模型中具有重要的调节功能(Takahashi等人，1998；Shimizu等人，1999)。可能这些细胞可在对MAIDS的免疫应答的调节方面发挥作用。对pi第14天和未感染对照小鼠给予Vb疗法，并在Vb治疗后48小时收集脾脏。数据分析显示所有细胞亚组都可被Vb疗法降低，未感染与感染比例的比较显示它是CD4+T细胞和CD25+CD4+T细胞，在MAIDS感染小鼠中，这些细胞优选可通过Vb治疗。
3.2.脾细胞转移实验针对CD4+细胞的Vb疗法先前的实验显示存留于脾脏中的主要免疫细胞亚组(CD4+和CD8+细胞)都可受到Vb治疗的影响，然而，似乎优选针对CD4+细胞，表明这些细胞的亚组可在pi第14天被克隆扩展。图7所示的实验被设计用于测定在pi第14天给药的单一剂量的Vb正在消除扩展的CD4+调节T细胞群，并由此释放下调的效应细胞，并清除MAIDS病毒的宿主。
感染MAIDS的小鼠在pi第14天接受Vb处理，然后接受按照图7所述制备的源于供体小鼠的约107个脾细胞的过继转移。对于每个实验[指定为(I)、(II)和(III)]组而言，都由7只受体小鼠和9只供体小鼠组成。I组小鼠接受没有进行任何Vb治疗的感染小鼠的整个脾脏。II组小鼠接受感染小鼠的整个脾细胞制剂，其中在用荧光染料-标记的抗-CD4单克隆抗体染色后，使用FACS细胞分类器可知所述感染小鼠的CD4+细胞已经损耗。细胞分类可除去源于脾细胞制剂的99.5％CD4+细胞。III组小鼠接受感染供体小鼠的整个脾脏，其中所述感染供体小鼠也在pi第14天接受Vb治疗。
将MAIDS感染供体的脾细胞注入Vb-治疗的MAIDS感染小鼠中会完全阻碍Vb对小鼠MAIDS发展的保护(图8)。此外，排除Vb保护作用的脾细胞是CD4+细胞，这是因为当在转移前除去供体脾细胞中的CD4+细胞时，通过FACS分类，Vb的保护作用没有被排除。此外，将在第14天接受Vb的MAIDS感染供体小鼠的脾细胞注入到Vb-治疗的MAIDS中，显示这些小鼠的MAIDS发展完全受到保护(图8)。
3.3感染后14天，CD4+细胞的体内损耗导致免于MAIDS发展脾转移结果与解释相一致，在pi 14天，免疫效应细胞与调节细胞的克隆扩展群体共存，所述调节细胞是CD4+，且Vb是依靠其破坏后者的能力而治疗的。因此，pi第14天，CD4+细胞体内损耗的时间点应当模拟Vb的作用。实验的流程图在图9中给出。用MAIDS病毒感染每组5只小鼠，然后用单克隆抗体治疗，从而在pi 14天使宿主CD4+或CD8+T细胞损耗。收集产生抗体的杂交瘤细胞系上清液中的单克隆抗体，并通过硫酸铵沉淀纯化。体内试验显示，单一注射(0.5mg i.p.)适当浓缩的单克隆抗体制剂可导致CD4+细胞降低98％，CD8+细胞降低95％。
显然，用抗-CD4+单克隆抗体在pi 14天治疗可防止感染小鼠MAIDS发展，由此模拟pi 14天Vb注射的作用(图10)。相反，pi 14天的CD8+细胞的体内损耗对疾病发展没有作用。该结果进一步支持了CD4+T细胞群对应答病毒感染的免疫效应细胞进行功能性下调的假设。此外，除去优势CD4+调节细胞可使免疫效应细胞更有效地应答病毒感染，导致疾病发展更缓慢或可能完全清除宿主的MAIDS病毒。
4.CD4+CD25+T细胞作为调节细胞的作用过继转移实验被设计直接检验CD4+CD25+T细胞在鼠AIDS模型中起调节细胞作用的假设。用于确定调节细胞是CD4+T细胞的相同方法可用于试验CD4+CD25+亚组是否是第14天长春花碱治疗的目标。图11显示实验完全合理。调节CD4+CD25+表型的2.0×106个细胞是用两个正选择步骤，使用MACS珠(Miltenyi Biotec)从供体脾脏的单细胞混悬液纯化的。然后通过流式细胞术测试细胞纯度(CD4+CD25+和CD4+CD25-部分＞90％纯度)，并在转移到未感染(对照)和感染MAIDS且在第14天进行长春花碱治疗的小鼠中前，使用台盼蓝排除测试细胞的活力。转移CD4+CD25-细胞，使调节细胞不存在于CD25+部分中，并可能使这些推定的调节细胞损失CD25表达，因为它们扩展并被激活，如Gavin等人，2002所报道的。
接受细胞过继转移的小鼠或者未感染(对照)或感染了MAIDS，并在第14天接受长春花碱治疗，从而检测细胞转移是否导致疾病发展。基本上，如果CD4+CD25+T细胞起调节细胞的作用，那么这些细胞经由过继转移的恢复应当导致疾病发展，消除第14天长春花碱治疗的保护性作用。疾病的发展是通过MAIDS感染后10周，利用脾重量评估的。
使用未感染供体小鼠进行过继转移实验的结果在图12中显示。在阴性对照实验中，CD4+CD25+/-表型的未感染供体细胞的转移不会导致pi 10周未感染受体脾重量的任何改变。然而，当CD4+CD25+/-细胞被转移到感染MAIDS、第14天接受Vb治疗的受体中时，疾病发展迅速明显。有趣的是，这两组的脾重量存在统计学显著差异(p＝0.033)，表明在接受CD4+CD25+细胞的组中，疾病发展更显著。事实上，在这些实验中，pi 10周的对照MAIDS脾脏约为0.5-0.6g。这些结果表明，调节细胞存在于CD4+CD25+和CD25-部分中，CD25+部分在抑制效应细胞方面更有效。
5.MAIDS感染后的细胞因子水平5.1血清ELISA在感染后的前3周进行定量ELISA，测试小鼠血清中是否存在IL-4和IL-10。IL-4和IL-10都是已经证明过的、由调节细胞产生，且是调节细胞成熟所需的细胞因子(Gavin等人，2002，McGuirk和Mills，2002)。简单地说，在感染后的不同天，通过小鼠尾部放血获得血液，并高速离心收集血清。然后测定这些样品的细胞因子水平，最终的数据在图13和14中表示。
在增加超过pi 21天之前，有2个清晰的IL-4产生的峰，第1个位于pi 7天，第2个位于pi 14-16天。最后的增加可能与B细胞寡克隆扩展有关，寡克隆扩展是其后期MAIDS的主要特征。
测定相同的血液样品中是否存在IL-10。IL-10也显示出3个峰，第1个位于pi 4-5天，第2个位于pi 12-14天，第3个位于pi 16天。有趣的是，注意到CD4+CD25+细胞百分比的峰出现在第10-12天(没有给出数据)，与第2个IL-10的峰重叠。特别是，CD25(即IL-2受体)在细胞群进入细胞循环并有丝分裂之前，是以瞬时方式表达的(Roitt等人，1989)。组合方式提示当Vb或抗-CD4治疗消除MAIDS发展时，少量调节细胞扩展并在准确时间发挥作用。也就是说，该数据与这里所述的T细胞调节假设相一致。
5.2通过胞内流动测定细胞因子水平胞内流动是一种已经得到发展的方法，并可用于使用流式细胞术检测存在于个体细胞中的细胞因子的离体水平。在该实验中，用MAIDS感染小鼠，在感染后的每个第4天(第4、8、12、16和20天)收集脾脏，并收集第0天的未感染对照小鼠的脾脏，得到胞内细胞因子产生的基线。将脾脏制备成单细胞混悬液，将红细胞溶解，然后固定WBC，渗透并对细胞表面标记和细胞因子的组合染色。实验结果在图15中表示。
IL-4和IL-10的表达水平与pi 16天的两个峰值非常相似，然后在pi 20天降低，但没有恢复到基线水平。此数据与血清ELISA的结果相一致(图13和14)，其中两个细胞因子产生的峰值都是在pi 16天观察到的，正如先前所述，与MAIDS感染后CD4+CD25+百分比的分布十分相关。
5.3通过ELISpot测定细胞因子水平ELISpot是一种以ELISA为基础的技术，可在单细胞水平分析细胞因子的产生。在孔中培养目标细胞，其基质是用目标细胞因子的单克隆抗体预-涂覆的薄膜。该培养步骤可具有或没有细胞的刺激。因为在培养过程中没有移动平板，因此分泌的细胞因子局限于细胞的位置，它被与薄膜基质结合的抗体捕获，这样一来，分泌细胞因子的每个细胞都在薄膜上留下一个斑点，斑点在抗体检测后可见。该技术可将产生目标细胞因子的细胞数量化至单细胞水平。对于该实验而言，使用与胞内流动相同的方案在pi 0、4、8、12、16和20天收集小鼠的脾WBC。然后在没有刺激的条件下，在IL4-和IL-10 ELISpot平板上培养这些细胞过夜。然后将该平板显色，并计算斑点数。IL-4的结果在图16中表示，IL-10的结果在图17中表示。
又，正如胞内流动和血清ELISA那样，可见到两个细胞因子的相似趋势，即在pi 16天，表达各细胞因子的细胞数增加到峰值，接着在pi 20天显著降低。
6.概述本实施例表明，存在著将对MAIDS病毒的免疫应答下调的“调节细胞”群，它可使病毒增殖并引起疾病。在感染后的适宜时间除去调节细胞可使效应细胞(如B细胞和CD8+T细胞)更有效地清除病毒，阻止疾病发展。这些调节细胞被提出用于控制细胞，如CD8+T细胞和B细胞的激活和/或功能，它们可起效应细胞的作用，排除病毒感染。
通过特异性除去免疫调节细胞群而调节免疫应答先前已经由Robert North及其同事使用鼠T细胞淋巴瘤模型而研究过(North和Awwad，1990)。North提出免疫原性肿瘤能够由于CD4+调节T细胞群对免疫应答的下调而建立和生长。这种调节不能使免疫应答在强度上充分发展从而引起肿瘤退化。值得注意的是，在肿瘤接种后的不同时间用单一剂量的长春花碱(Vb)进行治疗可导致肿瘤的增强(第10天)或退化(第4、6、13和15天)。North假设所观察到的退化是由于在那些时间点，CD4+调节T细胞的消除。在一系列涉及CD4+和CD8+T细胞选择性损耗的实验中，将调节细胞鉴定为CD4+表型。
近交和野生小鼠的染色体DNA含有与MuLV核酸探针反应的序列的多个拷贝。这些序列中包括完全的，若干MuLV的潜在感染性基因组(Chattopadhyay等人，1980)。所有MuLV共有高度的序列同源性。我们假设当这些内源性MuLV蛋白在发展过程中表达，则它们可作为自身抗原被免疫系统识别。由于内源性和外源性MuLV核酸及氨基酸序列之间的高水平同源性，感染MuLV也可作为自身抗原被免疫系统部分识别，且对病毒感染的任何免疫应答将被下调，导致病毒清除减少且疾病发展。
实施例2使患有HIV感染的人类患者接受HAART至少6个月，然后取消治疗。使用标准技术测定在HAART过程中和结束后获得的样品的病毒负荷及c-反应性蛋白水平。
正如在图18中所看到的那样，结果显示HAART结束后，病毒负荷增加。之后由于效应细胞的活性，病毒负荷降低，接着由于效应细胞的调节，病毒负荷再次增加。c-反应性蛋白水平近似反映病毒负荷，表明该蛋白的测定可用作效应细胞活性以及病毒负荷的标记。
实施例3将含有逆转录病毒抗原多肽的疫苗给予患有HIV感染的人类患者。这种疫苗的例子在Dennehy(2001)和Moore等(2001)中讨论。
给予疫苗后，按照实施例2的一般性描述分析c-反应性蛋白的水平。优选，至少每隔24小时测定一次c-反应性蛋白的水平。自然，应当检查患者的任何体征，例如，可导致c-反应性蛋白水平升高的其它病毒或细菌感染。在没有这种体征的情况下，继续监测c-反应性蛋白的水平，直到c-反应性蛋白的水平达到峰值并开始降低。作为效应细胞调节的指示，大约在c-反应性蛋白的水平开始降低时，以标准剂量，如300mg给予被试者抗-CD4+抗体。
然后继续监测患者的HIV标记，如测定病毒负荷。如果有证据显示感染还未被适当控制，则可重复治疗。
实施例4使患有HIV感染的人类患者接受标准的HAART治疗。结束HAART后，按照实施例2中的一般性描述分析被试者的c-反应性蛋白的水平。优选，至少每隔24小时测定一次c-反应性蛋白的水平。作为效应细胞调节的指示，大约在c-反应性蛋白水平的开始降低时，以标准剂量，如3-4mg/m2静脉内给予被试者长春花碱(Casciato和Lowitz，1995)。长春花碱将针对分裂细胞，如调节细胞，它们开始克隆扩展，从而控制效应细胞的水平。
然后，继续监测患者的HIV指标，如测定病毒负荷。如果有证据表明感染还没有被适当控制，则可重复治疗。
本领域技术人员应当认识到，可在不背离广泛描述的本发明精神或范围的前提下，对具体实施方案所示的本发明进行若干变化和/或修改。因此，本发明的实施方案在所有方面中都被认为是举例说明，而不是对本发明的限制。
上面讨论的所有公开出版物都整体引入此处作为参考。
包括在本发明说明书中的有关文献、作用、材料、装置、物品的任何讨论都仅仅是为本发明提供内容的目的。在本申请每个权利要求的优先权日之前，不应认为这些事件的任何或全部形成现有技术基础的一部分或是现有的与本发明相关领域中的一般性知识，特别是在澳大利亚。
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权利要求
1.一种治疗哺乳动物被试者中逆转录病毒感染的方法，该方法包括给予被试者一种可增加抗逆转录病毒的效应细胞的数量，和/或激活效应细胞的组合物，随后给予被试者一种抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂，其中给予该试剂的时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
2.权利要求1所述的方法，其中所述急性期炎症指标是急性期炎症阳性指标。
3.权利要求2所述的方法，其中所述急性期炎症阳性指标是c-反应性蛋白。
4.权利要求2或3所述的方法，其中所述试剂大约是在急性期炎症阳性指标的水平已经达到峰值并开始降低时给予的。
5.按照权利要求2-4任何一项所述的方法，其中所述试剂大约是在给予所述组合物后，病毒颗粒的数量已经开始稳定或增加时给予的，其中在给予所述组合物后，当急性期炎症阳性指标水平开始增加时开始测试被试者中的病毒颗粒水平。
6.按照权利要求1-5任何一项所述的方法，其中所述组合物含有逆转录病毒抗原多肽。
7.权利要求6所述的方法，其中所述逆转录病毒抗原多肽是通过给予一种含有逆转录病毒抗原多肽和药学上可接受载体的疫苗而提供给被试者的。
8.权利要求7所述的方法，其中所述疫苗还含有佐剂。
9.权利要求6所述的方法，其中所述抗原多肽是通过给予一种编码逆转录病毒抗原多肽的DNA疫苗而提供给被试者的。
10.权利要求6所述的方法，其中所述抗原多肽是通过食用表达逆转录病毒抗原多肽的转基因植物而提供给被试者的。
11.一种治疗哺乳动物被试者中逆转录病毒感染的方法，该方法包括使被试者接受抗逆转录病毒药物疗法，随后给予被试者一种抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂，其中该试剂是在抗逆转录病毒药物疗法已经结束后给予的，且逆转录病毒数量的最终扩展导致抗逆转录病毒的效应细胞的数量增加，和/或激活效应细胞，其中给予该试剂的时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
12.权利要求11所述的方法，其中所述急性期炎症指标是急性期炎症阳性指标。
13.权利要求12所述的方法，其中所述急性期炎症阳性指标是c-反应性蛋白。
14.权利要求12或13所述的方法，其中所述试剂大约是在急性期炎症指标的水平已经达到峰值并开始降低时给予的。
15.按照权利要求12-14任何一项所述的方法，其中所述试剂大约是在给予所述组合物后，病毒颗粒的数量已经开始稳定或增加时给予的，其中在抗逆转录病毒药物疗法结束后，急性期炎症阳性指标水平开始增加时开始测试被试者中的病毒颗粒水平。
16.按照权利要求11-15任何一项所述的方法，其中所述抗逆转录病毒药物疗法是HAART。
17.按照权利要求1-16任何一项所述的方法，其中所述试剂选自抑制调节细胞下调活性的抗-增殖药物、放疗、和抗体。
18.权利要求17所述的方法，其中所述抗-增殖药物选自长春花碱和脱水长春花碱。
19.权利要求17所述的方法，其中所述抗体是抗-CD4+。
20.按照权利要求1-19任何一项所述的方法，其中所述逆转录病毒选自HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2。
21.按照权利要求1-20任何一项所述的方法，其中所述方法重复至少一次。
22.按照权利要求1-21任何一项所述的方法，其中所述哺乳动物被试者是人。
23.可增加抗逆转录病毒的效应细胞数量、和/或激活效应细胞的组合物用于制造给予感染逆转录病毒的哺乳动物被试者的药物的用途，其中随后给予该被试者可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂，其中给予该试剂的时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
24.可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂用于制造给予感染逆转录病毒的哺乳动物被试者的药物的用途，其中先前已经给予该被试者可增加抗逆转录病毒的效应细胞数量、和/或激活效应细胞的组合物，其中给予该试剂的时间是以效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
25.抗逆转录病毒药用于制造给予感染逆转录病毒的哺乳动物被试者的药物的用途，其中随后给予该被试者可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂，其中给予该试剂的时间是以抗逆转录病毒的效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
26.可抑制调节细胞的产生、限制调节细胞的功能、和/或破坏调节细胞的试剂用于制造给予感染逆转录病毒的哺乳动物被试者的药物的用途，其中先前已经给予该被试者抗逆转录病毒的药物，其中给予该试剂的时间是以抗逆转录病毒的效应细胞的活性不显著降低而选择的，且其中当给予该试剂时，被试者中急性期炎症指标水平的波动被用于帮助测定。
全文摘要
本发明人指出在应答感染哺乳动物的逆转录病毒时产生至少两个免疫细胞群体。具体而言，感染逆转录病毒的哺乳动物的免疫系统能够通过一组细胞、此处通常称作“效应细胞”来增强抗所述病毒的免疫应答，然而，第二细胞群体也同时产生，它们可调节“效应细胞”，此处通常称作“调节细胞”(或抑制细胞)，限制哺乳动物有效控制或消除逆转录病毒感染的能力。因此，本发明利用这些观察结果提供用于治疗感染逆转录病毒的哺乳动物的方法。此外，本发明人已经发现急性期炎症指标可用于检测和监测“效应细胞”对逆转录病毒抗原的应答。
文档编号A61K45/06GK1646156SQ03808873
公开日2005年7月27日 申请日期2003年2月18日 优先权日2002年2月20日
发明者M·L·阿什当 申请人:免疫援助有限公司