本发明涉及一种从镰形棘豆中分离制备5种具有抗炎活性化合物的方法。
背景技术：
：藏药镰形棘豆(OxytropisfalcateBunge)(藏药名为莪达夏)是豆科(Leguminosae)棘豆属(OxytropisD.C.)多年生草本植物。生长在2700～4300m的河滩、沙地、山坡、草甸，主要产于青藏高原。据《晶珠本草》记载，镰形棘豆具有愈合疮口、利便、防止骨刺产生、治病痛、除毒、止血之功效，并能清毒、治疗炭疽病、麻风病及流感、扁桃体炎。临床研究证明，镰形棘豆对于预防、治疗流行性感冒及慢性气管炎有独特疗效。众所周知，由于植物中化合物种类众多且含量不一，从植物中直接大量获得有实用价值的高纯度化合物是极为困难的，尤其当需要从中同时提取出多个目标化合物时，则更为艰难。因此目前，尽管已知镰形棘豆中包含多种化合物，却并没有以其为原料，同时得到多种高纯度活性化合物的报道。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种从镰形棘豆中分离制备5种具有抗炎活性化合物的方法，所述5种具有抗炎活性的化合物为乔松素、4-羟基-2甲氧基查耳酮、7-羟基二氢黄酮、2,4-二羟基-二氢查尔酮和2,4-二羟基-查尔酮，包括以下步骤：(1)取镰形棘豆总黄酮提取物，依次用石油醚和乙酸乙酯提取，取乙酸乙酯部位；(2)取乙酸乙酯部位干燥粉末，树脂纯化，甲醇洗脱，取洗脱物，干燥，得纯化物；(3)将纯化物用制备色谱分离，得到高纯度的乔松素、4-羟基-2甲氧基查耳酮、7-羟基二氢黄酮、2,4-二羟基-二氢查尔酮和2,4-二羟基-查尔酮；色谱条件如下：检测波长：210～380nm；色谱柱：C18或C8色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为水；梯度洗脱条件为：0～10min，50％A→60％A；10～40min，60％A→90％A。进一步地，所述色谱柱为C18色谱柱。进一步地，所述色谱条件的柱温为20～30℃。进一步地，所述树脂为微孔树脂或是大孔树脂进一步地，所述色谱条件的流速为10～100mL/min。进一步地，所述检测波长为360nm。进一步地，所述镰形棘豆总黄酮提取物是通过下述方法制备得到的：(1)取镰形棘豆，加入浓度为70％-80％醇类溶剂，微波提取得提取液，所述醇类溶剂与药材的体积质量比为10～35:1mL/g；(2)浓缩提取液，陶瓷膜滤过，有机膜纯化，取滤液，干燥即得。进一步地，所述醇类溶剂为浓度75％的乙醇，微波提取的功率为731W，提取时间为26分钟，乙醇与药材的体积质量比为26:1。进一步地，所述甲醇洗脱为用2～10倍柱体积的80％甲醇溶液洗脱。本发明还提供了乔松素、4-羟基-2甲氧基查耳酮、7-羟基二氢黄酮、2,4-二羟基-二氢查尔酮或2,4-二羟基-查尔酮在制备抗炎药物中的应用。本发明以镰形棘豆为原料，分离制备得到了乔松素、4-羟基-2甲氧基查耳酮、7-羟基二氢黄酮、2,4-二羟基-二氢查尔酮和2,4-二羟基-查尔酮，产品纯度均大于98％。该方法制备量大，产品纯度高，适合于工业应用。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为分离制备色谱图，得到化合物为乔松素(A)、4-羟基-2甲氧基查耳酮(B)、7-羟基二氢黄酮(C)、2,4-二羟基-二氢查尔酮(D)、2,4-二羟基-查尔酮(E)。具体实施方式镰形棘豆于2015年8月采自青海省海北州，经中国科学院西北高原生物研究所孙菁副研究员鉴定；芦丁标准品购自中国药品检定所(批号：100080-200707，含量为90.5％，)，乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。自制超纯水。微波提取仪(RWBC，南京苏恩瑞公司)METTLERTOLEDOPL203和XS204电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TU-1901型紫外可见分光光度计。色谱甲醇(山东禹王公司)；制备色谱仪(江苏汉邦科技有限公司)，陶瓷膜分离设备(合肥世杰膜有限公司)；有机膜分离设备(合肥世杰膜有限公司)，石油醚、乙酸乙酯为天津百世公司。料液比的单位为ml/g。实施例11.镰形棘豆提取物的制备制备方法：1)微波提取：微波提取功率为731w，提取时间为26min，液料比为26，75％乙醇提取。2)提取液浓缩。3)陶瓷膜过滤除杂：0.1um陶瓷膜，压力3MPa，流速50ml每分钟，除去细渣子、泥土等杂质，回收透过测溶液。4)有机膜分离纯化：采用分子量为2000的分子量有机膜进行纯化，压力为1MPa，流速50ml每分钟，收集透过测溶液。5)干燥微波干燥、冷冻干燥、喷雾干燥。2.萃取：将所述棘豆提取物浸膏用其质量10倍的去离子水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位；将所述乙酸乙酯部位干燥至恒重后，得到乙酸乙酯部位干燥粉末。3.除杂将所述乙酸乙酯部位干燥粉末用其质量的30倍的去离子水溶解后，过滤得到滤液A,该滤液注入微孔树脂分离，并用10倍柱体积的体积分数为80％的甲醇溶液洗脱，收集洗脱物。该洗脱物经冷冻干燥后，即得棘豆中抗炎活性成分。5.精制所述冷冻干燥样品用质量10倍甲醇溶解，经0.45um微孔膜过滤后注入到具有制备色谱装置中，0-10min，50-60％甲醇，10-40min60％-90％甲醇洗脱、在线紫外检测，即得符合化学对照品要求且纯度＞98％的化合物，产量约为70％。结果如图1所示。化合物为乔松素(A)、4-羟基-2甲氧基查耳酮(B)、7-羟基二氢黄酮(C)、2,4-二羟基-二氢查尔酮(D)、2,4-二羟基-查尔酮(E)(标志性成分)。实施例2化合物的抗炎活性对化合物乔松素、4-羟基-2甲氧基查耳酮4’-hydroxy-2’-methoxychalcone、7-羟基二氢黄酮、2,4-二羟基-二氢查尔酮、2,4-二羟基-查尔酮进行抗炎实验，5种化合物具有较好的抗炎活性。1细胞毒性研究RAW264.7细胞的毒性测定，MTT法。结果表1～5所示。表1表2表3表4表52培养巨噬细胞RAW264.7，分别检测TNF-α，NO，PEG2的指标，结果如表6-8所示，检测方法见下述文献：1张磬方，王强松，崔元璐，痹祺胶囊提取物对RAW264.7细胞模型的抗炎作用，中成药，2014，36(1)：26-30.2汪娟，蒋维，王毅，降香中黄酮类化合物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞抗炎作用研究，细胞与分子免疫学杂志，2013,29(7)：681-684.3石孟琼，覃惠林，张永峰，刘英，邓为，杨文雁，等，木瓜三萜对脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症模型细胞因子的影响，中药药理与临床，2016,32(3)：76-80.4罗福玲，赵恒光，李洪忠，万敬员，周岐新，粉防己碱对脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症模型细胞因子的作用，中草药，2011,42(3):542-545.表6LPS诱导细胞PEG2含量变化浓度(uM)PEG2(pg/ml)空白1633.38LPS3345.28乔松素602639.25乔松素302760.13乔松素152962.624-羟基-2甲氧基查耳酮2.52829.314-羟基-2甲氧基查耳酮1.252828.114-羟基-2甲氧基查耳酮0.6252972.927-羟基二氢黄酮602561.097-羟基二氢黄酮302842.097-羟基二氢黄酮153146.892,4-二羟基-查尔酮12356.532,4-二羟基-查尔酮0.52970.72,4-二羟基-查尔酮0.253167.522,4-二羟基-二氢查尔酮202712.242,4-二羟基-二氢查尔酮102829.562,4-二羟基-二氢查尔酮53107.04表7NO含量浓度(uM)PEG2(umol/L)空白1.93LPS6.03乔松素603.3乔松素304.05乔松素154.54-羟基-2甲氧基查耳酮2.53.564-羟基-2甲氧基查耳酮1.254.294-羟基-2甲氧基查耳酮0.6255.047-羟基二氢黄酮603.587-羟基二氢黄酮304.647-羟基二氢黄酮155.652,4-二羟基-查尔酮12.82,4-二羟基-查尔酮0.54.812,4-二羟基-查尔酮0.255.392,4-二羟基-二氢查尔酮203.792,4-二羟基-二氢查尔酮104.522,4-二羟基-二氢查尔酮55.32表8TNF-α含量变化浓度(uM)TNF-α(pg/ml)空白52.37LPS207.45乔松素60122.11乔松素30129.06乔松素15151.164-羟基-2甲氧基查耳酮2.5138.994-羟基-2甲氧基查耳酮1.2510.484-羟基-2甲氧基查耳酮0.625161.427-羟基二氢黄酮60113.787-羟基二氢黄酮30148.077-羟基二氢黄酮15162.272,4-二羟基-查尔酮195.092,4-二羟基-查尔酮0.5160.242,4-二羟基-查尔酮0.25183.952,4-二羟基-二氢查尔酮20134.612,4-二羟基-二氢查尔酮10138.242,4-二羟基-二氢查尔酮5169.66镰形棘豆具有抗炎作用，至目前为止，少有文献报道镰形棘豆中活性化合物分离制备，本发明方法采用制备色谱仪对镰形棘豆中抗炎活性化合物进行分离制备，并得到纯度较高的化合物，并进一步对化合物进行细胞活性实验，分离得到的化合物主要通过抑制炎症因子NO、TNF-α等释放，直接发挥抑制作用，从而表现出抗炎作用。本发明方法简便实用，为镰形棘豆的抗炎物质基础提供理论依据，同时为药品生产也提供了数据支持。当前第1页1 2 3