一种原料药连翘苷的质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中草药的检测方法，尤其涉及一种连翘苷药材的质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 感冒是一种常见病、多发病，临床可分为流行性感冒（即流感）和普通感冒两种， 其病因80%以上是由于上呼吸道病毒感染引起。普通感冒症状较轻，一般不会引起其他疾 病，且有自愈性；流感则容易引起病毒变异，并可能导致病毒性肺炎、病毒性心肌炎等疾病。 流感严重时，可致人昏迷、抽搐、甚至死亡，故流感对人体的危害较大。因此，对流感的治疗 亟待解决。
[0003] 中草药具有抑制流感病毒复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫功能、改善肺循 环、镇痛抗炎等综合功效，可使流感痊愈。因此，中药及天然药物在防治流感方面具有独特 的优势和广阔的发展前景。中药因具有广泛的药理作用，且毒副作用小，愈来愈引起国内外 药理学家、生物学家和化学家们的兴趣，成为研究热点。美国学者从150余种植物水或醇提 取物中，发现20余种植物含有显著抗流感病毒的物质。保加利亚学者发现红花老鹤草甲 醇提取物中多酚复合物可抑制流感病毒。俄罗斯学者从伞形科独活属植物果实挥发油中发 现有抗甲型和乙型流感病毒的有效成分。日本学者从黄芩的根和叶的黄酮类提取物中、从 日本五针松多酚类提取物中，以及从鱼腥草的蒸馏液中皆提取到流感病毒抑制物。但目前 这些物质皆尚处于未纯化状态。我国学者在80年代大规模普查中，筛选出一批对流感病 毒有明显抑制作用的中草药：如金银花、连翘、板蓝根、大青叶、黄芪、黄芩、柴胡、鱼腥草、 鹅不食草、葛根、防风等50余种。近年来我国学者用现代科技方法先后对其中一些中草药 进行了深入研究，发现许多中草药不仅对流感病毒的增殖有明显抑制作用，而且有些能促 进机体的免疫功能。但中药复方制剂，因创新性和市场竞争力弱，难以在世界医药市场流 通。中药中天然活性成分具有许多中药复方制剂所不具备的优点，天然活性成分的抗病毒 作用，已在抗病毒新药研究领域的中受到了高度重视。明确天然抗病毒成分的结构，研究其 结构与药理作用及机制的关联性，是抗病毒新药研发的重要趋势。因此，积极寻求防治流感 病毒的有效中药和天然药物制剂，阻止流行性感冒病情的传播和蔓延一直是当前卫生工作 的重要课题之一，这也正是我们注重这方面科研课题的主要原因。
[0004] 连翅[Forsythiasuspensa(Thunb. )Vahl]为木犀科连翅属落叶灌木植物，常以 果实入药。连翘主产于我国山西、河南、陕西、山东等地。连翘是中药中最常见的药材之一， 自1963年以来一直被中国药典收录。其性微寒，味苦，归肺、心、小肠经，具有清热解毒、 消肿散结、疏散风热等药理作用，用于风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑， 热淋涩痛等症。临床常用于急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结核、尿路感染等症，中医素有 "疮家圣药"之称。连翘中的化学成分主要包括萜类、苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类、天然醇 类、香豆素、挥发性成分和一些醇、酯、酸、醛、酮等化合物。其中木脂素类化合物连翘苷含量 较大且抗菌、抗病毒活性很强。连翘苷是双木脂素类化合物的葡萄糖苷，难溶于水，溶于乙 醇、甲醇等有机溶剂，是连翘药材的主要成分之一，中国药典2010年版中将连翘苷作为控 制连翘质量的重要指标，规定按干燥品计算，含连翘苷不得低于0.15%。有文献报道，连 翘属植物叶子与果实的成分有较好的一致性，连翘叶中的有效成分如连翘苷、连翘酯苷、齐 墩果酸等的含量高于果实；连翘叶在我国民间药用已有较长历史，在我国河北、陕西等地有 将连翘叶制成珠茶作为保健饮料饮用的习惯，认为连翘叶有清热等作用。李发荣等在对连 翘叶中苷类成分的提取工艺的研究中发现，连翘叶中连翘苷的含量是老翘的40倍左右，青 翘的3~4倍。大连富生天然药物开发有限公司根据现代医药学理论，采用以正交法确定 的最佳提取方案，对连翘叶中连翘苷进行提取，以特制工业柱层析分离和整合重结晶精制 工艺，制备出了纯度在90%以上的连翘苷。所以把连翘苷开发成为一种天然药物，用于甲型 和乙型流感病毒的预防和治疗，能更加符合目前广大流行性感冒和病毒性感冒患者临床治 疗的需要。
[0005] 为了保证连翘苷药物的质量和疗效，需要建立连翘苷原料药或制剂的质量标准， 本发明在大量的实验基础上，公开了一种连翘苷的质量检测方法，为质量控制提供依据。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种原料药连翘苷的 质量检测方法，方法主要用于连翘苷原料药及其制剂的质量控制，具有简便、稳定、重复性 好的特点，有利于提高检验效率，确保了连翘苷原料药和制剂的治疗效果。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种原料药连翘苷的质量检测方法，包 括1)鉴别连翘苷；2)测定连翘苷的含量和3)检测相关物质。
[0008] 其中，所述鉴别连翘苷包括如下顺序进行的步骤：
[0009] 1A)将精密称定的连翘苷标准品溶于无水甲醇中，配制成连翘苷对照品溶液；
[0010] 1B)将精密称定的原料药连翘苷溶于无水甲醇中，配制成连翘苷供试品溶液；
[0011] 1C)吸取连翘苷对照品溶液、连翘苷供试品溶液、无水甲醇，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇混合溶液为展开剂，展开后，晾干，再喷以显色剂，在l〇5°C加 热至斑点显色清晰，供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液主斑点的位置和 颜色相同，且与其它成分的斑点是否得到很好的分离；无水甲醇则在相应位置无斑点，其中 所述三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的体积之比为8. 5:1. 5 ;所述显色剂为质 量百分比浓度为10%硫酸乙醇溶液。
[0012] 特别是，步骤1A)中所述连翘苷对照品溶液的浓度为0.l_5mg/ml;步骤1B)中所 述连翘苷供试品溶液的浓度为〇.l_5mg/ml。
[0013] 其中，所述测定连翘苷含量包括如下顺序进行的步骤：
[0014] 2A)将精密称定的连翘苷标准品溶于质量百分比浓度为25%的乙腈水溶液，超 声溶解，配制成连翘苷对照品母液，然后用质量百分比浓度为25%的乙腈水溶液稀释成每 lml含连翘苷0. 1-0. 5mg的连翘苷对照品溶液；
[0015] 2B)将精密称定的原料药连翘苷溶于质量百分比浓度为25%的乙腈水溶液中，超 声溶解，配制成原料药连翘苷供试品母液，然后用质量百分比浓度为25 %的乙腈水溶液稀 释成每lml含原料药连翘苷0. 1-0. 5mg的原料药连翘苷供试品溶液；
[0016] 2C)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10-50μ1，注入液相色谱仪，测定 连翘苷峰面积，按照外标法计算，即得。
[0017] 特别是，步骤2A)中所述连翘苷对照品溶液的浓度为0. 2mg/ml;步骤2B)中所述 原料药连翘苷供试品溶液的浓度为0. 2mg/ml。
[0018] 尤其是，步骤2C)中精密吸取的对照品溶液、供试品溶液的体积分别为10μ1。
[0019] 特别是，步骤2C)中所述液相色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂（4. 6mmX250mm，0DS2, 5μm);乙腈（Α)-水⑶为流动相；梯度洗脱[Omin(25 % A) ^ 12min(25%A) ^ 15min(65%A) ^ 20min(65%A) ^ 25min(25%A) ^ 30min(25% A);流速为1.OmL/min;柱温30°C;检测波长为277nm;理论板数按连翘苷峰计算应不低于 4000 0
[0020] 其中，所述检测相关物质包括如下顺序进行的步骤：
[0021] 3A)将精密称定原料药连翘苷与质量百分比浓度为25 %乙腈水溶液混合后，超声 溶解，摇匀，制成每lml含原料药连翘苷l-5mg的原料药连翘苷供试品储备液；接着精密量 取供试品储备液适量，用质量百分比浓度为25%乙腈水溶液定量稀释，配制成每lml中含 原料药连翘苷20-100μg的原料药连翘苷溶液；
[0022] 3B)将精密称定的连翘脂素标准品加入到质量百分比浓度为25%的乙腈水溶液 中，超声溶解，配制成每lml含连翘脂素标准品50-250μg的连翘脂素对照品溶液；
[0023] 3C)精密量取连翘脂素对照品溶液10-50μ1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度， 使主成分连翘苷的色谱峰的峰高为满量程的10-30%，再精密量取连翘苷供试品储备液与 连翘苷溶液各10μ1，分别注入液相色谱仪。供试品储备液色谱中如果有与连翘脂素保留时 间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得大于8. 0% ;其他单个杂质峰面积，不得大于 连翘脂素对照品溶液中的主峰面积的1.0% ;其他各杂质峰面积的和不得大于连翘脂素对 照品溶液中的主峰面积2. 0% ;供试品储备液色谱图中任何小于连翘脂素对照品溶液主峰 面积0. 05倍的峰可忽略不计。
[0024] 特别是，步骤3Α)中所述原料药连翘苷溶液的浓度为20μg/ml;步骤3Β)中所述 连翘脂素对照品溶液的浓度为50μg/ml。
[0025] 尤其是，步骤3C)中所述液相色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 (4.6mmX250mm，5ym);乙腈（A)-水（B)为流动相；梯度洗脱[0min(12%A) - 5min(15% A) - 15min(20%A) - 30min(20%A) - 60min(25%A) - 70min(38%A) - 85min(38% A) - 90min(12%A) - 105min(12%A)];流速为LOml/min;柱温 30°C;检测波长为 277nm; 理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000,主峰及各杂质峰分离度不得低于1. 5。
[0026] 其中，所述原料药连翘苷按照如下步骤制备而成：
[0027]A)采用溶剂对连翘叶或连翘果实进行加热回流提取2~3次，每次2~4小时；B) 提取液浓缩后静置，析出沉淀，获得连翘苷沉淀；C)将连翘苷沉淀采用溶剂溶解后，静置， 析出结晶，获得连翘苷粗品；D)用溶剂对连翘苷粗品进行重结晶处理，即得原料药翘苷。
[0028]特别是，步骤A)、C)、D)中所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇或含水乙醇。
[0029] 特别是，所述含水甲醇的质量百分比浓度为70-95% ;所述含水乙醇的质量百分比 浓度为70-95%。
[0030] 其中，步骤B)中静置的温度为室温，优选为10-35°c，进一步优选为20-25°C;静置 时间为l_48h;步骤B)中提取液浓缩后的体积与原提取液的体积之比为0. 1-0. 5 :1。
[0031] 特别是，步骤D)中所述重结晶处理的温度为室温，优选为10-35°C，进一步优选为 20-25。。。
[0032] 特别是，所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤4)检测溶剂残留，所述溶 剂残留检测包括如下步骤：
[0033] 4A)将精密称取原料药连翘苷置于10ml顶空瓶中，精密量取水5. 0ml，加入顶空瓶 中，溶解，密封振摇，制成每lml含原料药连翘苷0.lmg的原料药连翘苷供试品溶液；
[0034] 4B)精密称取甲醇适量，加水溶解并稀释，制成每lml中含300μg甲醇溶液，然后 精密量取5ml密封作为甲醇对照品溶液；
[0035] 4C)分别精密量取原料药连翘苷供试品溶液、甲醇对照品溶液各1ml，顶空进样， 注入气相相色谱仪，测定，测定的色谱条件如下：
[0036] 气相色谱柱：用ZB-WAXplus石英毛细管柱；载气：氮气；升温程序：起始温度为 35°C，维持13分钟，以每分种30°C的速率升温至230°C，维持10分钟，进样口温度为250°C， 检测器温度为270°C，顶空瓶瓶口温度为80°C，平衡时间为10分钟。