一种帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的检测方 法，更具体涉及一种帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的反相液相色谱法分析检测方法。
【背景技术】
[0002] 非留体抗炎药（NSAIDs)作为一种镇痛药通常用来治疗急慢性疼痛，其作用机理 是通过抑制环氧合酶（C0X)而抑制前列腺素类合成与释放，产生镇痛效果。传统的非甾体 抗炎药（如萘普生、吲哚美辛、双氯芬酸、尼美舒利等）临床上已应用几十年，但长期使用副 作用较明显，会产生消化不良、腹痛等胃肠副作用，严重情况下导致胃穿孔、十二指肠溃疡 等疾病，近年来其应用受到限制。
[0003] 帕瑞昔布钠是一种新型的C0X-2特异性抑制剂。C0X-2是一种诱导酶，正常情况下 在机体大多数组织中无表达或者表达甚微，但当受到刺激后能迅速产生。研究表明，特异性 的C0X-2抑制剂比非选择性的环氧合酶抑制剂治疗效果更为确切，且副作用更少。在治疗 浓度时，帕瑞昔布钠能选择性的抑制C0X-2,抑制前列腺素（PG)的合成，从而发挥镇痛和抗 炎作用，而对C0X-1抑制作用并不明显，现已广泛用于临床上预防和治疗中重度疼痛和术 前镇痛。
[0004] 帕瑞昔布钠（英文名：ParecoxibSodium)，分子式为C19HlsN204S.Na，分子量为 392. 40,CAS登录号：198470-85-8。帕瑞昔布钠纯品为白色结晶性粉末，其熔点为273~ 275°C。其结构如下所示。
[0005]
[0006] 杂质研究是原料药质量研究中的关键内容。目前，中国药典及国外药典未收录 帕瑞昔布钠原料及制剂的有关物质或遗传毒性杂质的检测方法。在已公开的专利中， CN104749288A公开了 一种帕瑞昔布钠有关物质的液相色谱分析方法，控制了 4- (5-甲 基-3-苯基-4-异恶挫）苯磺酸钠等6个杂质，未检索到任何关于帕瑞昔布钠遗传毒性杂 质检测方法的专利。
[0007] 近年来，原料药质量控制越来越重视对遗传毒性（或称基因毒性）杂质的研究。遗 传毒性杂质很低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤 的发生。帕瑞昔布钠生产工艺的精制步骤可能会产生含有遗传毒性警示结构一一磺酸酯类 的杂质（见表1)，要求质量控制特别关注。
[0008] 由于帕瑞昔布钠常用作术后镇痛药，其治疗时段小于1个月，根据遗传毒性杂质 的限度控制规定，遗传毒性杂质的可接受摄入量为120μg/天。注射用帕瑞昔布钠的最大 日剂量为80mg，折算其遗传毒性杂质的控制限度为单一杂质（或总杂质）不超过1500ppm。
[0009] 表1帕瑞昔布钠遗传毒性杂质
[0010]
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种帕瑞昔布钠3种遗传毒性杂质的检测方法。
[0012] 本发明的再一个目的是提供一种帕瑞昔布钠3种遗传毒性杂质检测方法的应用。
[0013] 本发明目的主要通过以下技术方案实现：所述的检测方法采用反相液相色谱法， 检测对象、控制限度、样品的配制、色谱柱、流动相组成、柱温、流速、检测波长、进样量等描 述如下。
[0014] 本发明所述的检测对象为4-(5-甲基-3-苯基-4-异恶唑）苯磺酸甲酯、4-(5-甲 基-3-苯基-4-异恶唑）苯磺酸乙酯、4-(5-甲基-3-苯基-4-异恶唑）苯磺酸异丙酯。
[0015] 本发明所述的控制限度为每个遗传毒性杂质控制在100~2000ppm，优选 lOOOppm。
[0016] 本发明所述的样品配制用水、乙腈、甲醇、水：乙腈（50:50)溶解样品，优选甲醇溶 解配制；样品配制浓度〇· 5~4mg/ml，优选lmg/ml。
[0017] 本发明所述的色谱柱为C18柱、C8柱、苯基柱和Hilic柱，优选C18柱。
[0018] 本发明所述的流动相组成为水一乙腈、稀磷酸一乙腈、0. 01mol/L磷酸氢二钠一乙 腈、0·Olmol/L磷酸二氢钾一乙腈、0·Olmol/L磷酸二氢铵一乙腈，优选0·Olmol/L磷酸二氢 铵一乙腈；流动相配比为水相一有机相90:10~10:90。
[0019] 本发明所述的柱温为25~40 °C，优选35 °C。
[0020] 本发明所述的流动相流速为0. 2-2. 0ml/min，优选1. 0ml/min。
[0021] 本发明所述的检测器为紫外检测器或二极管阵列（PDA)检测器；
[0022] 本发明所述的检测波长为205~290nm，优选230nm。
[0023] 本发明所述的进样量为0. 1-40μ1，优选为20μ1。
[0024] 本发明提供的一种帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的检测方法，实现了帕瑞昔布钠与3 个遗传毒性杂质在较短时间内的分离，具有较高的灵敏度和专属性，操作简捷，达到主成分 与遗传毒性杂质、遗传毒性杂质之间的分离度均大于1. 5,可用于帕瑞昔布钠的质量控制， 具有实用价值。
【附图说明】
[0025] 图1是实施例7的液相色谱图；
[0026]图2是实施例11第一次进样的液相色谱图；
[0027] 图3是实施例12中遗传毒性杂质对照品混合物液相色谱图；
[0028] 图4是实施例12中样品测定液相色谱图；
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明 本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0030] 实施例1
[0031] 本发明帕瑞昔布钠遗传毒性杂质检测溶液的配制方法。
[0032] 本试验选择水、乙腈、甲醇、水：乙腈（1:1)溶解样品，样品在水中略溶，在乙腈中 微溶，在甲醇、水：乙腈（1:1)中易溶。由于色谱条件考察时需在帕瑞昔布钠样品中加入3 个遗传毒性杂质，杂质Α、杂质Β、杂质C的结构均为酯类物质，其易被水解，要求溶剂不宜含 水，因此优选甲醇为溶解样品的溶剂。
[0033] 本试验选择将帕瑞昔布钠样品配制成0. 5mg/ml~4mg/ml溶液进行考察，结果显 示0. 5mg/ml杂质响应较小，4mg/ml主峰不对称较严重，影响杂质的检出，优选lmg/ml作为 测试样品浓度。
[0034] 实施例2
[0035] 本发明帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的检测方法
[0036]1)仪器与检测条件
[0037] 仪器：WatersE2695高效液相色谱仪-紫外检测器；
[0038]色谱柱：C8 柱（4. 6X150mm, 5μm);
[0039] 流动相：水：乙腈（50:50);
[0040]柱温：25°C;流速：1.OmL/min;
[0041] 检测波长：230nm;进样量：10μ1〇
[0042] 2)溶液配制
[0043] 精密称取杂质A、杂质B、杂质C对照品适量，加甲醇使溶解并稀释成0. 5mg/ml的 溶液，作为杂质储备液；精密称取帕瑞昔布钠40mg至10ml容量瓶中，精密量取各杂质储备 液lml至该容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，作为色谱条件筛选溶液。
[0044] 3)测定方法及结果
[0045] 按1)色谱条件进样，运行20min，记录色谱图，考察主成分与各杂质、各杂质之间 的分离度。结果显示，各杂质与主成分之间分离度良好，主成分峰发生裂分。
[0046] 实施例3
[0047] 本发明帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的检测方法
[0048] 1)仪器与检测条件
[0049] 仪器：WatersE2695高效液相色谱仪-紫外检测器；
[0050]色谱柱：C8 柱（4. 6X150mm, 5μm);
[0051] 流动相：pH3. 0稀磷酸：乙腈（70:30);
[0052]柱温：30°C;流速：2mL/min;
[0053] 检测波长：290nm;进样量：40μ1。
[0054] 2)溶液配制
[0055] 精密称取杂质Α、杂质Β、杂质C对照品适量，加甲醇使溶解并稀释成0. 5mg/ml的 溶液，作为杂质储备液；精密称取帕瑞昔布钠l〇mg至10ml容量瓶中，精密量取各杂质储备 液lml至该容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，作为色谱条件筛选溶液。
[0056] 3)测定方法及结果
[0057] 按1)色谱条件进样，运行20min，记录色谱图，考察主成分与各杂质、各杂质之间 的分离度。结果显示，各成分之间分离度良好，各成分峰形良好。
[0058] 实施例4
[0059] 本发明帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的检测方法
[0060] 1)仪器与检测条件
[0061] 仪器：WatersE2695高效液相色谱仪-紫外检测器；
[0062]色谱柱：C18 柱（4. 6X250mm, 5μm);
[0063] 流动相：0·Olmol/L磷酸二氢铵（磷酸调至ρΗ3·0):乙腈（10:90);
[0064]柱温：35°C;流速：0·8mL/min;
[0065] 检测波长：230nm;进样量：20μ1。
[0066] 2)溶液配制
[0067] 精密称取杂质Α、杂质Β、杂质C对照品适量，加甲醇使溶解并稀释成0. 5mg/ml的 溶液，作为杂质储备液；精密称取帕瑞昔布钠20mg至10ml容量瓶中，精密量取各杂质储备 液lml至该容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，作为色谱条件筛选溶液。
[0068] 3)测定方法及结果
[0069]按1)色谱条件进样，运行20min，记录色谱图，考察主成分与各杂质、各杂质之间 的分离度。结果显示，谱图基线平稳，杂质在5min以内全部出峰完毕，各成分之间未达到基 线分离。
[0070]实施例5
[0071] 本发明帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的检测方法
[0072] 1)仪器与检测条件
[0073]仪器：WatersUPLC-PDA检测器；
[0074]色谱柱：苯基柱（2. 1X50mm, 1. 7μm);
[0075] 流动相：0·01mol/L磷酸二氢钠（磷酸调至ρΗ3·0):乙腈（40:60);
[0076]柱温：35°C;流速：0·2mL/min;
[0077] 检测波长：205nm;进样量：0· 1μ1。
[0078] 2)溶液配制
[0079] 精密称取杂质Α、杂质Β、杂质C对照品适量，加甲醇使溶解并稀释成0.lmg/ml的 溶液，作为杂质储备液；精密称取帕瑞昔布钠5mg至10ml容量瓶中，精密量取各杂质储备液 lml至该容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，作为色谱条件筛选溶液。
[0080] 3)测定方法及结果
[0081] 按1)色谱条件进样，运行20min，记录色谱图，考察主成分与各杂质、各杂质之间 的分离度。结果显示，谱图基线平稳，杂质在5min以内全部出峰完毕，各成分之间分离度良 好，各成分峰形良好，已知杂质与未知杂质间分离度1. 35 (未达到1. 5)。
[0082]实施例6
[0083] 本发明帕瑞昔布钠遗传毒性杂质的检测方法
[0084] 1)仪器与检测条件
[0085]仪器：WatersUPLC-PDA检测器；
[0086]色谱柱Hilie柱（2·IX50mm, 1.7μm);
[0087] 流动相：0·Olmol/L磷酸二氢钠（磷酸调至ρΗ3· 0):乙腈（90:10);
[0088]柱温：4(TC;流速：0·3mL/min;
[0089] 检测波长：230nm;进样量：0· 5μ1〇
[0090] 2)溶液配制
[0091] 精密称取杂质Α、杂质Β、杂质C对照品适量，加甲醇使溶解并稀释成0.lmg/ml的 溶液，作为杂质储备液；精密称取帕瑞昔布钠5mg至10ml容量瓶中，精密量取各杂质储备液 lml至该容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，作为色谱条件筛选溶液。
[0092] 3)测定方法及结果
[0093] 按