本发明涉及医药领域，特别是涉及一种枸杞叶低聚糖及酸性多糖的制备方法及应用。
背景技术：
枸杞叶为燕科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥叶，俗称天精草，《本草纲目》称其有“除烦益志补五劳七伤，壮心气，除热毒,散疮肿，除风明目”的功效，目前研究表明其主要含有黄酮类化合物、生物碱、多糖、氨基酸、微量元素、维生素、萜类等化合物，对其药理作用的研究主要集中在降血糖、降血脂、耐缺氧、抗氧化、降血压、抗疲劳、耐低温、延缓衰老、抗肿瘤等作用，其抗肿瘤作用主要为枸杞叶总黄酮对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响，而对枸杞叶中的酸性多糖研究较少，尤其对其中的枸杞叶低聚糖未见公开报道，并且如何解决一体化制备枸杞叶低聚糖及酸性多糖也未见公开报道。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种枸杞叶低聚糖及酸性多糖的制备方法，可有效解决枸杞叶低聚糖及酸性多糖的制备问题及枸杞叶低聚糖在制备具有抗菌作用的药物或保健品中的应用和枸杞叶酸性多糖Ⅰ及枸杞叶酸性多糖Ⅱ在制备抗肿瘤的药物中的应用的问题。
本发明解决的技术方案是，一种枸杞叶低聚糖及酸性多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）取枸杞叶，加8-15倍量的冷水浸泡2分钟，过滤，药渣50℃干燥，粉碎成粉体粒径D90值为11.5μm-38.6μm的超微粉A，加超微粉A重量8.5倍的乙醚浸泡2h-7h，过滤，药渣挥尽乙醚，加超微粉A重量8倍量的无水乙醇浸泡0.5h-2.5h，76℃回流提取1.1h-2.5h，过滤，药渣挥尽乙醇加超微粉A 重量8-15倍量的体积浓度为71%-82%乙醇，80℃回流提取3h，过滤，药渣挥尽溶剂作为药渣B备用，滤液减压回收溶剂，45℃减压浓缩成比重为1.10-1.18的浸膏，依次通过活性炭柱、AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液减压浓缩成比重为1.10-1.15的浸膏，冷冻干燥得枸杞叶低聚糖；
（2）取步骤（1）中的药渣B，加超微粉A重量10-18倍量的0.1mol/L的NaOH溶液，静置4h，85℃回流提取3h，过滤，滤液减压回收溶剂至比重为1.08-1.13的浸膏，加7mol/L的HCl溶液调节pH至3.5，5000r/min离心30min，上清液加乙醇至含醇量为30%（v/v），6000r/min离心16min，得上清液C备用，下层沉淀挥尽乙醇，用沉淀3倍重量的蒸馏水分3次洗涤沉淀，再加沉淀10-15倍重量的0.01mol/L的NaOH溶液使溶解，加1mol/L的HCl溶液调节pH至7.3，6000r/min离心25min，分取上层清液加乙醇使含醇量达到35%（v/v），2℃-4℃静置12h，过滤，沉淀冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ；取上清液C，加乙醇使含醇量达到80%（v/v），4℃静置12h，过滤，沉淀以超微粉A重量的蒸馏水分3次洗涤，冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-300型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-200凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅰ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-600型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-100凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅱ；本发明实现了枸杞叶为原料制备枸杞叶低聚糖及枸杞叶酸性多糖Ⅰ和酸性多糖Ⅱ，并将枸杞叶低聚糖有效用于制备抗菌药物或保健品中的应用，将枸杞叶酸性多糖Ⅰ和酸性多糖Ⅱ有效用于制备抗肿瘤的药物中的应用。
本发明制备方法简单，所用原料绿色环保，应用效果好，以枸杞叶为原料同时制备枸杞叶低聚糖及酸性多糖Ⅰ和酸性多糖Ⅱ，开发了枸杞叶的应用范围，枸杞叶低聚糖可用于制备抗菌药物或保健品，枸杞叶酸性多糖Ⅰ和酸性多糖Ⅱ可用于制备抗肿瘤的药物，开拓了枸杞叶低聚糖及酸性多糖的应用价值，具有较好的经济效益和社会效益，是中药上的巨大创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体情况作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出：
实施例1
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
（1）取枸杞叶，加8倍量的冷水浸泡2分钟，过滤，药渣50℃干燥，粉碎成粉体粒径D90值为11.5μm-38.6μm的超微粉A，加超微粉A重量8.5倍的乙醚浸泡2h，过滤，药渣挥尽乙醚，加超微粉A重量8倍量的无水乙醇浸泡0.5h，76℃回流提取1.1h，过滤，药渣挥尽乙醇加超微粉A 重量8倍量的体积浓度为71%乙醇，80℃回流提取3h，过滤，药渣挥尽溶剂作为药渣B备用，滤液减压回收溶剂，45℃减压浓缩成比重为1.10的浸膏，依次通过活性炭柱、AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液减压浓缩成比重为1.10的浸膏，冷冻干燥得枸杞叶低聚糖；
（2）取步骤（1）中的药渣B，加超微粉A重量10倍量的0.1mol/L的NaOH溶液，静置4h，85℃回流提取3h，过滤，滤液减压回收溶剂至比重为1.08的浸膏，加7mol/L的HCl溶液调节pH至3.5，5000r/min离心30min，上清液加乙醇至含醇量为30%（v/v），6000r/min离心16min，得上清液C备用，下层沉淀挥尽乙醇，用沉淀3倍重量的蒸馏水分3次洗涤沉淀，再加沉淀10倍重量的0.01mol/L的NaOH溶液使溶解，加1mol/L的HCl溶液调节pH至7.3，6000r/min离心25min，分取上层清液加乙醇使含醇量达到35%（v/v），2℃-4℃静置12h，过滤，沉淀冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ；取上清液C，加乙醇使含醇量达到80%（v/v），4℃静置12h，过滤，沉淀以超微粉A重量的蒸馏水分3次洗涤，冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-300型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-200凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅰ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-600型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-100凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅱ。
实施例2
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
（1）取枸杞叶，加15倍量的冷水浸泡2分钟，过滤，药渣50℃干燥，粉碎成粉体粒径D90值为11.5μm-38.6μm的超微粉A，加超微粉A重量8.5倍的乙醚浸泡7h，过滤，药渣挥尽乙醚，加超微粉A重量8倍量的无水乙醇浸泡2.5h，76℃回流提取2.5h，过滤，药渣挥尽乙醇加超微粉A 重量15倍量的体积浓度为82%乙醇，80℃回流提取3h，过滤，药渣挥尽溶剂作为药渣B备用，滤液减压回收溶剂，45℃减压浓缩成比重为1.18的浸膏，依次通过活性炭柱、AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液减压浓缩成比重为1.15的浸膏，冷冻干燥得枸杞叶低聚糖；
（2）取步骤（1）中的药渣B，加超微粉A重量18倍量的0.1mol/L的NaOH溶液，静置4h，85℃回流提取3h，过滤，滤液减压回收溶剂至比重为1.13的浸膏，加7mol/L的HCl溶液调节pH至3.5，5000r/min离心30min，上清液加乙醇至含醇量为30%（v/v），6000r/min离心16min，得上清液C备用，下层沉淀挥尽乙醇，用沉淀3倍重量的蒸馏水分3次洗涤沉淀，再加沉淀15倍重量的0.01mol/L的NaOH溶液使溶解，加1mol/L的HCl溶液调节pH至7.3，6000r/min离心25min，分取上层清液加乙醇使含醇量达到35%（v/v），2℃-4℃静置12h，过滤，沉淀冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ；取上清液C，加乙醇使含醇量达到80%（v/v），4℃静置12h，过滤，沉淀以超微粉A重量的蒸馏水分3次洗涤，冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-300型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-200凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅰ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-600型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-100凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅱ。
实施例3
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
（1）取枸杞叶，加11倍量的冷水浸泡2分钟，过滤，药渣50℃干燥，粉碎成粉体粒径D90值为11.5μm-38.6μm的超微粉A，加超微粉A重量8.5倍的乙醚浸泡4h，过滤，药渣挥尽乙醚，加超微粉A重量8倍量的无水乙醇浸泡1.5h，76℃回流提取2.1h，过滤，药渣挥尽乙醇加超微粉A 重量11倍量的体积浓度为75%乙醇，80℃回流提取3h，过滤，药渣挥尽溶剂作为药渣B备用，滤液减压回收溶剂，45℃减压浓缩成比重为1.14的浸膏，依次通过活性炭柱、AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液减压浓缩成比重为1.12的浸膏，冷冻干燥得枸杞叶低聚糖；
（2）取步骤（1）中的药渣B，加超微粉A重量14倍量的0.1mol/L的NaOH溶液，静置4h，85℃回流提取3h，过滤，滤液减压回收溶剂至比重为1.11的浸膏，加7mol/L的HCl溶液调节pH至3.5，5000r/min离心30min，上清液加乙醇至含醇量为30%（v/v），6000r/min离心16min，得上清液C备用，下层沉淀挥尽乙醇，用沉淀3倍重量的蒸馏水分3次洗涤沉淀，再加沉淀13倍重量的0.01mol/L的NaOH溶液使溶解，加1mol/L的HCl溶液调节pH至7.3，6000r/min离心25min，分取上层清液加乙醇使含醇量达到35%（v/v），2℃-4℃静置12h，过滤，沉淀冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ；取上清液C，加乙醇使含醇量达到80%（v/v），4℃静置12h，过滤，沉淀以超微粉A重量的蒸馏水分3次洗涤，冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-300型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-200凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅰ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-600型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-100凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅱ。
实施例4
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
（1）取枸杞叶，加8倍量的冷水浸泡2分钟，过滤，药渣50℃干燥，粉碎成粉体粒径D90值为11.5μm-38.6μm的超微粉A，加超微粉A重量8.5倍的乙醚浸泡7h，过滤，药渣挥尽乙醚，加超微粉A重量8倍量的无水乙醇浸泡1.5h，76℃回流提取2.5h，过滤，药渣挥尽乙醇加超微粉A 重量8倍量的体积浓度为71%乙醇，80℃回流提取3h，过滤，药渣挥尽溶剂作为药渣B备用，滤液减压回收溶剂，45℃减压浓缩成比重为1.14的浸膏，依次通过活性炭柱、AB-8型大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液减压浓缩成比重为1.10的浸膏，冷冻干燥得枸杞叶低聚糖；
（2）取步骤（1）中的药渣B，加超微粉A重量10倍量的0.1mol/L的NaOH溶液，静置4h，85℃回流提取3h，过滤，滤液减压回收溶剂至比重为1.13的浸膏，加7mol/L的HCl溶液调节pH至3.5，5000r/min离心30min，上清液加乙醇至含醇量为30%（v/v），6000r/min离心16min，得上清液C备用，下层沉淀挥尽乙醇，用沉淀3倍重量的蒸馏水分3次洗涤沉淀，再加沉淀13倍重量的0.01mol/L的NaOH溶液使溶解，加1mol/L的HCl溶液调节pH至7.3，6000r/min离心25min，分取上层清液加乙醇使含醇量达到35%（v/v），2℃-4℃静置12h，过滤，沉淀冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ；取上清液C，加乙醇使含醇量达到80%（v/v），4℃静置12h，过滤，沉淀以超微粉A重量的蒸馏水分3次洗涤，冷冻干燥得枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅰ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-300型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-200凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅰ；取枸杞叶酸性粗多糖Ⅱ加10倍重量蒸馏水使溶解，三氯乙酸法脱蛋白，再依次通过HPD-600型大孔吸附树脂柱、Sephadex G-100凝胶树脂柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液冷冻干燥得枸杞叶酸性多糖Ⅱ。
上述制备的枸杞叶低聚糖经蒽酮-硫酸法（常规测定方法，是公知技术）测定，其糖含量均不低于85%，枸杞叶酸性多糖Ⅰ和枸杞叶酸性多糖Ⅱ经硫酸咔唑法（公知技术）测定其酸性多糖含量均不低于81%；经HPGPC法（公知技术）测定，枸杞叶低聚糖的分子量均在300-2000之间，枸杞叶酸性多糖Ⅰ的分子量在50000-65000之间， 枸杞叶酸性多糖Ⅱ的分子量在28000-39000之间。
上述仅是给出的几个实施例，在研制中，发明人经反复多次实验，均取得了相同或相似的结果，方法有效可行，原料丰富，具有较好的实际应用价值，并对枸杞叶低聚糖及酸性多糖Ⅰ和酸性多糖Ⅱ进行了反复的试验，均取得了满意的技术效果，有关试验资料如下：
枸杞叶低聚糖的抗菌活性实验
一．实验材料
细胞和实验用菌种：实验用菌株肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurues) 和大肠杆菌（Escherichia coli）均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；枸杞叶低聚糖（含量91.3%）；其他均为国产试剂。
二．实验方法
1．菌悬液的制备
将肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、和大肠杆菌（Escherichia coli）菌种接种于含无菌牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿中, 37 °C孵育培养24 h; 然后取该增菌培养物, 再接种于牛肉膏蛋白胨培养基中, 37 °C孵箱培养6 h。抽取一定量培养物用无菌生理盐水调配成含菌量约为107 cfu/mL的菌悬液,用显微镜进行菌落计数。
2．抑菌实验
用纸片扩散法测定提取物对肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaurues)和大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌活性。细菌培养采用灭菌牛肉膏蛋白胨培养基和营养琼脂培养基。将枸杞叶低聚糖样品按浓度分为6组（0μg、50μg、150μg、250μg、350μg、450μg），用蒸馏水溶解, 将每组样品分别注射到直径为5mm圆形滤纸上，等溶剂挥发完, 将滤纸放入已接种好菌种的培养皿中进行培养, 10h后观察抑菌圈情况, 根据是否有抑菌圈及抑菌圈大小来判断提取物抑菌活性。试验重复3次。
抑菌试验结果显示，在没有加枸杞叶低聚糖时，三组均无抑菌圈；枸杞叶低聚糖对3种细菌均有一定的抑制作用。其中，对金黄色葡萄球菌的抑制性最强，当枸杞叶低聚糖250μg时已经显示出较强的抑菌性，且随着枸杞叶低聚糖浓度增加抑菌性增强；同样对肺炎链球菌和大肠杆菌有较强的抑制性，而且随着药物浓度增加抑菌性增强。
枸杞叶酸性多糖Ⅰ和酸性多糖Ⅱ的抗肿瘤活性实验
一．实验材料
人胃癌细胞( sgc) 购于中国上海中科院细胞所；1640培养基（索莱宝公司），胎牛血清（四季青公司），MTT（Sigma公司），枸杞叶酸性多糖Ⅰ（酸性多糖含量82.2%），枸杞叶酸性多糖Ⅱ（酸性多糖含量84.6%），CO2细胞培养箱（Thermo），倒置显微镜（ZEISS），酶标检测仪（RT-2100C，美国Rayto）。
二．实验方法
1. 人胃癌细胞( sgc)的培养
将人胃癌细胞( sgc)采用1640培养基在5% CO2、37℃细胞培养箱培养，细胞呈贴壁生长，用0. 25% 的胰酶消化传代，用于实验的细胞均处于对数生长期。
2. 肿瘤细胞的生长抑制作用
将对数生长期的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后配制成密度为1×104个/mL的细胞悬液接种于96孔板，每孔加200μL。然后将平板置37℃、5%CO2湿度培养箱中24h后，于24、48、72h分别加入各个细胞样品对应的枸杞叶酸性多糖Ⅰ及枸杞叶酸性多糖Ⅱ(50、100、200、400μg/mL)的培养基，每个样本质量浓度设定平行的6个孔，对照组加不含枸杞叶酸性多糖的培养液200μL，再放入培养箱中孵育。每孔加入用按5mg/mL新鲜配制的MTT溶液50μL，孵育4h，使MTT还原为甲瓒，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时去除上清液，每孔加二甲基亚砜200μL，当平板摇床摇匀后，再使用酶标仪测定光密度值( 检测波长570nm)，以溶剂对照处理细胞为对照组，按公式计算白及多糖对细胞的抑制率。
抑制率= (1－实验组/空白组)×100%。
表2 枸杞叶酸性多糖Ⅰ和酸性多糖Ⅱ对sgc细胞的抑制作用（`x ± s，n = 6）
肿瘤抑制实验结果显示，枸杞叶酸性多糖Ⅰ和酸性多糖Ⅱ对人胃癌细胞（sgc）均有较好的抑制效果，枸杞叶酸性多糖Ⅱ对sgc细胞的抑制效果优于枸杞叶酸性多糖Ⅰ，当枸杞叶酸性多糖Ⅱ剂量达到400μmol·ml-1时，其对sgc细胞的抑制率高达89.8%。
从上述资料可以看出，本发明制备的枸杞叶低聚糖具有较好的抗菌作用，具备开发为抗菌类药物的潜力及实际推广价值；枸杞叶酸性多糖Ⅰ及枸杞叶酸性多糖Ⅱ，尤其是枸杞叶酸性多糖Ⅱ具有较好的对人胃癌细胞（sgc）生长的抑制作用，可以作为抗肿瘤药物进行开发，具有较好的实际应用价值。对枸杞叶低聚糖及酸性多糖的开发不仅拓宽了枸杞叶的应用前景，更是紧随时代步伐对中医药的创造性贡献，是医药上的巨大创新。