一种稻曲病菌菌种长期保存的方法
【专利摘要】本发明公开了一种稻曲病菌菌种长期保存的方法。该方法的技术要点是利用稻曲病菌薄壁分生孢子在水中生存期长的生活特性，用纯净的薄壁分生孢子作为菌种的存贮形态。该方法的技术步骤如下：1）培养制备含薄壁分生孢子的培养产物；2）薄壁分生孢子的纯净处理；3）适合贮存的孢子液的调配；4）孢子液装管存贮；5）菌种复活培养。本发明的优点是：菌种保存时长超过4年；无需每年转管培养的护理工作；减小菌种变异机率；盛装菌种的管具体积小，存放菌种需要空间少，便于管理。
【专利说明】一种稻曲病菌菌种长期保存的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业技术和生物技术。具体是一种稻曲病菌菌种长期保存的方法。
【背景技术】
[0002]稻曲病是我国水稻生产的一个重大病害。该病害的科学有效防治有赖于该病害的基础研究，而该病害病原菌菌种的有效保存则是许多基础研究的基础工作。特别是稻曲病菌的分离技术难度较大，高效长期保存菌种的方法将为研究工作提供很大的便利。至今，稻曲病菌菌种的保存往往采用试管斜面培养基生长的菌丝体形态存放，这样的保存方法虽然简单有效，但也存在一些弊病，主要是保存时间较短，要达到长期保存菌种的目的，每年需要I?2次的转管培养护理工作，而反复的转管培养很容易导致该病菌菌种产生变异；而且在病菌菌株数量较多时，护理工作量大，耗时费力。另外，以这种方式保存的菌丝体，移植恢复生长所需时间较长，一般要耗时7?10天。
[0003]在实验室内，很容易培养获得稻曲病菌的薄壁分生孢子。已经知道，该薄壁分生孢子在琼脂类培养基平板上很容易萌发生长，而发明人发现，该孢子在水中一般不萌发，但这不萌发的孢子并没有失去萌发活力，当将这些在水中存放的孢子转到琼脂平板上后，孢子能恢复萌发，生长发育成正常新一代菌体；该孢子可以在水中保持多年仍具有萌发活力。稻曲病菌薄壁分生孢子的这种生活特性，在菌种保存中有应用价值，但至今还没有利用薄壁分生孢子保存稻曲病菌菌种的实践应用和配套方法。
[0004]本
【发明内容】
[0005]本发明的目的提供一种稻曲病菌菌种长期保存的方法。
[0006]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0007]—种稻曲病菌菌种长期保存的方法采用较纯净的稻曲病菌薄壁分生孢子作为菌种的存贮形态，以下简称稻曲病菌薄壁分生孢子为薄壁分生孢子，长期保存方法的步骤如下:
[0008]1.培养含薄壁分生孢子的培养产物:
[0009]采用二期培养方法或三期培养方法，用稻曲病菌菌丝体在液体培养基中通过振荡培养方式，培养薄壁分生孢子，具体用如下方法:
[0010]用半量的PSA培养基，该培养基成分为:马铃薯100g、蔗糖10g、琼脂20g和水1000ml，培养该病菌获得稻曲病菌菌落；挑取小块稻曲病菌菌落移入半量的PS培养液，该培养液成分为:马铃薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振荡培养器内，在转速为150转/分和温度为28°C条件下振荡培养，7天左右培养液内产生大量的薄壁分生孢子；
[0011]2.薄壁分生孢子的纯净处理:
[0012]将上述步骤I)获得的薄壁分生孢子进行纯净化处理，处理方法如下:
[0013]A.去除菌丝体:用2层灭菌纱布将振荡培养获得的培养产物过滤，菌丝体将滤集在纱布上，收集过滤液，能获得没有菌丝体的薄壁分生孢子液；
[0014]B.去除培养基组分和代谢产物:将去除菌丝体的薄壁分生孢子液进行离心沉淀处理，在6000转/分的转速离心15分钟，能将薄壁分生孢子沉淀出来。离心完成后倾弃上清液，留下沉淀薄壁分生孢子；
[0015]C.进一步净化:取无菌水将沉淀薄壁分生孢子重新悬浮分散，搅动洗涤，然后再离心沉淀一次，倾弃上清液后，可获得纯净的薄壁分生孢子；
[0016]3.适合贮存的薄壁分生孢子液的调配:
[0017]薄壁分生孢子浓度的调配方法如下:
[0018]用适量无菌水将上述步骤2)获得纯净的薄壁分生孢子沉淀再悬浮分散成孢子液，用移液器将这薄壁分生孢子液由离心管转移到较大的无菌容器小三角瓶或小烧杯内，使用血球计数板进行孢子数量检测，用无菌水将薄壁分生孢子液调配至浓度为IO6个孢子/ml左右；
[0019]4.薄壁分生孢子液装管存贮:用移液器将调配好的薄壁分生孢子液分装到管具5ml冷冻管内，回盖密封后,置于23?25°C下存放；
[0020]5.稻曲病菌菌种复活培养:需要使用菌种时，取出贮存薄壁分生孢子液的管具，充分振荡使薄壁分生孢子悬浮并分散均匀，用微量移液器取10?20 μ I薄壁分生孢子液转移到半量的PSA培养基上，在温度为28°C条件下培养，5天后可长出新的稻曲病菌菌落。
[0021]本发明的优点是:
[0022]1.保存时间长，菌种存活期超过4年。
[0023]2.无需每年转管培养的护理工作。
[0024]3.减小菌种变异机率。`
[0025]4.盛装菌种的管具体积小，贮存菌种需要空间少，便于管理。
【具体实施方式】:
[0026]下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0027]实施例1
[0028]采用本发明一种稻曲病菌菌种长期保存的方法，以薄壁分生孢子作为菌种的存贮形态，保存稻曲病菌菌株Uv-34，按如下步骤实施操作:
[0029]I)培养含薄壁分生孢子的培养产物:
[0030]采用二期培养方法，通过振荡培养获得含有大量的薄壁分生孢子的培养产物，具体如下；用半量的PSA培养基，该培养基成分为:马铃薯100g、蔗糖10g、琼脂20g和水1000ml，培养该病菌获得稻曲病菌菌落；挑取小块稻曲病菌菌落移入半量的PS培养液，该培养液成分为:马铃薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振荡培养器内，在转速为150转/分和温度为28°C条件下振荡培养，一般7天左右培养液内产生大量的薄壁分生孢子。
[0031]2)薄壁分生孢子的纯净处理:
[0032]进行菌种保存用的薄壁分生孢子必须要处于纯净状态，需要将上述步骤I)获得的薄壁分生孢子进行纯净化处理，处理方法如下:
[0033]A.去除菌丝体:用2层灭菌纱布将振荡培养获得的培养产物过滤，菌丝体将滤集在纱布上，收集过滤液，能获得没有菌丝体的薄壁分生孢子液。
[0034]B.去除培养基组分和代谢产物:将去除菌丝体的薄壁分生孢子液进行离心沉淀处理，在6000转/分的转速离心15分钟。离心完成后倾弃上清液，留下沉淀薄壁分生孢子，即能达到去除培养基组分和菌体生长的代谢产物的目的。
[0035]C.进一步净化:取无菌水将沉淀薄壁分生孢子重新悬浮分散，搅动洗涤，然后再离心沉淀一次，倾弃上清液后，可获得纯净的薄壁分生孢子。
[0036]3)适合贮存的薄壁分生孢子液的调配:
[0037]贮存状态的薄壁分生孢子，以浓度约为IO6个孢子/ml的状态最适宜。薄壁分生孢子浓度的调配方法如下:
[0038]用适量无菌水将上述步骤2)获得纯净的薄壁分生孢子沉淀再悬浮分散成孢子液，用移液器将这薄壁分生孢子液由离心管转移到较大的无菌容器，如小三角瓶或小烧杯内，使用血球计数板进行孢子数量检测，用无菌水将薄壁分生孢子液调配至浓度为IO6个孢子/ml ο
[0039]4)薄壁分生孢子液装管存贮:
[0040]将上步骤调配好的孢子液分装到5ml冷冻管内，回盖密封后，于2008年8月20日开始，置于23?25°C条件下贮存；
[0041]5)稻曲病菌菌种复活培养:于2013年6月25日取出贮存了 4年零10个月后的薄壁分生孢子液，充分振荡使薄壁分生孢子悬浮并分散均匀，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液转移到半量的PSA培养基上，在温度为28°C条件下培养，5天后培养基上长出正常的稻曲病菌小菌落。
[0042]实施例2.[0043]采用本发明一种稻曲病菌菌种长期保存的方法，以薄壁分生孢子作为菌种的存贮形态，保存稻曲病菌菌株Uv-105，按实施例1的步骤I)至步骤4)操作实施；于2008年12月9日开始，置于23?25°C条件下存放；保存4年零6个月后，按实施例1的步骤5)操作实施，于2013年6月25日取出贮存了 4年零10个月后的薄壁分生孢子液，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液转移到半量的PSA培养基上，在温度为28°C条件下培养，5天后培养基上长出正常的稻曲病菌小菌落。
[0044]实施例3
[0045]采用本发明一种稻曲病菌菌种长期保存的方法，以薄壁分生孢子作为菌种的存贮形态，保存稻曲病菌菌株Uv-110，按实施例1的步骤I)至步骤4)操作实施；于2008年12月9日开始，置于23?25°C条件下存放；保存4年零6个月后，按实施例1的步骤5)操作实施，于2013年6月25日取出贮存了 4年零10个月后的薄壁分生孢子液，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液转移到半量的PSA培养基上，在温度为28°C条件下培养，5天后培养基上长出正常的稻曲病菌小菌落。
【权利要求】
1.一种稻曲病菌菌种长期保存的方法，其特征在于，采用较纯净的稻曲病菌薄壁分生孢子作为菌种的存贮形态，以下简称稻曲病菌薄壁分生孢子为薄壁分生孢子，长期保存方法的步骤如下: 1)培养含薄壁分生孢子的培养产物: 采用二期培养方法或三期培养方法，用稻曲病菌菌丝体在液体培养基中通过振荡培养方式，培养薄壁分生孢子，具体用如下方法: 用半量的PSA培养基，该培养基成分为:马铃薯100g、蔗糖10g、琼脂20g和水1000ml，培养该病菌获得稻曲病菌菌落；挑取小块稻曲病菌菌落移入半量的PS培养液，该培养液成分为:马铃薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振荡培养器内，在转速为150转/分和温度为28°C条件下振荡培养，7天左右培养液内产生大量的薄壁分生孢子； 2)薄壁分生孢子的纯净处理: 将上述步骤I)获得的薄壁分生孢子进行纯净化处理，处理方法如下: A.去除菌丝体:用2层灭菌纱布将振荡培养获得的培养产物过滤，菌丝体将滤集在纱布上，收集过滤液，能获得没有菌丝体的薄壁分生孢子液； B.去除培养基组分和代谢产物:将去除菌丝体的薄壁分生孢子液进行离心沉淀处理，在6000转/分的转速离心15分钟，能将薄壁分生孢子沉淀出来。离心完成后倾弃上清液，留下沉淀薄壁分生孢子； C.进一步净化:取无菌水将沉淀薄壁分生孢子重新悬浮分散，搅动洗涤，然后再离心沉淀一次，倾弃上清液后，获得`纯净的薄壁分生孢子； 3)适合贮存的薄壁分生孢子液的调配: 薄壁分生孢子浓度的调配方法如下: 用适量无菌水将上述步骤2)获得纯净的薄壁分生孢子沉淀再悬浮分散成孢子液，用移液器将这薄壁分生孢子液由离心管转移到较大的无菌容器小三角瓶或小烧杯内，使用血球计数板进行孢子数量检测，用无菌水将薄壁分生孢子液调配至浓度为IO6个孢子/ml左右； 4)薄壁分生孢子液装管存贮:用移液器将调配好的薄壁分生孢子液分装到管具5ml冷冻管内，回盖密封后，置于23?25°C下存放； 5)稻曲病菌菌种复活培养:需要使用菌种时，取出贮存薄壁分生孢子液的管具，充分振荡使薄壁分生孢子悬浮并分散均匀，用微量移液器取10?20 μ I薄壁分生孢子液转移到半量的PSA培养基上，在温度为28°C条件下培养，5天后长出新的稻曲病菌菌落。
【文档编号】C12N1/04GK103436448SQ201310363335
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】张君成, 覃茜 申请人:广西大学