用于检测6种呼吸道病毒的LAMP引物组合及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测6种呼吸道病毒的LAMP引物组合及其应用。

背景技术：

呼吸道感染分为上呼吸道感染与下呼吸道感染。上呼吸道感染90％左右由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴、或经污染的用具进行传播。无论是下呼吸道感染还是上呼吸道感染，绝大部分是由病毒引起的，称为病毒性呼吸道感染。

流感病毒属于正黏病毒科，分为甲型流感病毒(如甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒等)、乙型流感病毒和丙型流感病毒三种。流感病毒是一种严重威胁人类健康的病原体，能感染广泛宿主，每年季节性的流行造成全球约6亿人感染，并导致25-50万人死亡，其中造成感染和死亡的主要是甲型流感病毒。在过去的100多年里，流感病毒至少在全球范围内引发过四次大流行，这几次大流行都是因为动物源性的流感病毒跨越宿主屏障感染人所导致。近年在全球时见报道的主要是H5N1禽流感病毒和H7N9禽流感病毒，比如1997年在香港爆发的H5N1禽流感直接感染人并导致死亡；2013年在上海、安徽等地爆发的H7N9禽流感造成300多人感染，50多人死亡。这些事件证明流感病毒不但造成巨大经济损失，同时还可能跨越宿主屏障直接感染人类，严重威胁人类公共卫生安全。

腺病毒是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。衣壳里是线状双链DNA分子。人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)为腺病毒科的哺乳动物腺病毒属成员之一，人腺病毒是引起婴幼儿急性呼吸道感染等多种疾病的重要病原体之一。导致急性呼吸道感染的主要流行株为HAdV-3(人腺病毒3型)和HAdV-7(人腺病毒7型)，也可以引起其他系统的疾病，所致疾病的临床表现与其它呼吸道病毒相关病毒相似，但多伴消化道症状。全球很多国家和地区曾发生腺病毒感染暴发，我国曾于上世纪发生严重的腺病毒感染暴发流行。

呼吸道病毒的流行会给整个人类社会带来重大安全问题。开展呼吸道病毒的快速检测，对于重大传染病疫情和生物恐怖的防控具有重要意义。发展针对呼吸道病毒多种病原体的快速检测技术是及时发现传染源，实施及时有效隔离和控制传染源的关键。近年来，分子诊断方法(如聚合酶链式反应)被用于呼吸道病毒的检测，它能够准确地鉴定目标序列，但是它需要有热循环系统的元件，这通常依赖于大型仪器且价格昂贵，不利于开展快速检测。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展LAMP试剂盒的应用推广。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何检测甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、乙型流感病毒和人腺病毒。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组合，可为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ组成；

(a2)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ、所述引物组Ⅴ和所述引物组Ⅵ中的任意两个、任意三个、任意四个或任意五个组成；

(a3)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ、所述引物组Ⅴ或所述引物组Ⅵ。

所述引物组Ⅰ可由H1N1-F3、H1N1-B3、H1N1-FIP、H1N1-BIP、H1N1-LF和H1N1-LB组成；

所述H1N1-F3可为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述H1N1-B3可为如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述H1N1-FIP可为如下(b5)或(b6)：(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述H1N1-BIP可为如下(b7)或(b8)：(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述H1N1-LF可为如下(b9)或(b10)：(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述H1N1-LB可为如下(b11)或(b12)：(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅱ可由H3N2-F3、H3N2-B3、H3N2-FIP、H3N2-BIP、H3N2-LF和H3N2-LB组成；

所述H3N2-F3可为如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；

所述H3N2-B3可为如下(c3)或(c4)：(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；

所述H3N2-FIP可为如下(c5)或(c6)：(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；

所述H3N2-BIP可为如下(c7)或(c8)：(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；

所述H3N2-LF可为如下(c9)或(c10)：(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；

所述H3N2-LB可为如下(c11)或(c12)：(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅲ可由H5N1-F3、H5N1-B3、H5N1-FIP、H5N1-BIP、H5N1-LF和H5N1-LB组成；

所述H5N1-F3可为如下(d1)或(d2)：(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；

所述H5N1-B3可为如下(d3)或(d4)：(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；

所述H5N1-FIP可为如下(d5)或(d6)：(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；

所述H5N1-BIP可为如下(d7)或(d8)：(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；

所述H5N1-LF可为如下(d9)或(d10)：(d9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；(d10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；

所述H5N1-LB可为如下(d11)或(d12)：(d11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；(d12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅳ可由H7N9-F3、H7N9-B3、H7N9-FIP、H7N9-BIP、H7N9-LF和H7N9-LB组成；

所述H7N9-F3可为如下(e1)或(e2)：(e1)序列表的序列19所示的单链DNA分子；(e2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；

所述H7N9-B3可为如下(e3)或(e4)：(e3)序列表的序列20所示的单链DNA分子；(e4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；

所述H7N9-FIP可为如下(e5)或(e6)：(e5)序列表的序列21所示的单链DNA分子；(e6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；

所述H7N9-BIP可为如下(e7)或(e8)：(e7)序列表的序列22所示的单链DNA分子；(e8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；

所述H7N9-LF可为如下(e9)或(e10)：(e9)序列表的序列23所示的单链DNA分子；(e10)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；

所述H7N9-LB可为如下(e11)或(e12)：(e11)序列表的序列24所示的单链DNA分子；(e12)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅴ可由B-F3、B-B3、B-FIP、B-BIP、B-LF和B-LB组成；

所述B-F3可为如下(f1)或(f2)：(f1)序列表的序列25所示的单链DNA分子；(f2)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；

所述B-B3可为如下(f3)或(f4)：(f3)序列表的序列26所示的单链DNA分子；(f4)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；

所述B-FIP可为如下(f5)或(f6)：(f5)序列表的序列27所示的单链DNA分子；(f6)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；

所述B-BIP可为如下(f7)或(f8)：(f7)序列表的序列28所示的单链DNA分子；(f8)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子；

所述B-LF可为如下(f9)或(f10)：(f9)序列表的序列29所示的单链DNA分子；(f10)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子；

所述B-LB可为如下(f11)或(f12)：(f11)序列表的序列30所示的单链DNA分子；(f12)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅵ可由HAdV-F3、HAdV-B3、HAdV-FIP、HAdV-BIP、HAdV-LF和HAdV-LB组成；

所述HAdV-F3可为如下(g1)或(g2)：(g1)序列表的序列31所示的单链DNA分子；(g2)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的DNA分子；

所述HAdV-B3可为如下(g3)或(g4)：(g3)序列表的序列32所示的单链DNA分子；(g4)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的DNA分子；

所述HAdV-FIP可为如下(g5)或(g6)：(g5)序列表的序列33所示的单链DNA分子；(g6)将序列33经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列33具有相同功能的DNA分子；

所述HAdV-BIP可为如下(g7)或(g8)：(g7)序列表的序列34所示的单链DNA分子；(g8)将序列34经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列34具有相同功能的DNA分子；

所述HAdV-LF可为如下(g9)或(g10)：(g9)序列表的序列35所示的单链DNA分子；(g10)将序列35经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的DNA分子；

所述HAdV-LB可为如下(g11)或(g12)：(g11)序列表的序列36所示的单链DNA分子；(g12)将序列36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列36具有相同功能的DNA分子。

所述引物组Ⅰ中，H1N1-F3、H1N1-B3、H1N1-FIP、H1N1-BIP、H1N1-LF和H1N1-LB的摩尔比具体可为2：2：8：8：4：4。所述引物组Ⅱ中，H3N2-F3、H3N2-B3、H3N2-FIP、H3N2-BIP、H3N2-LF和H3N2-LB的摩尔比具体可为2：2：8：8：4：4。所述引物组Ⅲ中，H5N1-F3、H5N1-B3、H5N1-FIP、H5N1-BIP、H5N1-LF和H5N1-LB的摩尔比具体可为2：2：8：8：4：4。所述引物组Ⅳ中，H7N9-F3、H7N9-B3、H7N9-FIP、H7N9-BIP、H7N9-LF和H7N9-LB的摩尔比具体可为2：2：8：8：4：4。所述引物组Ⅴ中，B-F3、B-B3、B-FIP、B-BIP、B-LF和B-LB的摩尔比具体可为2：2：8：8：4：4。所述引物组Ⅵ中，HAdV-F3、HAdV-B3、HAdV-FIP、HAdV-BIP、HAdV-LF和HAdV-LB的摩尔比具体可为2：2：8：8：4：4。

本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)或(h3)：

(h1)鉴定甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或H5N1禽流感病毒和/或H7N9禽流感病毒和/或乙型流感病毒和/或人腺病毒；

(h2)用于检测待测样本中是否含有甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或H5N1禽流感病毒和/或H7N9禽流感病毒和/或乙型流感病毒和/或人腺病毒；

(h3)用于检测待测病毒是否为甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、乙型流感病毒或人腺病毒。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)或(h3)：

(h1)鉴定甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或H5N1禽流感病毒和/或H7N9禽流感病毒和/或乙型流感病毒和/或人腺病毒；

(h2)用于检测待测样本中是否含有甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或H5N1禽流感病毒和/或H7N9禽流感病毒和/或乙型流感病毒和/或人腺病毒；

(h3)用于检测待测病毒是否为甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、乙型流感病毒或人腺病毒。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护一种检测待测病毒是否为甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、乙型流感病毒或人腺病毒的方法，可包括如下步骤：

(1)提取待测病毒的DNA或RNA；

(2)以待测病毒的DNA或待测病毒的cDNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：

如果采用所述引物组Ⅰ可以实现特异性扩增，待测病毒为或候选为甲型H1N1流感病毒；如果采用所述引物组Ⅰ不可以实现特异性扩增，待测病毒不为或候选不为甲型H1N1流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅱ可以实现特异性扩增，待测病毒为或候选为甲型H3N2流感病毒；如果采用所述引物组Ⅱ不可以实现特异性扩增，待测病毒不为或候选不为甲型H3N2流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅲ可以实现特异性扩增，待测病毒为或候选为H5N1禽流感病毒；如果采用所述引物组Ⅲ不可以实现特异性扩增，待测病毒不为或候选不为H5N1禽流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅳ可以实现特异性扩增，待测病毒为或候选为H7N9禽流感病毒；如果采用所述引物组Ⅳ不可以实现特异性扩增，待测病毒不为或候选不为H7N9禽流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅴ可以实现特异性扩增，待测病毒为或候选为乙型流感病毒；如果采用所述引物组Ⅴ不可以实现特异性扩增，待测病毒不为或候选不为乙型流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅵ可以实现特异性扩增，待测病毒为或候选为人腺病毒；如果采用所述引物组Ⅵ不可以实现特异性扩增，待测病毒不为或候选不为人腺病毒；

所述待测病毒的cDNA为将待测病毒的RNA进行反转录得到的。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或H5N1禽流感病毒和/或H7N9禽流感病毒和/或乙型流感病毒和/或人腺病毒的方法，可包括如下步骤：

(1)提取待测样本的DNA或RNA；

(2)以待测样本的DNA或待测样本的cDNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：

如果采用所述引物组Ⅰ可以实现特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有甲型H1N1流感病毒；如果采用所述引物组Ⅰ不可以实现特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有甲型H1N1流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅱ可以实现特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有甲型H3N2流感病毒；如果采用所述引物组Ⅱ不可以实现特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有甲型H3N2流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅲ可以实现特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有H5N1禽流感病毒；如果采用所述引物组Ⅲ不可以实现特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有H5N1禽流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅳ可以实现特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有H7N9禽流感病毒；如果采用所述引物组Ⅳ不可以实现特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有H7N9禽流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅴ可以实现特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有乙型流感病毒；如果采用所述引物组Ⅴ不可以实现特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有乙型流感病毒；

如果采用所述引物组Ⅵ可以实现特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有人腺病毒；如果采用所述引物组Ⅵ不可以实现特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有人腺病毒；

所述待测样本的cDNA为将待测样本的RNA进行反转录得到的。

以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅰ时，所述环介导等温扩增的反应体系中H1N1-F3、H1N1-B3、H1N1-FIP、H1N1-BIP、H1N1-LF和H1N1-LB的摩尔浓度依次为4μM、4μM、16μM、16μM、8μM、8μM。采用所述引物组Ⅱ时，所述环介导等温扩增的反应体系中H3N2-F3、H3N2-B3、H3N2-FIP、H3N2-BIP、H3N2-LF和H3N2-LB的摩尔浓度依次为4μM、4μM、16μM、16μM、8μM、8μM。采用所述引物组Ⅲ时，所述环介导等温扩增的反应体系中H5N1-F3、H5N1-B3、H5N1-FIP、H5N1-BIP、H5N1-LF和H5N1-LB的摩尔浓度依次为4μM、4μM、16μM、16μM、8μM、8μM。采用所述引物组Ⅳ时，所述环介导等温扩增的反应体系中H7N9-F3、H7N9-B3、H7N9-FIP、H7N9-BIP、H7N9-LF和H7N9-LB的摩尔浓度依次为4μM、4μM、16μM、16μM、8μM、8μM。采用所述引物组Ⅴ时，所述环介导等温扩增的反应体系中B-F3、B-B3、B-FIP、B-BIP、B-LF和B-LB的摩尔浓度依次为4μM、4μM、16μM、16μM、8μM、8μM。采用所述引物组Ⅵ时，所述环介导等温扩增的反应体系中HAdV-F3、HAdV-B3、HAdV-FIP、HAdV-BIP、HAdV-LF和HAdV-LB的摩尔浓度依次为4μM、4μM、16μM、16μM、8μM、8μM。

以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温60min。

本发明还保护所述引物组合在鉴定甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或H5N1禽流感病毒和/或H7N9禽流感病毒和/或乙型流感病毒和/或人腺病毒中的应用。

本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或H5N1禽流感病毒和/或H7N9禽流感病毒和/或乙型流感病毒和/或人腺病毒中的应用。

本发明还保护所述引物组合在检测待测病毒是否为甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、乙型流感病毒或人腺病毒中的应用。

上述任一所述人腺病毒具体可为人腺病毒3型或人腺病毒7型。

以上任一所述待测样本可为人(Homo sapiens)的鼻咽拭子。

本发明提供的引物组合鉴定6种呼吸道病毒(H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、乙型流感病毒和人腺病毒)，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

附图说明

图1为实施例2的实验结果。

图2为实施例3中步骤一的实验结果。

图3为实施例3中步骤二的实验结果。

图4为实施例3中步骤三的实验结果。

图5为实施例3中步骤四的实验结果。

图6为实施例3中步骤五的实验结果。

图7为实施例3中步骤六的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

LAMP扩增缓冲液的溶质及其浓度为：100mM KCl、120mM MgSO₄、10mM(NH₄)₂SO₄、10％(v/v)Tween20、250mM甜菜碱和10mM dNTPs(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为10mM)；溶剂为pH8.8、200mM Tris-HCl缓冲液。

微流控芯片和实时检测仪均为北京百康芯生物科技有限公司的产品。Magnetic Viral DNA/RNA Kit为天根生化科技(北京)有限公司的产品。

实施例1、用于检测6种呼吸道病毒的试剂盒的制备

一、引物组的制备

1、用于检测甲型H1N1流感病毒的引物组(以下命名为引物组Ⅰ)如下：外引物F3(序列表中序列1)：5’-AAGCTCAGCAAATCCTACA-3’；外引物B3(序列表中序列2)：5’-TCCCTCACTTTGGGTCTT-3’；内引物FIP(序列表中序列3)：5’-GACTTTGTTGGTCAGCACTAGTAGAAAAGGGAAAGAAGTCCTCG-3’；内引物BIP(序列表中序列4)：5’-TCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTGCTATTTCCGGCTTGAA-3’；环引物LF(序列表中序列5)：5’-GATGGTGAATGCCCCATAGC-3’；环引物LB(序列表中序列6)：5’-TTTTGTGGGGTCATCAAGATACAG-3’。

2、用于检测甲型H3N2流感病毒的引物组(以下命名为引物组Ⅱ)如下：外引物F3(序列表中序列7)：5’-CTACTGAGCTGGTTCAGAA-3’；外引物B3(序列表中序列8)：5’-GGCATAATCCGGCACATC-3’；内引物FIP(序列表中序列9)：5’-AGAGCATCTATTAGTGTGCAGTTTTCTCAATAGGTGAAATATGCGAC-3’；内引物BIP(序列表中序列10)：5’-GAGACCCTCAGTGTGATGGCGTAACAGTTGCTGTAGGCT-3’；环引物LF(序列表中序列11)：5’-CCATCAAGGATCTGATGAGGACT-3’；环引物LB(序列表中序列12)：5’-GAAATGGGACCTTTTTGTTGAACG-3’。

3、用于检测H5N1禽流感病毒的引物组(以下命名为引物组Ⅲ)如下：外引物F3(序列表中序列13)：5’-GCAATCAACGACTCAACAA-3’；外引物B3(序列表中序列14)：5’-ACAGTCCTCTTTTTCTTCTTCT-3’；内引物FIP(序列表中序列15)：5’-AGTTAATCGCCCCCATCGGATGAAAAGTGAAGTGGAATATGGTA-3’；内引物BIP(序列表中序列16)：5’-ACCATCGGAGAATGTCCCAAATACTCTCTCTTTGAGGACTATTTCTG-3’；环引物LF(序列表中序列17)：5’-TGACACCTGGTGTTGCAGT-3’；环引物LB(序列表中序列18)：5’-AAACAAATTAGTCCTTGCGACTGGG-3’。

4、用于检测H7N9禽流感病毒的引物组(以下命名为引物组Ⅳ)如下：外引物F3(序列表中序列19)：5’-TGAGAGGCGAGAAGGAAG-3’；外引物B3(序列表中序列20)：5’-GAGCCATTTCATTTCTGCA-3’；内引物FIP(序列表中序列21)：5’-GCCTGATTCTCTGAGAATTTGCCTTGATGTCTGTTATCCTGGGA-3’；内引物BIP(序列表中序列22)：5’-TGACAAGGAAGCAATGGGATTCTCCTGATCTCCTACATGCA-3’；环引物LF(序列表中序列23)：5’-CAGAGCTTCTTCATTCACGAATT-3’；环引物LB(序列表中序列24)：5’-ACAGTGGAATAAGAACTAATGGAGC-3’。

5、用于检测乙型流感病毒的引物组(以下命名为引物组Ⅴ)如下：外引物F3(序列表中序列25)：5’-TGATCTCAGAGCTGACACT-3’；外引物B3(序列表中序列26)：5’-GCAGCTATCCTGTCTAAGC-3’；内引物FIP(序列表中序列27)：5’-TAGATGCTCGTCTTCACTGTTTATTATAAGCTCACAAATAGAACTTGC-3’；内引物BIP(序列表中序列28)：5’-AACTAAAGAAAATGCTGGGTCCCGCATTTGTGTTTGGTTTCGA-3’；环引物LF(序列表中序列29)：5’-CCTTCGTTGGAAAGCAAGACT-3’；环引物LB(序列表中序列30)：5’-TCTGCTGTAGACATAGGAAACGG-3’。

6、用于检测人腺病毒的引物组(以下命名为引物组Ⅵ)如下：外引物F3(序列表中序列31)：5’-GTCTACTGGTCGCTCCCT-3’；外引物B3(序列表中序列32)：5’-GAGGATCTGGTTCTCAGGGA-3’；内引物FIP(序列表中序列33)：5’-ACCCACCACTGGGTAGTTGTTGCATGATGCAAGACCCAGTCA-3’；内引物BIP(序列表中序列34)：5’-GAGCAAGCCGTGTACTCTCAGCCGGTTGAAGACGTGCGTG-3’；环引物LF(序列表中序列35)：5’-TGTCTTGTGGAGCGGAAGG-3’；环引物LB(序列表中序列36)：5’-AGCTCCGACAGGCCACTTC-3’。

7、用于检测阪崎肠杆菌的引物组(作为内对照，以下简称内对照引物组)如下：外引物F3：5’-CCGCGTGTATGAAGAAGG-3’；外引物B3：5’-AGACTCAAGCTGACCAGT-3’；内引物FIP：5’-TGCTGGCACGGAGTTAGCGAGGAAGGTGTTGTGGTTAA-3’；内引物BIP：5’-GCGGTAATACGGAGGGTGCACTTAATCAACCGCCTGC-3’；环引物LF：5’-GGTAACGTCAATTGCTGCG-3’；环引物LB：5’-AATCGGAATTACTGGGCGTAA-3’。

二、引物组混合溶液的制备

人工合成步骤一中各个引物组的引物，然后分别用RNase-free水溶解，混合后得到相应的引物组混合溶液。

三、用于检测6种呼吸道病毒的试剂盒的制备

用于检测6种呼吸道病毒的试剂盒为将微流控芯片、LAMP扩增缓冲液、反转录酶、Bst DNA聚合酶、羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue，HNB)、引物组Ⅰ混合溶液、引物组Ⅱ混合溶液、引物组Ⅲ混合溶液、引物组Ⅳ混合溶液、引物组Ⅴ混合溶液、引物组Ⅵ混合溶液、阪崎肠杆菌基因组DNA、内对照引物组混合溶液和阴性对照品组装在一起得到的产品(微流控芯片、LAMP扩增缓冲液、反转录酶、Bst DNA聚合酶、HNB、引物组Ⅰ混合溶液、引物组Ⅱ混合溶液、引物组Ⅲ混合溶液、引物组Ⅳ混合溶液、引物组Ⅴ混合溶液、引物组Ⅵ混合溶液、阪崎肠杆菌基因组DNA、内对照引物组混合溶液和阴性对照品均为独立包装)。阴性对照品为RNase-free水。阪崎肠杆菌基因组DNA和内对照引物组混合溶液组成阳性对照品。

实施例2、特异性

待测样本1：甲型H1N1流感病毒(记载于如下文献中：王大燕，高荣保，李晓丹，等.甲型H1N1流感病毒快速核酸检测技术的建立[J].病毒学报，2009，25(B05):1-3.)。

待测样本2：甲型H3N2流感病毒(记载于如下文献中：秦萌，王大燕，黄芳，等.同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的单管多重荧光定量PCR方法[J].病毒学报，2010(2):97-102.)。

待测样本3：H5N1禽流感病毒(记载于如下文献中：Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al.Rapid diagnosis of H5N1avian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method[J].Journal of virological methods，2007，141(2):173-180.)。

待测样本4：H7N9禽流感病毒(记载于如下文献中：Bao H，Zhao Y，Wang Y，et al.Development of a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of subtype H7N9avian influenza virus[J].BioMed research international，2014，2014.)

待测样本5：乙型流感病毒(记载于如下文献中：卢亦愚，严菊英，冯燕，等.荧光定量RT—PCR快速检测乙型流感病毒核酸[J].浙江预防医学，2005，17(3):1-3.)。

待测样本6：人腺病毒3型(记载于如下文献中：侯咏，刘佳，郭彩玲，等.人腺病毒3型六邻体基因的克隆与鉴定[J].中国地方病学杂志，2003，22(3):245-247.)。

待测样本7：人腺病毒7型(记载于如下文献中：成军，孙长贵.人腺病毒7型呼吸道感染与实验室检查[J].中华检验医学杂志，2017，40(1):4-6.)。

待测样本8：RNase-free水。

各个待测样本分别进行如下步骤：

1、固定引物

(1)取微流控芯片，在反应孔#1中加入2μL引物组Ⅰ混合溶液，在反应孔#2中加入2μL引物组Ⅱ混合溶液，在反应孔#3中加入2μL引物组Ⅲ混合溶液，在反应孔#4中加入2μL引物组Ⅳ混合溶液，在反应孔#5中加入2μL引物组Ⅴ混合溶液，在反应孔#6中加入2μL引物组Ⅵ混合溶液，在反应孔#7中加入2μL内对照引物组混合溶液和1μL阪崎肠杆菌基因组DNA水溶液(含阪崎肠杆菌基因组DNA 100ng)，在反应孔#8中加入2μL RNase-free水。

(2)完成步骤(1)后，将所述微流控芯片置于洁净超净台内晾干，用密封层封装，得到已固定引物的微流控芯片。

2、提取待测样本的RNA或DNA

参考Magnetic Viral DNA/RNA Kit的操作步骤，提取待测样本的RNA或DNA。

3、制备混合体系

混合体系为70μL，由22.5μL LAMP扩增缓冲液、3μL反转录酶(浓度为10U/μL)、3μL Bst DNA聚合酶(浓度为8U/μL)、3μL羟基萘酚蓝水溶液(浓度为50pmol/μL)、5μL模板(待测样本的RNA或DNA)和33.5μL RNase-free水组成。

4、检测

(1)取已固定引物的微流控芯片，将步骤3制备的混合体系注射入进样孔中，通过进样通道流通到各个反应孔中，然后用密封层将整个芯片密封，并确保无气泡存在。

反应孔#1至反应孔#7中，外引物F3和外引物B3的浓度均为4μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为16μM，环引物LF和环引物LB的浓度均8μM，反转录酶的浓度为0.4U/μL，Bst DNA聚合酶的浓度为0.3U/μL，羟基萘酚蓝的浓度为2pmol/μL。

(2)完成步骤(1)后，进行环介导等温扩增。反应条件：65℃恒温60min；80℃恒温5min，终止反应。反应过程中，采用实时检测仪检测信号强度。

待测样本1的检测结果见图1中A。结果表明，只有固定引物组Ⅰ的反应孔#1和固定阳性对照品的反应孔#7得到的扩增曲线均为典型的“S型”扩增曲线，其它反应孔得到的扩增曲线均为水平的直线。

待测样本2的检测结果见图1中B。结果表明，只有固定引物组Ⅱ的反应孔#2和固定阳性对照品的反应孔#7得到的扩增曲线均为典型的“S型”扩增曲线，其它反应孔得到的扩增曲线均为水平的直线。

待测样本3的检测结果见图1中C。结果表明，只有固定引物组Ⅲ的反应孔#3和固定阳性对照品的反应孔#7得到的扩增曲线均为典型的“S型”扩增曲线，其它反应孔得到的扩增曲线均为水平的直线。

待测样本4的检测结果见图1中D。结果表明，只有固定引物组Ⅳ的反应孔#4和固定阳性对照品的反应孔#7得到的扩增曲线均为典型的“S型”扩增曲线，其它反应孔得到的扩增曲线均为水平的直线。

待测样本5的检测结果见图1中E。结果表明，只有固定引物组Ⅴ的反应孔#5和固定阳性对照品的反应孔#7得到的扩增曲线均为典型的“S型”扩增曲线，其它反应孔得到的扩增曲线均为水平的直线。

待测样本6的检测结果见图1中F。结果表明，只有固定引物组Ⅵ的反应孔#6和固定阳性对照品的反应孔#7得到的扩增曲线均为典型的“S型”扩增曲线，其它反应孔得到的扩增曲线均为水平的直线。

待测样本7的检测结果见图1中G。结果表明，只有固定引物组Ⅵ的反应孔#6和固定阳性对照品的反应孔#7得到的扩增曲线均为典型的“S型”扩增曲线，其它反应孔得到的扩增曲线均为水平的直线。

待测样本8的检测结果见图1中F。结果表明，只有固定阳性对照品的反应孔#7得到的扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，其它反应孔得到的扩增曲线均为水平的直线。

以上结果表明，本发明提供的六个引物组分别对其靶标病毒具有很高的特异性。

实施例3、灵敏度

一、检测甲型H1N1流感病毒的灵敏度

A、试剂盒检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、固定引物

(1)取微流控芯片，在反应孔#1至反应孔#7中每孔加入2μL实施例1步骤二中制备的引物组Ⅰ混合溶液，在反应孔#8中加入2μL RNase-free水。

(2)完成步骤(1)后，将所述微流控芯片置于洁净超净台内晾干，用密封层封装，得到已固定引物组Ⅰ的微流控芯片。

2、甲型H1N1流感病毒的总RNA的获得

参考Magnetic Viral DNA/RNA Kit的操作步骤，提取甲型H1N1流感病毒的总RNA，命名为RNA1-1。RNA1-1中RNA的浓度为5ng/μL。

吸取1mL RNA1-1加入盛有9mL无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到RNA1-2；以此类推制成RNA1-3、RNA1-4、RNA1-5、RNA1-6和RNA1-7。使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的RNA浓度，分别为0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL、0.5pg/μL、50fg/μL和5fg/μL。

3、制备混合体系

混合体系为70μL，由22.5μL LAMP扩增缓冲液、3μL反转录酶(浓度为10U/μL)、3μL Bst DNA聚合酶(浓度为8U/μL)、3μL羟基萘酚蓝水溶液(浓度为50pmol/μL)和38.5μL RNase-free水组成。

4、检测

(1)取已固定引物组Ⅰ的微流控芯片，在反应孔中加入2μL RNA1-1，反应孔#2中加入2μL RNA1-2，反应孔#3中加入2μL RNA1-3，反应孔#4中加入2μL RNA1-4，反应孔#5中加入2μL RNA1-5，反应孔#6中加入2μL RNA1-6，反应孔#7中加入2μL RNA1-7，反应孔#8中加入2μL RNase-free水，然后将微流控芯片置于洁净超净台内晾干，用密封层封装。

(2)完成步骤(1)后，将步骤3制备的混合体系注射入进样孔中，通过进样通道流通到各个反应孔中，然后用密封层将整个芯片密封，并确保无气泡存在。

(3)完成步骤(2)后，进行环介导等温扩增。反应条件：65℃恒温60min；80℃恒温5min，终止反应。反应过程中，采用实时检测仪检测信号强度。如果在60min内出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应RNA含量可以被检测出来。如果在60min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应RNA含量不能被检测出来。

实验结果见图2中A。结果表明，采用试剂盒检测甲型H1N1流感病毒的灵敏度为100fg/反应体系。

B、普通PCR检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、以5μL cDNA1-1(将步骤A中2制备的RNA1-1进行反转录得到)为模板，采用引物对1(由F1：5’-AAATCTAGTGGTACCGAGATATGCA-3’和B1：5’-GGGAGGCTGGTGTTTATAGCAC-3’组成)进行PCR，得到PCR扩增产物。

按照上述方法，将RNA1-1分别替换为步骤A中2制备的RNA1-2、RNA1-3、RNA1-4、RNA1-5、RNA1-6、RNA1-7和无菌超纯水，其它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。

2、结果观察和判定：如果PCR扩增产物含有234bp的DNA片段、则含有或疑似含有甲型H1N1流感病毒；如果PCR扩增产物不含有234bp的DNA片段、则不含有或疑似不含有甲型H1N1流感病毒。

实验结果见图2中B(M为DNA Marker，1为cDNA1-1，2为cDNA1-2，3为cDNA1-3，4为cDNA1-4，5为cDNA1-5，6为cDNA1-6，7为cDNA1-7，8为无菌超纯水)：以cDNA1-1、cDNA1-2、cDNA1-3或cDNA1-4为模板获得的PCR扩增产物中含有234bp的DNA片段，以cDNA1-5、cDNA1-6、cDNA1-7或无菌超纯水为模板获得的PCR扩增产物中不含有234bp的DNA片段。结果表明，采用普通PCR检测甲型H1N1流感病毒的灵敏度为10pg/反应体系。

因此，采用本发明提供的试剂盒检测甲型H1N1流感病毒的灵敏度是普通PCR检测的100倍。

二、检测甲型H3N2流感病毒的灵敏度

A、试剂盒检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、固定引物

按照步骤一A中1的方法，将引物组Ⅰ混合溶液替换为引物组Ⅱ混合溶液，其它步骤均不变，得到已固定引物组Ⅱ的微流控芯片。

2、甲型H3N2流感病毒的总RNA的获得

按照步骤一A中2的方法，将甲型H1N1流感病毒替换为甲型H3N2流感病毒，其它步骤均不变，得到RNA2-1至RNA2-7，RNA浓度依次为5ng/μL、0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL、0.5pg/μL、50fg/μL和5fg/μL。

3、配置混合体系

同步骤一A中3。

4、检测

按照步骤一A中4的方法，将已固定引物组Ⅰ的微流控芯片替换为已固定引物组Ⅱ的微流控芯片，RNA1-1替换为RNA2-1，RNA1-2替换为RNA2-2，RNA1-3替换为RNA2-3，RNA1-4替换为RNA2-4，RNA1-5替换为RNA2-5，RNA1-6替换为RNA2-6，RNA1-7替换为RNA2-7，其它步骤均不变，进行环介导等温扩增。

实验结果见图3中A。结果表明，采用试剂盒检测甲型H3N2流感病毒的灵敏度为100fg/反应体系。

B、普通PCR检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、以5μL cDNA2-1(将步骤A中2制备的RNA2-1进行反转录得到)为模板，采用引物对2(由F2：5’-ATCAGGGAGAGTCACAGTCTC-3’和B2：5’-ATGCTTCCATTTGGAGTGATGC-3’组成)进行PCR，得到PCR扩增产物。

按照上述方法，将RNA2-1分别替换为步骤A中2制备的RNA2-2、RNA2-3、RNA2-4、RNA2-5、RNA2-6、RNA2-7和无菌超纯水，其它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。

2、结果观察和判定：如果PCR扩增产物含有269bp的DNA片段、则含有或疑似含有甲型H3N2流感病毒；如果PCR扩增产物不含有269bp的DNA片段、则不含有或疑似不含有甲型H3N2流感病毒。

实验结果见图3中B(M为DNA Marker，1为cDNA2-1，2为cDNA2-2，3为cDNA2-3，4为cDNA2-4，5为cDNA2-5，6为cDNA2-6，7为cDNA2-7，8为无菌超纯水)：以cDNA2-1、cDNA2-2、cDNA2-3或cDNA2-4为模板获得的PCR扩增产物中含有269bp的DNA片段，以cDNA2-5、cDNA2-6、cDNA2-7或无菌超纯水为模板获得的PCR扩增产物中不含有269bp的DNA片段。结果表明，采用普通PCR检测甲型H3N2流感病毒的灵敏度为10pg/反应体系。

因此，采用本发明提供的试剂盒检测甲型H3N2流感病毒的灵敏度是普通PCR检测的100倍。

三、检测H5N1禽流感病毒的灵敏度

A、试剂盒检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、固定引物

按照步骤一A中1的方法，将引物组Ⅰ混合溶液替换为引物组Ⅲ混合溶液，其它步骤均不变，得到已固定引物组Ⅲ的微流控芯片。

2、H5N1禽流感病毒的总RNA的获得

按照步骤一A中2的方法，将甲型H1N1流感病毒替换为H5N1禽流感病毒，其它步骤均不变，得到RNA3-1至RNA3-7，RNA浓度依次为0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL、0.5pg/μL、50fg/μL、5fg/μL和0.5fg/μL。

3、配置混合体系

同步骤一A中3。

4、检测

按照步骤一A中4的方法，将已固定引物组Ⅰ的微流控芯片替换为已固定引物组Ⅲ的微流控芯片，RNA1-1替换为RNA3-1，RNA1-2替换为RNA3-2，RNA1-3替换为RNA3-3，RNA1-4替换为RNA3-4，RNA1-5替换为RNA3-5，RNA1-6替换为RNA3-6，RNA1-7替换为RNA3-7，其它步骤均不变，进行环介导等温扩增。

实验结果见图4中A。结果表明，采用试剂盒检测H5N1禽流感病毒的灵敏度为10fg/反应体系。

B、普通PCR检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、以5μL cDNA3-1(将步骤A中2制备的RNA3-1进行反转录得到)为模板，采用引物对3(由F3：5’-GGAGTTCTTCTGGACAA-3’和B3：5’-GTCGCAAGGACTAATCT-3’组成)进行PCR，得到PCR扩增产物。

按照上述方法，将RNA3-1分别替换为步骤A中2制备的RNA3-2、RNA3-3、RNA3-4、RNA3-5、RNA3-6、RNA3-7和无菌超纯水，其它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。

2、结果观察和判定：如果PCR扩增产物含有266bp的DNA片段、则含有或疑似含有H5N1禽流感病毒；如果PCR扩增产物不含有266bp的DNA片段、则不含有或疑似不含有H5N1禽流感病毒。

实验结果见图4中B(M为DNA Marker，1为cDNA3-1，2为cDNA3-2，3为cDNA3-3，4为cDNA3-4，5为cDNA3-5，6为cDNA3-6，7为cDNA3-7，8为无菌超纯水)：以cDNA3-1、cDNA3-2、cDNA3-3、cDNA3-4或cDNA3-5为模板获得的PCR扩增产物中含有266bp的DNA片段，以cDNA3-6、cDNA3-7或无菌超纯水为模板获得的PCR扩增产物中不含有266bp的DNA片段。结果表明，采用普通PCR检测H5N1禽流感病毒的灵敏度为100fg/反应体系。

因此，采用本发明提供的试剂盒检测H5N1禽流感病毒的灵敏度是普通PCR检测的10倍。

四、检测H7N9禽流感病毒的灵敏度

A、试剂盒检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、固定引物

按照步骤一A中1的方法，将引物组Ⅰ混合溶液替换为引物组Ⅳ混合溶液，其它步骤均不变，得到已固定引物组Ⅳ的微流控芯片。

2、H7N9禽流感病毒的总RNA的获得

按照步骤一A中2的方法，将甲型H1N1流感病毒替换为H7N9禽流感病毒，其它步骤均不变，得到RNA4-1至RNA4-7，RNA浓度依次为0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL、0.5pg/μL、50fg/μL、5fg/μL和0.5fg/μL。

3、配置混合体系

同步骤一A中3。

4、检测

按照步骤一A中4的方法，将已固定引物组Ⅰ的微流控芯片替换为已固定引物组Ⅳ的微流控芯片，RNA1-1替换为RNA4-1，RNA1-2替换为RNA4-2，RNA1-3替换为RNA4-3，RNA1-4替换为RNA4-4，RNA1-5替换为RNA4-5，RNA1-6替换为RNA4-6，RNA1-7替换为RNA4-7，其它步骤均不变，进行环介导等温扩增。

实验结果见图5中A。结果表明，采用试剂盒检测H7N9禽流感病毒的灵敏度为10fg/反应体系。

B、普通PCR检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、以5μL cDNA4-1(将步骤A中2制备的RNA4-1进行反转录得到)为模板，采用引物对4(由F4：5’-TTCCTGAGATTCCAAA-3’和B4：5’-GGTTGGTTTTTTCTATAAGCCG-3’组成)进行PCR，得到PCR扩增产物。

按照上述方法，将RNA4-1分别替换为步骤A中2制备的RNA4-2、RNA4-3、RNA4-4、RNA4-5、RNA4-6、RNA4-7和无菌超纯水，其它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。

2、结果观察和判定：如果PCR扩增产物含有203bp的DNA片段、则含有或疑似含有H7N9禽流感病毒；如果PCR扩增产物不含有203bp的DNA片段、则不含有或疑似不含有H7N9禽流感病毒。

实验结果见图5中B(M为DNA Marker，1为cDNA4-1，2为cDNA4-2，3为cDNA4-3，4为cDNA4-4，5为cDNA4-5，6为cDNA4-6，7为cDNA4-7，8为无菌超纯水)：以cDNA4-1、cDNA4-2、cDNA4-3或cDNA4-4为模板获得的PCR扩增产物中含有203bp的DNA片段，以cDNA4-5、cDNA4-6、cDNA4-7或无菌超纯水为模板获得的PCR扩增产物中不含有203bp的DNA片段。结果表明，采用普通PCR检测H7N9禽流感病毒的灵敏度为1pg/反应体系。

因此，采用本发明提供的试剂盒检测H7N9禽流感病毒的灵敏度是普通PCR检测的100倍。

五、检测乙型流感病毒的灵敏度

A、试剂盒检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、固定引物

按照步骤一A中1的方法，将引物组Ⅰ混合溶液替换为引物组Ⅴ混合溶液，其它步骤均不变，得到已固定引物组Ⅴ的微流控芯片。

2、乙型流感病毒的总RNA的获得

按照步骤一A中2的方法，将甲型H1N1流感病毒替换为乙型流感病毒，其它步骤均不变，得到RNA5-1至RNA5-7，RNA浓度依次为5ng/μL、0.5ng/μL、50pg/μL、5pg/μL、0.5pg/μL、50fg/μL和5fg/μL。

3、配置混合体系

同步骤一A中3。

4、检测

按照步骤一A中4的方法，将已固定引物组Ⅰ的微流控芯片替换为已固定引物组Ⅴ的微流控芯片，RNA1-1替换为RNA5-1，RNA1-2替换为RNA5-2，RNA1-3替换为RNA5-3，RNA1-4替换为RNA5-4，RNA1-5替换为RNA5-5，RNA1-6替换为RNA5-6，RNA1-7替换为RNA5-7，其它步骤均不变，进行环介导等温扩增。

实验结果见图6中A。结果表明，采用试剂盒检测乙型流感病毒的灵敏度为100fg/反应体系。

B、普通PCR检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、以5μL cDNA5-1(将步骤A中2制备的RNA5-1进行反转录得到)为模板，采用引物对5(由F5：5’-GGGACATGAACAACAAAGATGC-3’和B5：5’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’组成)进行PCR，得到PCR扩增产物。

按照上述方法，将RNA5-1分别替换为步骤A中2制备的RNA5-2、RNA5-3、RNA5-4、RNA5-5、RNA5-6、RNA5-7和无菌超纯水，其它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。

2、结果观察和判定：如果PCR扩增产物含有503bp的DNA片段、则含有或疑似含有乙型流感病毒；如果PCR扩增产物不含有503bp的DNA片段、则不含有或疑似不含有乙型流感病毒。

实验结果见图6中B(M为DNA Marker，1为cDNA5-1，2为cDNA5-2，3为cDNA5-3，4为cDNA5-4，5为cDNA5-5，6为cDNA5-6，7为cDNA5-7，8为无菌超纯水)：以cDNA5-1、cDNA5-2、cDNA5-3、cDNA5-4或cDNA5-5为模板获得的PCR扩增产物中含有503bp的DNA片段，以cDNA5-6、cDNA5-7或无菌超纯水为模板获得的PCR扩增产物中不含有503bp的DNA片段。结果表明，采用普通PCR检测乙型流感病毒的灵敏度为1pg/反应体系。

因此，采用本发明提供的试剂盒检测乙型流感病毒的灵敏度是普通PCR检测的10倍。

六、检测人腺病毒3型的灵敏度

A、试剂盒检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、固定引物

按照步骤一A中1的方法，将引物组Ⅰ混合溶液替换为引物组Ⅵ混合溶液，其它步骤均不变，得到已固定引物组Ⅵ的微流控芯片。

2、人腺病毒3型的DNA的获得

参考Magnetic Viral DNA/RNA Kit的操作步骤，提取人腺病毒3型的DNA，命名为DNA6-1。DNA6-1中DNA的浓度为0.5ng/μL。

吸取1mL DNA1-1加入盛有9mL无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到DNA6-2；以此类推制成DNA6-3、DNA6-4、DNA6-5、DNA6-6和DNA6-7。使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的DNA浓度，分别为50pg/μL、5pg/μL、0.5pg/μL、50fg/μL、5fg/μL和0.5fg/μL。

3、配置混合体系

同步骤一A中3。

4、检测

按照步骤一A中4的方法，将已固定引物组Ⅰ的微流控芯片替换为已固定引物组Ⅵ的微流控芯片，RNA1-1替换为DNA6-1，RNA1-2替换为DNA6-2，RNA1-3替换为DNA6-3，RNA1-4替换为DNA6-4，RNA1-5替换为DNA6-5，RNA1-6替换为DNA6-6，RNA1-7替换为DNA6-7，其它步骤均不变，进行环介导等温扩增。

实验结果见图7中A。结果表明，采用试剂盒检测人腺病毒3型的灵敏度为10fg/反应体系。

B、普通PCR检测

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、以5μL步骤A中2制备的DNA6-1为模板，采用引物对6(由F6：5’-TTCCCCATGGCICAYAACAC-3’和B6：5’-CCCTGGTAKCCRATRTTGTA-3’组成)进行PCR，得到PCR扩增产物。

按照上述方法，将DNA6-1分别替换为步骤A中2制备的DNA6-2、DNA6-3、DNA6-4、DNA6-5、DNA6-6、DNA6-7和无菌超纯水，其它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。

2、结果观察和判定：如果PCR扩增产物含有482bp的DNA片段、则含有或疑似含有人腺病毒3型；如果PCR扩增产物不含有482bp的DNA片段、则不含有或疑似不含有人腺病毒3型。

实验结果见图7中B(M为DNA Marker，1为DNA6-1，2为DNA6-2，3为DNA6-3，4为DNA6-4，5为DNA6-5，6为DNA6-6，7为DNA6-7，8为无菌超纯水)：以DNA6-1、DNA6-2、DNA6-3或DNA6-4为模板获得的PCR扩增产物中含有482bp的DNA片段，以DNA6-5、DNA6-6、DNA6-7或无菌超纯水为模板获得的PCR扩增产物中不含有482bp的DNA片段。结果表明，采用普通PCR检测人腺病毒3型的灵敏度为1pg/反应体系。

因此，采用本发明提供的试剂盒检测人腺病毒3型的灵敏度是普通PCR检测的100倍。

实施例4、应用

待测样本为中国人民解放军307医院采集的108份鼻咽拭子(采集者均知情同意)。

一、试剂盒检测

各个待测样本分别进行如下步骤：

1、固定引物

(1)取微流控芯片，在反应孔#1中加入2μL引物组Ⅰ混合溶液，在反应孔#2中加入2μL引物组Ⅱ混合溶液，在反应孔#3中加入2μL引物组Ⅲ混合溶液，在反应孔#4中加入2μL引物组Ⅳ混合溶液，在反应孔#5中加入2μL引物组Ⅴ混合溶液，在反应孔#6中加入2μL引物组Ⅵ混合溶液，在反应孔#7中加入2μL内对照引物组混合溶液和2μL阪崎肠杆菌基因组DNA水溶液(含阪崎肠杆菌基因组DNA100ng)，在反应孔#8中加入2μL RNase-free水。

(2)完成步骤(1)后，将所述微流控芯片置于洁净超净台内晾干，用密封层封装，得到已固定引物的微流控芯片。

2、提取待测样本的RNA或DNA

参考Magnetic Viral DNA/RNA Kit的操作步骤，提取待测样本的RNA或DNA。

3、制备混合体系

混合体系为70μL，由22.5μL LAMP扩增缓冲液、3μL反转录酶(浓度为10U/μL)、3μL Bst DNA聚合酶(浓度为8U/μL)、3μL羟基萘酚蓝水溶液(浓度为50pmol/μL)、5μL模板(待测样本的RNA或DNA)和33.5μL RNase-free水组成。

4、检测

(1)取已固定引物的微流控芯片，将步骤3制备的混合体系注射入进样孔中，通过进样通道流通到各个反应孔中，然后用密封层将整个芯片密封，并确保无气泡存在。

(2)完成步骤(1)后，进行环介导等温扩增。反应条件：65℃恒温40min；80℃恒温5min，终止反应。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。

如果某反应孔在50min内出现阳性扩增曲线，表明待测样本感染了相应的靶标病毒。如果某反应孔在50min内没有出现阳性扩增曲线，表明待测样本没有感染相应的靶标病毒。

B、普通PCR检测

1、以5μL待测样本的DNA或待测样本的cDNA(将待测样本的RNA进行反转录得到)为模板，采用实施例3中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5或引物对6进行PCR，得到PCR扩增产物。

2、结果观察和判定：如果PCR扩增产物含有234bp的DNA片段、则含有或疑似含有甲型H1N1流感病毒；如果PCR扩增产物含有269bp的DNA片段、则含有或疑似含有甲型H3N2流感病毒；如果PCR扩增产物含有266bp的DNA片段、则含有或疑似含有H5N1禽流感病毒；如果PCR扩增产物含有203bp的DNA片段、则含有或疑似含有H7N9禽流感病毒；如果PCR扩增产物含有503bp的DNA片段、则含有或疑似含有乙型流感病毒；如果PCR扩增产物含有482bp的DNA片段、则含有或疑似含有人腺病毒。

部分实验结果见表1。结果表明，本发明提供的试剂盒和普通PCR检测的检测结果完全一致。因此，利用本发明提供的试剂盒检测6种呼吸道病毒，结果准确可靠。

表1

<110> 中国人民解放军疾病预防控制所

<120> 用于检测6种呼吸道病毒的LAMP引物组合及其应用

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aagctcagca aatcctaca 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

tccctcactt tgggtctt 18

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gactttgttg gtcagcacta gtagaaaagg gaaagaagtc ctcg 44

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

tctatcagaa tgcagatgca tatgttgcta tttccggctt gaa 43

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gatggtgaat gccccatagc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ttttgtgggg tcatcaagat acag 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

ctactgagct ggttcagaa 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

ggcataatcc ggcacatc 18

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

agagcatcta ttagtgtgca gttttctcaa taggtgaaat atgcgac 47

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

gagaccctca gtgtgatggc gtaacagttg ctgtaggct 39

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

ccatcaagga tctgatgagg act 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

gaaatgggac ctttttgttg aacg 24

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

gcaatcaacg actcaacaa 19

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

acagtcctct ttttcttctt ct 22

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

agttaatcgc ccccatcgga tgaaaagtga agtggaatat ggta 44

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

accatcggag aatgtcccaa atactctctc tttgaggact atttctg 47

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

tgacacctgg tgttgcagt 19

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

aaacaaatta gtccttgcga ctggg 25

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

tgagaggcga gaaggaag 18

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

gagccatttc atttctgca 19

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

gcctgattct ctgagaattt gccttgatgt ctgttatcct ggga 44

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

tgacaaggaa gcaatgggat tctcctgatc tcctacatgc a 41

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

cagagcttct tcattcacga att 23

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 24

acagtggaat aagaactaat ggagc 25

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 25

tgatctcaga gctgacact 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 26

gcagctatcc tgtctaagc 19

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 27

tagatgctcg tcttcactgt ttattataag ctcacaaata gaacttgc 48

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 28

aactaaagaa aatgctgggt cccgcatttg tgtttggttt cga 43

<210> 29

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 29

ccttcgttgg aaagcaagac t 21

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 30

tctgctgtag acataggaaa cgg 23

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 31

gtctactggt cgctccct 18

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 32

gaggatctgg ttctcaggga 20

<210> 33

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 33

acccaccact gggtagttgt tgcatgatgc aagacccagt ca 42

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gagcaagccg tgtactctca gccggttgaa gacgtgcgtg 40

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgtcttgtgg agcggaagg 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 36

agctccgaca ggccacttc 19